55 resultados para Inositol Phosphates -- antagonists
em Université de Montréal, Canada
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Le myo-inositol (MI) est un solut organique impliqu dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est galement un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont t identifis. Deux dentre eux sont coupls au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisime est coupl au transport de protons (HMIT). Lobjectif de cette tude a t la caractrisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de lintestin de rat ainsi quaprs expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de lARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement prsent dans la mdullaire alors que SMIT2 est principalement localis dans le cortex. Ces rsultats ont t confirms par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirig contre SMIT2. Grce linhibition slective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons dmontr que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourn proximal avec un Km de 57 14 M. Pour ce qui est de lintestin, des tudes de transport de MI radioactif ont dmontr une absence de transport de MI chez le lapin alors que lintestin de rat prsente un transport de MI trs actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que lintestin de lapin ne semble pas possder les transporteurs de MI ncessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI prsent au niveau du ple apical des entrocytes intestinaux chez le rat. Il est charg du prlvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 40 M. Les analyses fonctionnelles excutes sur SMIT2 de rat en lectrophysiologie aprs expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mmes rsultats que pour les BBMv de rein de lapin et dintestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 prsente une grande affinit pour le MI (270 19 M) et le DCI (310 60 M) et aucune affinit pour le L-fucose. Il est ii galement trs sensible la phlorizine (16 7 M). Une seule exception persiste : la constante daffinit pour le glucose dans les BBMv dintestin de rat est 40 fois plus petite que celle observe sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons galement test la capacit de certains transporteurs de sucre prsents la surface des membranes apicales des entrocytes prlever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transport, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqus dans son transport. Finalement, lefflux de MI partir du ple basolatral des entrocytes nest pas effectu par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprim dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.
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Les complications vasculaires telles que laugmentation de la contractilit et la prolifration cellulaire sont les complications les plus communes observes dans le diabte et lhyperglycmie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gq joue un rle important dans la rgulation du tonus vasculaire et laltration de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observes dans les cas de diabte et dhyperglycmie. Il a t observ que les taux et lactivit des protines kinase C (PKC) et du diacylglycrol (DAG) sont augments dans ces conditions. Cependant, aucune tude na dmontr limplication de Gq/11 et des PLC, molcules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs tudes rvlent que laugmentation des taux et de lactivit des PKC et du DAG induite par lhyperglycmie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribue laugmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que langiotensine II et lendothline-1, augments dans les conditions de diabte/dhyperglycmie, peuvent contribuer laugmentation du stress oxydatif observe. Le travail prsent dans cette thse avait pour but dexaminer les effets de lhyperglycmie sur les niveaux dexpression protique de Gq/11 et de ses molcules associes, ainsi que dtudier le mcanisme molculaire par lequel lhyperglycmie module la voie de signalisation de Gq dans les CMLV. Dans la premire tude, nous avons examin si lhyperglycmie pouvait moduler lexpression des protines Gq, G11, PLC1 et PLC2. Le prtraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente lexpression des protines Gq, G11, PLC-1 et PLC-2 en comparaison avec les CMLV tmoins. Le traitement avec des antagonistes aux rcepteurs AT1 de lAng II, et ETA/ETB de lET-1, attnue la hausse de Gq, de G11, de PLC1 et de PLC2 induite par lhyperglycmie. De plus, la formation dIP3 stimule par lET-1 tait plus leve dans les CMLV expose 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec lAng II et lET-1 augmente galement les niveaux dexpression des protines G q/11 et PLC. Cette augmentation de lexpression est restaure au niveau des CMLV tmoins par les antagonistes des rcepteurs AT1, ETA et ETB. Ces rsultats suggrent que laugmentation de lexpression des protines Gq/11 et PLC dans les CMLV induite par lhyperglycmie est attribue lactivation des rcepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde tude, nous avons examin limplication du stress oxydatif dans laugmentation des niveaux dexpression des protines Gq/11 et PLC et de leur signalisation induite par lhyperglycmie. Nous avons galement dtermin le mcanisme responsable de laugmentation du stress oxydatif induite par lhyperglycmie. Laugmentation de lexpression des protines Gq/11 et PLC des CMLV A10 exposes 26 mM de glucose est revenue au niveau basal aprs un traitement avec lantioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chlateur du peroxyde dhydrogne, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par lacide urique, des chlateurs du peroxynitrite. De plus, laugmentation de la formation dIP3 stimule par lET-1 dans les CMLV exposes 26 mM de glucose est revenue au niveau basal aprs un traitement avec le DPI et la catalase. Ces rsultats suggrent que laugmentation du stress oxydatif induite par lhyperglycmie contribue laugmentation de lexpression des protines Gq/11 et les molcules associes la voie de signalisation de Gq. De plus, laugmentation de la production danion superoxyde (O2-), de lactivit de la NADPH oxydase et de lexpression des protines p22(phox) et p47(phox) induite par lhyperglycmie est revenue un niveau basal aprs un traitement avec les antagonistes des rcepteurs AT1, ETA et ETB. Ces rsultats suggrent que lhyperglycmie augmente les niveaux endognes de lAng II et de lET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation dO2- et de H2O2 et peut contribuer laugmentation des niveaux de Gq/11 et de leurs molcules de signalisation. Puisquil a t observ que lhyperglycmie transactive les rcepteurs aux facteurs de croissance tels que le rcepteur au facteur de croissance pidermique (EGF-R) et le rcepteur au facteur de croissance driv des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris dexaminer, dans la troisime tude, limplication dEGF-R et de PDGF-R dans laugmentation des niveaux de Gq/11, de PLC et de leur signalisation induite par lhyperglycmie. Laugmentation des niveaux dexpression des protines Gq, G11, PLC-1 et PLC-2 induite par lhyperglycmie est revenue au niveau basal aprs un traitement avec les inhibiteurs dEGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par linhibiteur de c-Src, PP2. Laugmentation de la phosphorylation dEGF-R et de PDGF-R induite par lhyperglycmie a t abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, laugmentation des niveaux de Gq/11, et de PLC induite par lhyperglycmie est attnue par linhibiteur des MAPK, le PD98059, et par linhibiteur dAKT, le wortmannin. Laugmentation de la phosphorylation dERK et dAKT tait galement attnue par AG1478 et AG1295. Ces rsultats suggrent que la transactivation des rcepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer laugmentation des niveaux de G q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les tudes prsentes dans cette thse indiquent que lhyperglycmie augmente les niveaux de Gq/11 et de PLC. Nous avons mis des vidences qui dmontrent que laugmentation endogne de lAng II et de lET-1 par lhyperglycmie peut contribuer laugmentation de la production dO2- et de H2O2 rsultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait tre responsable de laugmentation de Gq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions dhyperglycmie. Finalement, nous avons dmontr que la transactivation des rcepteurs aux facteurs de croissance induite par lhyperglycmie peut tre responsable de laugmentation de Gq/11/PLC et les molcules associes la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabte et dhyperglycmie.
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Thse numrise par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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L'objectif de cette tude est d'apprendre crer de nouveaux matriaux molculaires par design. l'heure actuelle, il n'existe aucune mthode gnrale pour la prdiction des structures et des proprits, mais des progrs importants ont t accomplis, en particulier dans la fabrication de matriaux molculaires ordonns tels que des cristaux. En ces matriaux, l'organisation peut tre contrle efficacement par la stratgie de la tectonique molculaire. Cette approche utilise des molcules appeles tectons, qui peuvent sassocier de manire dirige par des interactions non covalentes prvisibles. De cette faon, la position de chaque molcule par rapport ses voisins peut tre programme avec un degr lev de fiabilit pour crer des cristaux et d'autres matriaux organiss avec des caractristiques et des proprits structurelles souhaitables. Le travail que nous allons dcrire est ax sur l'utilisation de l'association des cations bis(aminidinium) avec des carboxylates, sulfonates, phosphonates et phosphates, afin de crer des rseaux molculaires prvisibles. Ces rseaux promettent d'tre particulirement robuste, car ils sont maintenus ensemble par de multiples liaisons hydrogne assistes par des interactions lectrostatiques.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Lostoarthrose (OA) est une maladie articulaire invalidante caractrise par la perte de lintgrit du cartilage articulaire. Les recherches tentent de comprendre les mcanismes molculaires de la maladie afin de trouver des inhibiteurs efficaces pouvant prvenir la dgradation du cartilage articulaire. Les BMPs (bone morphogenic proteins) jouent un rle dans le processus pathophysiologique de cette maladie. Cette tude cible le rle dun antagoniste des BMPs, le gremlin. Nous avons tudi la rgulation de lexpression de gremlin par le clonage et la caractrisation de son promoteur et en dterminant si gremlin pouvait jouer un rle autre quantagoniste des BMP, en affectant lexpression dautres gnes par lactivation dune cascade de signalisation dans la cellule. Les rsultats ont identifi une rgion importante dans le promoteur de gremlin qui affecte son activit basale et induite, et ont montr que le gremlin ne pouvait pas affecter lexpression gnique et lactivation de signalisation intracellulaire indpendamment des BMPs. Cette tude dmontre que le rle de gremlin dans lOA en est un essentiellement dantagoniste des BMPs.
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La mort cellulaire programme (PCD pour Programmed Cell Death) est un processus essentiel aux cellules. Le PCD a dabord t caractris dans le dveloppement cellulaire et peut tre divis en plusieurs groupes selon les caractristiques observes. Lapoptose, un sous-groupe du PCD, est caractris par plusieurs distinctions morphologiques et signaltiques attribu tout dabord aux organismes complexes pour son rle dans le dveloppement et dans le maintien de lintgrit tissulaire. Depuis la dernire dcennie, de nombreuses tudes font tat de lexistence dun programme apoptotique dans des organismes unicellulaires comme les levures. Ce programme apoptotique a surtout t tudi chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe et partage certaines caractristiques avec lapoptose des mammifres. Par contre, lapoptose associ aux levures est distinct certains gards entre autre par labsence de certains homologues prsents chez les mammifres. Lintrt au niveau de ltude du phnomne apoptotique chez les levures est sans cesse grandissant par la facilit avec laquelle les levures peuvent tre utilises comme systme modle. Lapoptose peut tre induit dans les cellules de diffrentes faons en rponse des stimuli internes ou externes. Laccumulation de protines mal replies au niveau du rticulum endoplasmique (RE) causant un stress est un inducteur bien caractris de la voie apoptotique. La signalisation de lapoptose dans un cas de stress au RE fait appel aux transducteurs des signaux de la voie du UPR ( Unfolded Protein Response). Rcemment, il a t montr que la calnexine, une chaperone transmembranaire du RE connue et caractrise surtout pour ses fonctions daide au repliement des protines et au contrle de qualit, joue un rle dans la transduction du signal apoptotique en rponse au stress du RE chez mammifres. Le rle de la calnexine dans ce cas consiste principalement en lchafaudage pour le clivage par la caspase 8 de la protine apoptotique Bap31. Nous avons tout dabord dmontr que le stress du RE et que la dficience en inositol, un prcurseur essentiel de nombreuses molcules signaltiques, sont deux inducteurs de lapoptose chez la levure S. pombe. Ces deux voies semblent induire lapoptose par deux voies distinctes puisque seule la voie de la dficience en inositol induit lapoptose de faon dpendante la mtacaspase Pca1p. La calnexine, essentielle la viabilit chez la levure S. pombe, est implique dans ces deux phnomnes apoptotiques. Lapoptose induit par le stress du RE ncessite une version de la calnexine ancre la membrane du RE pour tre optimal. De faon oppose, lapoptose induit par une dficience en inositol ncessite la prsence de la queue cytosolique ancre la membrane de la calnexine pour tre retard. Ces deux actions diffrentes imputables une mme protine laisse croire une double fonction pro et anti-apoptotique de celle-ci. Suite la dcouverte de lexistence dun clivage endogne de la calnexine en situation normale de croissance, un modle a t labor expliquant les rles distincts de la calnexine dans ces deux voies apoptotiques. Ce modle fait tat dun rle associ au clivage de la calnexine dans lapoptose.
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Le systme endothline (ET) est activ en condition dhypertension pulmonaire (HTP). Lefficacit des antagonistes des rcepteurs lET a clairement t dmontre et a mene lapprobation clinique de tels antagonistes dans le traitement de lhypertension artrielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe prsentement un important dbat opposant lutilisation dun antagoniste slectif des rcepteur ETA lutilisation dun antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le systme ET est activ et contribue lHTAP, les modifications locales de ce systme induites par la pathologie, particulirement au niveau des artres de rsistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, limpact de ces modifications sur la rponse pharmacologique aux divers antagonistes des rcepteurs lET (slectifs versus double) est dune importance capitale. Ainsi, le but de la premire tude de cette thse tait dvaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du systme ET au niveau des artres de rsistance pulmonaires induites par lHTAP. Dans cette tude, nous avons dmontr quen condition contrle lantagoniste slectif ETA et lantagoniste double nont eu aucun effet sur la rponse vasoconstrictrice lET-1. Toutefois, en condition dHTAP, les antagonistes slectif et double ont tous deux t en mesure de rduire la vasoconstriction pulmonaire induite par lET-1. Une diminution importante de lexpression gnique du rcepteur ETB pourrait tre lorigine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure comprhension des rles jous par les rcepteurs ETA et ETB au niveau des artres de rsistance pulmonaires pourrait permettre loptimisation des traitements de lHTAP. Ainsi, le but de la deuxime tude tait dvaluer les effets dun traitement antisens ex vivo dirig contre lARNm des rcepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artres de rsistance pulmonaires induite par lET-1. Dans cette tude, nous avons dmontr dans un premier temps que les rcepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimres au niveau des artres de rsistance pulmonaires. De plus, nous avons observ quune rduction de lexpression protique du R-ETA entranait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dpendante suggrant ainsi quen condition contrle, le rcepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du rcepteur ETB. Les effets dltres de lET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques tudes ont port leur attention sur limplication de lET-3 dans lHTAP. Ainsi, le but de la troisime tude tait dvaluer limplication potentielle de lET-3 dans lHTAP. Dans cette tude, nous avons dmontr quil tait ncessaire en condition contrle de bloquer simultanment les rcepteurs ETA et ETB afin de rduire la rponse vasoconstrictrice pulmonaire lET-3. En condition dHTAP, nous avons observ une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques dET-3 ainsi quune modification du profil pharmacologique des antagonistes des rcepteurs lET. En effet, lutilisation de lantagoniste slectif ETA ou de lantagoniste double tait dans les deux cas en mesure de rduire la vasoconstriction pulmonaire lET-3. Les rsultats de ces trois tudes suggrent quil est prfrable dutiliser un antagoniste double dans le traitement de lHTAP. En effet, (1) en condition dHTAP, lutilisation dun antagoniste double est aussi efficace que lutilisation dun antagoniste slectif ETA; (2) les rcepteurs ETA et ETB peuvent former des dimres au niveau des artres de rsistance pulmonaires et (3) le rcepteur ETB joue un rle prdominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanment les rcepteurs ETA et ETB afin dinhiber la rponse vasoconstrictrice induite par lET. Mots-cls: endothline-1, endothline-3, artre de rsistance pulmonaire, rcepteur vasculaire, antagoniste des rcepteurs lET, dimrisation, phosphorothioate, hypertension artrielle pulmonaire
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Contribuant la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de lhypertension, le remodelage vasculaire est associ une altration de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifration, taille, etc.). Or la prolifration des CMLV est augmente par les peptides vasoactifs tels que langiotensine II (AngII) et lendothline-1 (ET-1). Ces peptides tant surexprims lors de lhypertension, cette tude fut entreprise pour dterminer leur contribution endogne ainsi que celles du facteur de croissance pidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance driv des plaquettes (PDGF) la prolifration accrue des CMLV et aux mcanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR gs de 12 semaines ont t utilises pour cette tude. La prolifration cellulaire fut dtermine par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du rcepteur de EGF fut dtermine par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, compares celles de WKY, ont montr une prolifration accrue qui fut attnue par le losartan, un antagoniste du rcepteur AT1 de lAngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des rcepteurs ETA et ETB de lET-1. La prolifration accrue des CMLV de SHR fut ramene celle des WKY par les inhibiteurs des rcepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du rcepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR compare celle des WKY, fut attnue par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et lAG-1478, mais ne fut pas attnue par lAG-1295 et lAG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut attnue par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des rcepteurs aux facteurs de croissance. Paralllement, le rle de la transactivation de EGF-R dans la prolifration accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examin dans les CMLV A-10. Laugmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifration et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramene au niveau contrle par AG-1478. Ces donnes suggrent que les peptides vasoactifs endognes induisent la prolifration accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases rsultant de la transactivation de EGF-R.
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Nous avons tudi les relations anatomiques entre les systmes de neurotransmission substance P (SP) et srotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) dans le noyau du raph dorsal (NRD) du rongeur, afin de mieux comprendre les interactions entre ces systmes durant la rgulation de lhumeur. Le NRD reoit une innervation SP provenant de lhabenula, et le blocage pharmacologique des rcepteurs neurokinine-1 (rNK1) de la SP aurait des effets antidpresseurs. Chez le rongeur, le traitement par les antagonistes des rNK1 saccompagne dune dsensibilisation des autorcepteurs 5-HT1A de la 5-HT et dune hausse de lactivit des neurones 5-HT dans le NRD, suggrant des interactions locales entre ces deux systmes. Dans un premier temps, nous avons dmontr par doubles marquages immunocytochimiques en microscopies optique, confocale et lectronique, la prsence du rNK1 dans une sous-population de neurones 5-HT du NRD caudal. Lors de lanalyse en microscopie lectronique, nous avons pu constater que les rNK1 taient principalement cytoplasmiques dans les neurones 5-HT et membranaires sur les neurones non 5-HT du noyau. Grce dautres doubles marquages, nous avons aussi pu identifier les neurones non-5-HT porteurs de rNK1 comme tant GABAergiques. Nous avons ensuite combin limmunomarquage de la SP avec celui du rNK1, dans le but dexaminer les relations entre les terminaisons (varicosits *) axonales SP et les neurones 5-HT (pourvus de rNK1 cytoplasmiques du NRD caudal. En simple marquage de la SP, nous avons pu estimer 41% la frquence avec laquelle les terminaisons SP font synapse. Dans le matriel doublement marqu pour la SP et son rcepteur, les terminaisons SP ont t frquemment retrouves en contact direct ou proximit des dendrites munies de rNK1 cytoplasmiques, mais toujours loignes des dendrites rNK1 membranaires. Pour tester lhypothse dune internalisation soutenue des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT, nous avons ensuite examin la localisation subcellulaire du rcepteur chez le rat trait avec un antagoniste du rNK1, le RP67580. La densit du marquage des rNK1 a t mesure dans le cytoplasme et sur la membrane des deux types de dendrites (5-HT: rNK1 cytoplasmiques; non 5-HT: rNK1 membranaires). Une heure aprs une injection unique de lantagoniste, la distribution du rNK1 est apparue inchange dans les deux types de neurones (5-HT et non 5-HT). Par contre, aprs un traitement quotidien de 7 ou 21 jours avec lantagoniste, nous avons mesur une augmentation significative des densits cytoplasmique et membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans aucun changement dans les neurones non 5-HT. Ces traitements ont aussi augment lexpression du gne rNK1 dans le NRD. Enfin, nous avons mesur une hausse de la densit membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans hausse de densit cytoplasmique, par suite dune lsion bilatrale de lhabenula. Ces rsultats confortent lhypothse dune activation et dune internalisation soutenues des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT du NRD caudal. Ils suggrent aussi que le trafic des rNK1 dans les neurones 5-HT du NRD reprsente un mcanisme cellulaire en contrle de lactivation du systme 5-HT par les affrences SP en provenance de lhabenula.
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Les mdiateurs lipidiques de linflammation dont le leucotrine B4 (LTB4) et le facteur dactivation plaquettaire (PAF) permettent la rgulation de la migration des neutrophiles polymorphonuclaires (PMNs) et lextravasation plasmatique au site inflammatoire. Afin de dterminer leurs rles dans la rgulation de la migration des PMNs au site inflammatoire, nous avons tudi leur effet potentiellement coopratif en utilisant une approche pharmacologique laide dantagonistes slectifs des rcepteurs du LTB4 et du PAF dans un modle dinflammation dermique chez le lapin. Les rsultats montrent un effet inhibiteur additif des antagonistes des deux mdiateurs lipidiques, lorsque utiliss de faon concomitante, sur la migration des neutrophiles induite par le LTB4, le PAF et aussi sur des mdiateurs non-chimiquement apparents comme le facteur ncrosant des tumeurs (TNF), ainsi que sur l'inhibition de lextravasation plasmatique induite par le leucotrine D4, suggrant un rle rgulateur des rcepteurs du LTB4 et du PAF dans la migration des PMNs au site inflammatoire. Nous avons dtermin le rle de ces mdiateurs dans la rgulation de la migration des PMNs en rponse une ischmie-reperfusion des membres inferieurs chez le lapin. Les rsultats appuient lhypothse selon laquelle le LTB4 et le PAF exercent un rle important dans laccumulation des PMNs au site inflammatoire. En effet ladministration concomitante des antagonistes des rcepteurs de ces deux mdiateurs lipidiques a rduit de faon significative la migration des PMNs aux poumons, intestins et foie. Nos rsultats contribuent lucider le rle du LTB4 et du PAF dans la rgulation de lextravasation des PMNs et du plasma au site inflammatoire.
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Les cellules gliales sont essentielles au fonctionnement du systme nerveux. Dans la rtine, les cellules gliales de Mller assurent la fois lhomostasie du tissu et la protection des neurones, notamment celle des cellules ganglionnaires de la rtine (CGRs). Lhypothse principale de la thse est que les cellules de Mller joueraient un rle primordial dans la survie neuronale tant au plan de la signalisation des neurotrophines/proneurotrophines par suite dune blessure que lors des mcanismes dexcitotoxicit. Contrairement au brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le nerve growth factor (NGF) nest pas en mesure dinduire la survie des CGRs aprs une section du nerf optique. Le premier objectif de la thse a donc t de localiser les rcepteurs p75NTR et TrkA du NGF dans la rtine adulte et dtablir leur fonction respective en utilisant des ligands peptidomimtiques agonistes ou antagonistes spcifiques pour chacun des rcepteurs. Nos rsultats ont dmontr que TrkA est surexprim par les CGRs aprs laxotomie, tandis que p75NTR est spcifiquement exprim par les cellules de Mller. Alors que NGF nest pas en mesure dinduire la survie des CGRs, lactivation spcifique de TrkA par des ligands peptidomimtique est nettement neuroprotectrice. De faon surprenante, le blocage slectif de p75NTR ou labsence de celui-ci protge les CGRs de la mort induite par laxotomie. De plus, la combinaison de NGF avec lantagoniste de p75NTR agit de faon synergique sur la survie des CGRS. Ces rsultats rvlent un nouveau mcanisme par lequel le rcepteur p75NTR exprim par les cellules gliales de Mller peut grandement influencer la survie neuronale. Ensuite, nous avons voulu dterminer leffet des proneurotrophines dans la rtine adulte. Nous avons dmontr que linjection de proNGF induit la mort des CGRs chez le rat et la souris par un mcanisme dpendant de p75NTR. Lexpression de p75NTR tant exclusive aux cellules de Mller, nous avons test lhypothse que le proNGF active une signalisation cellulaire non-autonome qui aboutit la mort des CGRs. En suivant cette ide, nous avons montr que le proNGF induit une forte expression du tumor necrosis factor (TNF) dans les cellules de Mller et que linhibition du TNF bloque la mort neuronale induite par le proNGF. Lutilisation de souris knock-out pour la protine p75NTR, son co-rcepteur sortiline, ou la protine adaptatrice NRAGE a permis de montrer que la production de TNF par les cellules gliales tait dpendante de ces protines. Le proNGF semble activer une signalisation cellulaire non-autonome qui cause la mort des neurones de faon dpendante du TNF in vivo. Lhypothse centrale de lexcitotoxicit est que la stimulation excessive des rcepteurs du glutamate sensibles au N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) est dommageable pour les neurones et contribue plusieurs maladies neurodgnratives. Les cellules gliales sont souponnes de contribuer la mort neuronale par excitotoxicit, mais leur rle prcis est encore mconnu. Le dernier objectif de ma thse tait dtablir le rle des cellules de Mller dans cette mort neuronale. Nos rsultats ont dmontr que linjection de NMDA induit une activation du nuclear factor B (NF-B) dans les cellules de Mller, mais pas dans les CGRs, et que lutilisation dinhibiteurs du NF-B empche la mort des CGRs. De plus, nous avons montr que les cellules de Mller en raction lactivation du NF-B produisent la protine TNF laquelle semble tre directement implique dans la mort des CGRs par excitotoxicit. Cette mort cellulaire se produit principalement par laugmentation la surface des neurones des rcepteurs AMPA permables au Ca2+, un phnomne dpendant du TNF. Ces donns rvlent un nouveau mcanisme cellululaire non-autonome par lequel les cellules gliales peuvent exacerber la mort neuronale lors de la mise en jeu de mcanismes excitotoxiques.
Resumo:
Lhexokinase (HK) est la premire enzyme du mtabolisme des hexoses et catalyse la raction qui permet aux hexoses dentrer dans le pool des hexoses phosphates et donc par le fait mme la glycolyse. Bien que le glucose soit son principal substrat, cette enzyme peut aussi phosphoryler le mannose et le fructose. Malgr son importance dans le mtabolisme primaire, lHK na jamais t purifie homognit sous forme native. Le but de ce travail tait donc de purifier une isoforme dHK partir de tubercule de Solanum tuberosum et par la suite de caractriser ses proprits cintiques. Bien avant que je commence mon travail, un groupe de recherche avait dj spar et partiellement purifi trois isoformes dHK de S. tuberosum. Un protocole dextraction tait donc disponible, mais lHK ainsi extraite tait peu stable do le besoin dy apporter certaines modifications. En y ajoutant certains inhibiteurs de protases ainsi quen modifiant les concentrations de certains lments, le tampon dextraction ainsi modifi a permis dobtenir un extrait dont lactivit HK tait stable pendant au moins 72h aprs lextraction, en empchant la dgradation. laide du tampon dextraction optimis et dune chromatographie sur colonne de butyl spharose, il a t possible de sparer 4 isoformes dHKs. Par la suite, une isoforme dHK (HK1) a t purifie lhomognit laide de 5 tapes de chromatographie supplmentaires. En plus de caractriser les proprits cintiques de cette enzyme, lanalyse de squenage par MS/MS a permis de lassocier au produit du gne StHK1 de Solanum tuberosum. Avec une activit spcifique de 10.2 U/mg de protine, il sagit de lHK purifie avec lactivit spcifique la plus leve jamais rapporte dun tissu vgtal.Lensemble des informations recueillies lors de la purification de HK1 a ensuite t utilise pour commencer la purification dune deuxime isoforme (HK3). Ce travail a permis de donner des lignes directrices pour la purification de cette isoforme et certains rsultats prliminaires sur sa caractrisation enzymatique.
