Altérations métaboliques et nature des acides gras : implication dans la différenciation des cellules régénératives du tissu adipeux

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques.

L’étude de l’interaction entre les chondrocytes et le collagène modifié par le 4-Hydroxynonénal : implication dans le développement de l’arthrose

OBJECTIF: Récemment, nous avons démontré que la modification du collagène type II (Col II) par le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmentée dans le cartilage arthrosique sans qu’on sache la signification de cette augmentation dans la pathogenèse de l’arthrose. L’objectif de cette étude vise à démontrer que cette modification affecte l’interaction chondrocytes/matrice extracellulaire (MEC) et en conséquence induit des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules. METHODES: Des plaques de culture ont été préalablement cotées avec du Col II puis traitées avec du HNE (0.1-2 mM) excepté le puits contrôle. Les chondrocytes ont été ensuite ensemencés puis incubés pendant 48 heures. La viabilité des cellules est évaluée par le test MTT. Le Western blot est utilisé pour mesurer l’expression des molécules d’adhésion (l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1), de la cyclooxygenase-2 (COX-2), du Col II ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. La RT-PCR en temps réel est utilisée pour mesurer l’expression de l’ARNm de l’ICAM-1, des intégrines α1β1, de la COX-2 et de la métalloprotéinases-13 (MMP-13). La détermination de l’expression de l’ICAM-1 à la surface des cellules est réalisée par cytométrie de flux. Des kits commerciaux ont servi pour mesurer le niveau de la MMP-13, de la prostaglandine E2 (PGE2), de l’activité de la caspase-8 et de la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. RESULTATS: La modification du Col II par 0.2 mM HNE induit significativement l’expression des molécules d’adhésion telles que l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1, de la MMP-13 sans avoir un effet sur la morphologie, la survie et le phénotype cellulaires. Nos résultats montrent aussi une forte augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK, d’ERK1/2 et de NF-κB-p65. Cependant, la modification du Col II par 2 mM HNE affecte la morphologie et la viabilité cellulaires et induit l’activité de la caspase-8. Elle inhibe fortement l’expression des integrines α1β1 et du Col II ainsi que la phosphorylation de l’ERK1/2 et de NF-κB-p65, mais par contre, induit significativement la production de la COX-2 et son produit la PGE2 ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK. Fait intéressant, le prétraitement des complexes HNE/Col II par 0.1 mM de carnosine empêche les changements phénotypiques et fonctionnels des chondrocytes. CONCLUSION : Ces nouveaux résultats suggèrent le rôle important de la modification du Col II par le HNE dans l’arthrose, en affectant le phénotype et le fonctionnement cellulaires des chondrocytes. La carnosine, par sa capacité de neutraliser le HNE, a révélé d’être un agent promoteur dans le traitement de l’arthrose.

Le remodelage cardiaque lors de la gestation chez la rate : implication du récepteur aux minéralocorticoïdes et altérations par un supplément sodique

La grossesse induit de profonds changements hémodynamiques et métaboliques de l’organisme maternel qui ont des conséquences sur le cœur. L’adaptation du cœur à cette condition physiologique nécessite un remodelage de sa structure et par conséquent des ajustements de sa fonction. Les mécanismes responsables de ces adaptations sont en grande partie inconnus. Cependant, ces connaissances sont essentielles pour la compréhension des complications cardiovasculaires, telle que l’hypertension gestationnelle (HG), qui constituent un risque pour la santé de la mère et du fœtus. Afin de caractériser les adaptations du cœur lors de la grossesse, l’originalité de notre approche expérimentale consistait à étudier le remodelage à l’échelle des cardiomyocytes du ventricule gauche. Ainsi, notre premier objectif était de déterminer les modifications structurales et fonctionnelles des cardiomyocytes chez la rate en vue d’identifier les altérations lors de l’HG. Chez les rates gestantes, le remodelage structural des cardiomyocytes se caractérise par une hypertrophie cellulaire avec une augmentation proportionnelle des dimensions. L’HG a été induite par un supplément sodique (0.9% NaCl) dans la diète. L’inadaptation structurale lors de l’HG se traduit par une diminution du volume cellulaire. L’étude des modifications fonctionnelles a révélé que lors de la gestation le fonctionnement contractile des cellules est dépendant de l’adaptation du métabolisme maternel. En effet, les substrats énergétiques, lactate et pyruvate, induisent une augmentation de la contractilité des cardiomyocytes. Cet effet est plus faible dans les cellules des rates hypertendues, ce qui suggère des anomalies du couplage excitation-contraction, dans lequel les courants calciques de type L (ICa-L) jouent un rôle important. Paradoxalement, le lactate et le pyruvate ont induit une augmentation de la densité des courants ICa-L seulement chez les rates hypertendues. Le récepteur aux minéralocorticoïdes (RM) est connu pour son implication dans le remodelage structuro-fonctionnel du cœur dans les conditions pathologiques mais pas dans celui induit par la grossesse. Notre deuxième objectif était donc de déterminer le rôle du RM dans l’adaptation de la morphologie et de la contractilité des cardiomyocytes. Des rates gestantes ont été traitées avec le canrénoate de potassium (20 mg/kg/jr), un antagoniste des RM. L’inhibition des RM pendant la gestation empêche l’hypertrophie cellulaire. De plus, l’inhibition des RM bloque l’effet du lactate et du pyruvate sur la contractilité. Chez la femme, la grossesse est associée à des changements des propriétés électriques du cœur. Sur l’électrocardiogramme, l’intervalle QTc est plus long, témoignant de la prolongation de la repolarisation. Les mécanismes régulant cette adaptation restent encore inconnus. Ainsi, notre troisième objectif était de déterminer le rôle du RM dans l’adaptation de la repolarisation. Chez la rate gestante, l’intervalle QTc est prolongé ce qui est corroboré par la diminution des courants potassiques Ito et IK1. L’inhibition des RM pendant la gestation empêche la prolongation de l’intervalle QTc et la diminution des courants Ito. Les travaux exposés dans cette thèse apportent une vision plus précise du remodelage cardiaque induit par la grossesse, qui est permise par l’étude à l’échelle cellulaire. Nos résultats montrent que lors de la gestation et de l’HG les cardiomyocytes subissent des remodelages morphologiques contrastés. Notre étude a aussi révélé que lors de la gestation, la fonction contractile est tributaire des adaptations métaboliques et que cette relation est altérée lors de l’HG. Nos travaux montrent que la régulation de ces adaptations gestationnelles fait intervenir le RM au niveau de la morphologie, de la relation métabolisme/fonctionnement contractile et de la repolarisation. En faisant avancer les connaissances sur l’hypertrophie de la grossesse, ces travaux vont permettre d’améliorer la compréhension des complications cardiovasculaires gestationnelles.

Implication de la voie ERK3/4-MK5 dans la phase G2/M du cycle cellulaire

La division cellulaire est influencée par les différents stimuli provenant de l’extérieur ou de l’intérieur de la cellule. Plusieurs réseaux enzymatiques élaborés au cours de l’évolution relayent l’information générée par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrêmement importants au sein de la cellule. Chez l’humain, 14 MAP kinases sont regroupées en sept voies distinctes intervenant dans le contrôle d’une myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connaît que très peu de choses concernant leurs fonctions et régulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisqu’elles ont des particularités structurales et des modes de régulation qui diffèrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a démontré que l’activité de ERK3 est régulée par le système ubiquitine-protéasome et qu’elle pourrait avoir un rôle à jouer dans le contrôle de la différenciation et la prolifération cellulaire. La première étude présentée décrit la régulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observé que ERK3 est hyperphosphorylée et s’accumule spécifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectrométrie de masse ont mené à l’identification de quatre sites de phosphorylation situés à l’extrémité du domaine C-terminal. Nous avons pu démontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les déphosphorylent. Finalement, nous démontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au début de mes études doctorales, la kinase MK5 fut identifiée comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a très peu de fonctions connues. Des données dans la littérature suggèrent qu’elle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a récemment été identifié comme inducteur de la sénescence induite par l’oncogène Ras. Dans la deuxième étude, nous décrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrôle du cycle cellulaire. Nous démontrons par des expériences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit l’entrée en mitose suite à un arrêt de la réplication. Cette fonction est dépendante de l’activité enzymatique de MK5 qui régule indirectement l’activité de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifié Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime l’effet de MK5 sur l’entrée en mitose. En conclusion, nos résultats décrivent un nouveau mécanisme de régulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi qu’une nouvelle fonction pour MK5 dans le contrôle de l’entrée en mitose en réponse à des stress de la réplication. Ces résultats démontrent pour la première fois l’implication de ces protéines au cours de la transition G2/M. Nos travaux établissent de nouvelles pistes d’études pour mieux comprendre les rôles encore peu définis des kinases ERK3/4-MK5.

Le récepteur CD36 : implication dans le développement de l'athérosclérose et dans le recrutement des leucocytes aux sites inflammatoires

Le CD36 est un récepteur éboueur de classe B exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales de la microvasculature. Le CD36 présente une haute affinité de liaison pour les ligands lipidiques tels que les lipoprotéines oxydées de basse densité (LDLox). De part sa capacité à internaliser les LDLox au niveau des macrophages et de son implication dans la formation des cellules spumeuses, le CD36 joue un rôle critique dans le développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique sélectif du CD36, exerce des effets anti-athérosclérotiques chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Un traitement prolongé (12 semaines) avec le EP 80317 réduit fortement (de 51%) la surface des lésions athérosclérotiques par comparaison aux souris témoins. L'effet anti-athérosclérotique est associé à une diminution des taux de cholestérol plasmatique, à une réduction de l’internalisation des LDLox au niveau des macrophages et à une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans le transport inverse du cholestérol. De plus, un traitement par le EP 80317 est également associé une diminution de l’expression aortique et plasmatique de protéines pro-inflammatoires. Nos études ont aussi montré un rôle pour le CD36 dans le recrutement des phagocytes mononucléés au niveau des lésions athérosclérotiques, tel que démontré par une réduction de l’accumulation des phagocytes mononucléés radiomarqués CD36–/– par rapport aux cellules CD36+/+. À l’échelle moléculaire, nous avons montré que les phospholipides oxydés induisent la phosphorylation de la kinase Pyk2 des podosomes des monocytes/macrophages de manière dépendante de l’expression du CD36 et de Src. Cette phosphorylation est atténuée par un traitement par le EP80317. Nos résultats appuient le rôle important du CD36 dans l’athérosclérose et suggèrent que les ligands synthétiques qui modulent la fonction du CD36 représentent potentiellement une nouvelle classe d'agents anti-athérosclérotiques. Le CD36 exprimé par les cellules endothéliales de la microvasculature est un récepteur de l’hétérodimère protéique S100A8/A9. Ces protéines s’associent à l’acide arachidonique intracellulaire (AA) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et le complexe S100A8/A9/AA peut être sécrété par les PMN activés au contact de l’endothélium. Nous avons vérifié l’hypothèse selon laquelle le CD36 exprimé par la microvasculature est impliqué dans le métabolisme transcellulaire de l’AA par la liaison du complexe S100A8/A9/AA et la réponse inflammatoire. Chez deux modèles murins d'inflammation aiguë (ischémie/reperfusion des membres inférieurs et poche d’air dorsale), nous avons observé que la réponse inflammatoire, notamment l’accumulation des PMN au niveau des sites inflammatoires, est diminuée en moyenne de 63% chez les souris CD36-/-. De même, un traitement par le EP 80317 ou par les anticorps anti-S100A8/A9 diminue chacun de 60% en moyenne l’extravasation des PMN vers les tissus inflammatoires. L’administration simultanée des deux traitements n’a aucun effet supplémentaire, et ces traitements n’exercent aucun effet chez les souris CD36-/-. Nos résultats appuient le rôle du récepteur CD36 de la microvasculature dans la régulation de la réponse inflammatoire. L’utilisation des ligands synthétiques du CD36 pourrait représenter une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement des réponses inflammatoires aiguës.

Implication de polymorphismes génétiques dans la prédisposition des humains à l'insuffisance cardiaque et leur réponse au traitement pharmacothérapeutique.

Le système cardiovasculaire est composé d'un cœur qui pompe régulièrement le sang à travers des artères afin d'alimenter tous les tissus corporels en oxygène et nutriments qui leur sont nécessaires. Une caractéristique particulière de ce système est son aspect fermé, où le sang fait un cycle constant commençant par le ventricule gauche, allant vers tous les tissus corporels, revenant vers le cœur et le ventricule droit, étant propulsé vers la circulation pulmonaire en retournant au ventricule gauche. L'insuffisance cardiaque est alors une incapacité du cœur à effectuer sa tâche de pomper le sang efficacement. Une série d'ajustements sont alors enclenchés pour rétablir un débit sanguin adéquat; cette réponse systémique est principalement menée par le système rénine-angiotensine-aldostérone ainsi que par le système adrénergique. À court terme, le flot sanguin est rétabli et le métabolisme corporel continue comme si rien n'était, de telle sorte que, souvent ce stade passe inaperçu et les individus qui en sont affectés sont asymptomatiques. Cependant, le cœur doit alors fournir un effort constant supérieur et si la cause n'est pas résolue, la condition cardiaque se dégradera encore plus. Si tel est le cas, pour s'ajuster à cette nouvelle réalité, le cœur, comme tout muscle, deviendra plus massif et changera de conformation afin de répondre à sa nouvelle charge de travail. Cette transformation cardiaque est communément connue sous le terme de remodelage. Par contre, le remodelage cardiaque est délétère à long terme et entrave encore plus le cœur à bien effectuer sa tâche. Au fur et à mesure que la fonction cardiaque décline, les systèmes compensatoires persistent et s'intensifient; il y a alors établissement d'un cercle vicieux destructeur qui ne peut être renversé que par une transplantation cardiaque. Entre temps, des thérapies inhibant le système rénine-angiotensine-aldostérone et le système adrénergique se sont avérés très efficaces pour prolonger la survie, diminuer la mortalité, réduire les hospitalisations ainsi que soulager la symptomatologie associée à l'insuffisance cardiaque. Par contre, ces régimes thérapeutiques ne semblent pas induire une réponse positive chez tous les patients, de sorte que certains n'en retirent pas de bénéfices tangibles, tandis que d'autres éprouvent plusieurs difficultés à les tolérer. Suite à des analyses rétrospectives, surtout en comparant la réponse thérapeutique entre des populations de diverses ethnies, les variations génétiques, particulièrement les polymorphismes ayant le potentiel de moduler le mécanisme d'action de la pharmacothérapie, furent proposés comme responsables de cette variabilité dans la réponse aux médicaments. Certains ont aussi proposé que certains polymorphismes pourraient être considérés comme des facteurs de risque prédisposant à l'insuffisance cardiaque ou coupables de moduler sa progression en tant que facteurs aggravants ou atténuants. Avec de telles hypothèses proposées, plusieurs associations génétiques furent étudiées en commençant par des gènes directement impliqués dans la pathogénèse de cette maladie. Dans le cadre de cette thèse, nous allons revoir les diverses données disponibles dans la littérature au sujet de l'influence que peuvent avoir les divers polymorphismes impliqués dans la prédisposition, la progression et la pharmacogénétique de l'insuffisance cardiaque.

Implication de MEK1 et MEK2 dans l'initiation et la progression du cancer colorectal

Une dérégulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observée dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observées dans 30% à 50% des adénomes colorectaux. À la suite d’une analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observé que 44% des tissus cancéreux exprimaient MEK1/2 phosphorylés, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a également révélé que 79% des tumeurs arboraient un marquage nucléaire de MEK1/2 phosphorylés, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit fréquemment activée dans les cancers, le rôle précis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais été clairement établie. De même, l'impact de cette localisation nucléaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons démontré, que l’expression de MEK1 ou MEK2 activé est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales épithéliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une dérégulation de la prolifération cellulaire et engendrer la formation d'adénocarcinomes invasifs dans un modèle de greffe orthotopique du côlon chez la souris. Nous avons également démontré que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime complètement la prolifération des lignées humaines de cancer du côlon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacité de prolifération. Le deuxième projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nucléaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifération, une résistance à l'anoikose, un dérèglement du cycle cellulaire, de l'instabilité chromosomique (CIN), de la tétra/aneuploïdie sont observés. La caractérisation des mécanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphorylés, a permis d'identifier la protéine Sef, un régulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons démontré que l'expression d'une forme oncogénique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nucléaire de MEK1/2 activés. Plus encore, la réexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les propriétés tumorigéniques ainsi que l'aneuploïdie induite par Ras activé. Un troisième projet, visant la caractérisation des mécanismes associés à la CIN et à l'aneuploïde engendrés par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant à la binucléation. Une localisation erronée et une surexpression de la kinase Aurora A, de même que des protéines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observées. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces régulateurs mitotiques, de même que corriger les anomalies de la mitose et réduire la tétra/aneuploïdie engendrée par Ras oncogénique. Ainsi, nous avons démontré, pour la première fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est impliquée dans la CIN, la tétraploïdie et l'aneuploïdie. Nos résultats suggèrent que la perte de Sef est un événement oncogénique précoce, qui contribue à la localisation nucléaire aberrante de MEK1/2 qui est observée dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associée à l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activité soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et démontrent l’importance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorigénèse colorectale.

Implication de l'aldostérone dans les changements hémodynamiques de la grossesse

La grossesse s’accompagne d’importantes modifications hormonales et hémodynamiques. Parmi celles-ci, le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) est activé très tôt durant la grossesse. De plus, cette augmentation du SRAA est accompagnée d’élévations du débit cardiaque et du volume plasmatique ainsi que des baisses paradoxales de la pression artérielle et de la résistance vasculaire périphérique. Ceci suggère que la grossesse induit un remaniement des réponses physiologiques normales au SRAA. Une résistance vasculaire à l’action des vasopresseurs est également observée durant la gestation. Ce phénomène serait causé par la modification de la fonction des canaux calciques et potassiques. De plus, il serait possiblement dû à la participation de la Na+/K+-ATPase, par son influence sur le potentiel membranaire des cellules des muscles lisses vasculaires (VSMC). La présence des récepteurs minéralocorticoïdes (MR) dans les VSMC laisse croire que l’aldostérone peut influencer le tonus vasculaire par des effets génomiques et non-génomiques. Compte tenu des connaissances actuelles, nous avons émis l’hypothèse que l’augmentation des taux sériques d’aldostérone durant la grossesse est responsable des changements hémodynamiques observés et que ces effets sont causés par l’activation des MR. Des rates gestantes ont été traitées avec du canrénoate de potassium (20 mg/kg•jr), un antagoniste des MR, durant la dernière semaine de gestation (sur 3). Sur des anneaux aortiques dénudés de leur endothélium, nous avons mesuré les réponses contractiles à la phényléphrine (PhE) et au KCl en présence d’un bloqueur des canaux calciques dépendants du voltage (VDCC), la nifédipine, et d’activateurs des canaux potassiques à large conductance (BKCa) et ceux dépendants de l’ATP (KATP), respectivement le NS-1619 et la cromakalim. Les réponses à la PhE et au KCl sont réduites à partir du 17e jour de gestation et le traitement au canrénoate augmente ces réponses dans tous les groupes. Les modulateurs de canaux ioniques atténuent les réponses à la PhE et au KCl. Cependant, le canrénoate modifie aussi les effets des modulateurs sur les aortes. Aucun effet ou une baisse des réponses est observable chez les rates non gestantes, tandis qu’une hausse de leur effet inhibiteur est notée chez les rates gestantes. Ces effets du canrénoate font croire que l’aldostérone participe à l’adaptation de la réactivité vasculaire durant la grossesse. Par ailleurs, le potentiel membranaire des VSMC pourrait être affecté dans la gestation. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons évalué l’activité de la Na+/K+-ATPase, impliquée dans le contrôle du potentiel membranaire. Nos résultats démontrent que l’activité de la pompe est inhibée à partir du 19e jour de gestation. Cet effet est renversé par le canrénoate. Toutefois, comme le renversement de l’inhibition de la pompe est également présent chez les rates gestantes traitées avec du PST 2238, un antagoniste de l’ouabaïne sur la Na+/K+-ATPase, et que le canrénoate agit également comme agoniste partiel de la pompe, nous croyons que la diminution d’activité associée à la gestation est liée à une inhibition de la Na+/K+-ATPase par des stéroïdes cardiotoniques plutôt qu’à un effet des minéralocorticoïdes. L’augmention d’activité de la pompe liée au canrénoate s’accompagne d’une diminution de l’expression de la sous-unité α1, suggérant que la sous-unité α2 est responsable des variations de contractilité de l’aorte, puisque son expression n’est pas modifiée par le canrénoate. Les effets de la diminution de l’expression de la sous-unité α1, influencée par la signalisation du MR, restent à être déterminés. Néanmoins, nos résultats montrent que les modifications d’activité de la Na+/K+-ATPase influencent l’activité des canaux potassiques et que la pompe pourraient être un des éléments primordiaux dans le contrôle de la réactivité vasculaire durant la grossesse. Comme le canrénoate modifie la réactivité vasculaire, nous voulions déterminer ses impacts sur la pression artérielle. Des rates gestantes ont été traitées avec du canrénoate (20 ou 60 mg/kg•jr) et les paramètres hémodynamiques ont été évalués par radiotélémétrie. Aucune modification de la pression artérielle, du rythme cardiaque et de la pression pulsée ne sont mesurées chez les rates recevant le traitement. Toutefois, des augmentations de l’osmolalité, des taux sériques d’aldostérone et de corticostérone ainsi que de l’activité rénine plasmatique sont observées chez les animaux recevant 60 mg/kg•jr. Le canrénoate bloque donc le rétrocontrôle du SRAA. Par contre, les MR ne sont pas les principaux responsables du contrôle de la pression artérielle durant la grossesse. En conclusion, nous avons démontré que le traitement des rates au canrénoate influence la réactivité vasculaire de l’aorte durant la gestation. Cet effet est causé par la modification de l’activité de certains canaux ioniques (VDCC, BKCa et KATP). De plus, le canrénoate renverse l’inhibition de la Na+/K+-ATPase observée durant la gestation. Finalement, les actions locales de cet antagoniste des MR sur les vaisseaux sanguins ne se répercutent pas sur l’effet systémique global et aucune modification de la pression artérielle n’est observée. D’autres études seront toutefois nécessaires pour déterminer les voies de signalisation par lesquelles l’aldostérone module les réponses des canaux ioniques dans les VSMC.

Implication de l'association CD20/CD40 dans la mort cellulaire induite via le CD20

CD20 est une phosphoprotéine transmembranaire exprimée spécifiquement à la surface des lymphocytes B. Malgré les nombreuses études qui ont montré son implication dans le flux calcique, son rôle physiologique est assez mal connu. Cependant, des études récentes ont démontré que CD20 peut jouer un rôle important dans la mort cellulaire. D’ailleurs, le rituximab, un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre CD20 humain, a montré son efficacité dans le traitement de nombreuses maladies auto-immunes. Cet anticorps est capable d’induire une profonde déplétion des lymphocytes B, qui va également interférer avec la coopération T et la sécrétion de cytokines. En plus, l’engagement du CD20 à la surface des cellules induit la mort cellulaire, alors que la partie cytoplasmique de cette molécule ne possède pas un motif de mort. Donc, il est possible que cette réponse soit médiée par des molécules qui semblent être associées au CD20 comme CD40. En effet, CD40, une glycoprotéine transmembranaire de type I, est un composant majeur du système immunitaire, dont l’engagement pourrait moduler la fonction cellulaire et même conduire à la mort rapide des cellules B. Le travail présenté dans ce mémoire porte sur l’étude de la mort cellulaire induite par un anti-CD20, le rituximab, ainsi que l’étude du rôle de l’association CD20/CD40 dans la mort cellulaire médiée par cet anticorps. Nos résultats montrent que la mort cellulaire induite par le rituximab varie en fonction du type cellulaire et du niveau d’expression du CD20, et que la présence du CD40 à la surface des cellules augmente l’activité de la mort cellulaire induite par le rituximab. En plus, CD20 et CD40 sont associés à la surface cellulaire, et la partie cytoplasmique n’est pas impliquée dans cette association mais semble être importante dans la mort cellulaire induite via CD20.

CD40 signalling in platelet function

Le CD40 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale ("Tumour necrosis factor", TNF), initialement identifié sur des cellules de carcinome de la vessie. L'interaction du CD40 avec son ligand (CD40L) est d'une importance cruciale pour le développement des cellules B et de la commutation d'isotype au cours de la réponse immunitaire acquise. L'expression du complexe CD40/CD40L était initialement cru d'être limiter aux cellules du système immunitaire, mais aujourd'hui il est bien connu que ce complexe est également exprimé sur les cellules du système circulatoire et vasculaire, et est impliqué dans diverses réactions inflammatoires; de sorte que le CD40L est maintenant considéré comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des événements cardiovasculaires. Les plaquettes expriment constitutivement le CD40, alors que le CD40L n'est exprimé que suite à leur l'activation. Il est ensuite clivé en sa forme soluble (sCD40L) qui représente la majorité du sCD40L en circulation. Il fut démontré que le sCD40L influence l'activation plaquettaire mais son effet exact sur la fonction plaquettaire, ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à son action demeurent inconnus. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’adresser les objectifs spécifiques suivants: 1) évaluer les effets in vitro du sCD40L sur l'activation et l'agrégation plaquettaire; 2) identifier les récepteurs plaquettaires impliqués dans l’action du sCD40L; 3) élucider les voies signalétiques intracellulaires induits par le sCD40L; 4) évaluer les effets du sCD40L sur la formation de thrombus in vivo. Nous avons trouvé que le sCD40L augmente fortement l'activation et l'agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations d'agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n'interagit pas avec le CD40, et les plaquettes de souris déficientes en CD40 ne furent pas en mesure d'induire de telles réponses, indiquant que le récepteur principal du sCD40L au niveau des plaquettes est le CD40. En plus, nous avons identifié la présence de plusieurs membres de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("TNF receptor-associated factor", TRAF) dans les plaquettes et nous avons montré que seulement le TRAF2 s'associe avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Nos résultats indiquent aussi que le sCD40L agisse sur les plaquettes au repos par l'entremise de deux voies signalétiques distinctes. La première voie implique l'activation de la petite GTPase Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase p38 activée par le mitogène ("p38 mitogen-activated protein kinase", p38 MAPK ), menant au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l'actine; alors que la deuxième voie implique l'activation de la cascade signalétique du NF-kB. Par ailleurs, à la suite d'une lésion artérielle induite par le chlorure de fer, le sCD40L exacerbe la formation de thrombus et l'infiltration leucocytaire au sein du thrombus dans les souris du type sauvage, mais pas chez les souris déficientes en CD40. En conclusion, ce projet a permis d'identifier pour la première fois deux voies signalétiques distinctes en aval du CD40 plaquettaire et a permis d'établir leur implication dans l'activation et l'agrégation plaquettaire en réponse au sCD40L. De manière plus importante, ce projet nous a permis d'établir un lien direct entre les niveaux élevés du sCD40L circulant et la formation de thrombus in vivo, tout en soulignant l'importance du CD40 dans ce processus. Par conséquent, l'axe CD40/CD40L joue un rôle important dans l'activation des plaquettes, les prédisposant à une thrombose accrue en réponse à une lésion vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer en partie la corrélation entre les taux circulants élevés du sCD40L et l'incidence des maladies cardiovasculaires.

Régulation des hémicanaux de connexine 43 : implication dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques

La connexine 43 (Cx43) est l’unité protéique de base dans la formation des canaux des jonctions gap (JG) responsables des échanges intercellulaires. Toutefois, elle forme aussi des canaux non-jonctionnels à large conductance, nommés hémicanaux (Hc), qui fournissent un accès entre l’intérieure des cellules et le milieu extracellulaire. Bien qu’ils soient beaucoup moins étudiés que les JG, on estime que les Hc restent normalement à l’état fermé, et ce, grâce à la phosphorylation des connexines qui les forment. Suite à un stress ischémique, les Cx43 se déphosphorylent et entraînent ainsi l’ouverture des Hc de Cx43 (HcCx43), un effet qui compromet la survie des cellules. La protéine kinase C (PKC) est l’enzyme de phosphorylation qui possède le plus grand nombre de sites de phosphorylation sur la Cx43 en comparaison avec les autres kinases. Ses fonctions dépendent de la mise en jeu d’un répertoire d’au moins 12 isoformes distinctes. Dans les cardiomyocytes, les isoformes de PKC participent au développement des réponses adaptées ou mésadaptées au stress ischémique. Malgré que la régulation des canaux de Cx43 par la PKC lors d’une ischémie soit bien documentée, il n’existe pas à l’heure actuelle de connaissances sur les effets fonctionnels spécifiques qu’exercent des différentes isoformes de PKC sur les HcCx43, ni sur la valeur thérapeutique de la modulation de ses derniers. Dans ce contexte, nous avons proposé que les HcCx43 sont régulés sélectivement et différentiellement par les différentes isoformes de PKC et que l’inhibition spécifique de ces hémicanaux peut protéger le coeur lors d’un événement ischémique. Le présent travail comporte trois études qui ont été entreprises spécialement dans le but de valider ces hypothèses. Dans la première étude, nous avons profité de l’expertise du laboratoire du Dr Baroudi dans la dissection des isoformes de PKC pour étudier le rôle fonctionnel de chacune d’elles dans la régulation des HcCx43 en utilisant une gamme unique de peptides synthétiques inhibiteurs et activateurs spécifiques des isoformes de PKC, en combinaison avec la technique du patch-clamp. Nous avons démontré, entre autre, que les HcCx43 sont particulièrement inhibés par l’isoforme PKC epsilon, connue pour son effet cardioprotecteur contre les dommages ischémiques lors d’un préconditionnement ischémique. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’effet d’un peptide synthétique mimétique structural de la Cx43 sur la fonction des HcCx43. En plus d’avoir élucidé ces effets sur les propriétés fonctionnelles du canal, nous avons démontré d’une manière directe et indéniable que le peptide Gap26 inhibe et spécifiquement les HcCx43 et que son administration in vitro (cardiomyocytes isolés) et ex vivo (coeur intact) confère à ces modèles expérimentaux une résistance importante contre le stress ischémique. Dans la troisième étude, nous avons investigué pour la première fois in vivo le potentiel de deux peptides uniques mimétiques structuraux de la Cx43, Gap26 et Gap27, dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques lorsqu’ils sont administrés à basse dose sous forme d’un bolus intraveineux unique. Nous avons démontré que l’injection de ces peptides avant ou après la survenue de l’ischémie réduit significativement la taille de l’infarctus qui en résulte.En conclusion, l’ensemble de ces résultats révèlent le rôle bénéfique de l’inhibition des HcCx43 lors d’une ischémie et dévoilent un potentiel thérapeutique prometteux des mimétiques structuraux de Cx43 dans la prévention et le traitement de l’infarctus du myocarde.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Investigation de l'implication des neurones GABAergiques exprimant la parvalbumine dans les déficits cognitifs associés aux délétions du gène Cacna1a.

Les mutations du gène CACNA1A, encodant la sous-unité α du canal calcique voltage-dépendant CaV2.1, causent l’ataxie épisodique de type 2 (EA2) chez l’humain. Nous avons investigué une cohorte de 16 patients de quatre familles canadiennes-françaises porteurs de mutations induisant une perte de fonction du gène CACNA1A. Outre une ataxie épisodique et un risque élevé d’épilepsie, la majorité de ces patients présentait des symptômes neurocognitifs incluant de l’inattention, des troubles d’apprentissage et une rigidité cognitive. Nous avons récemment démontré qu’une délétion sélective de Cacna1a dans les interneurones (INs) GABAergiques corticaux induit une dysfonction synaptique des IN exprimant la parvalbumine (PV) et suffit à induire une épilepsie généralisée. Cependant, les mécanismes sous-tendant l’atteinte cognitive associée aux délétions du gène CACNA1A sont inconnus. Nous postulons que la perte sélective d’inhibition périsomatique corticale résultant de la dysfonction synaptique des IN PV contribue aux déficits cognitifs associés aux délétions de Cacna1a. Afin d’investiguer cette hypothèse, nous avons généré une lignée de souris mutantes portant une délétion hétérozygote conditionnelle de Cacna1a restreinte aux populations neuronales exprimant la PV (PVcre; Cacna1ac/+). En couplant optogénétique et électrophysiologie, nous avons démontré que cette mutation affecte significativement l’inhibition des cellules pyramidales du cortex orbitofrontal par les IN PV. Nous avons de plus démontré que les mutants PVcre; Cacna1ac/+ présentent des troubles d’impulsivité et de rigidité cognitive dans différents paradigmes comportementaux. En conclusion, nos travaux suggèrent qu’une haploinsuffisance de Cacna1a engendre des déficits cognitifs et comportementaux en partie imputables à une dysfonction de l’inhibition périsomatique au niveau des circuits orbitofrontaux.

Role of histone methylation in the regulation of COX-2, iNOS, and mPGES-1 gene expression in human chondrocytes: Implication for Osteoarthritis

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative, classée comme la forme la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée par la dégénérescence du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale, et le remodelage de l’os sous-chondral. Ces changements structurels et fonctionnels sont dues à de nombreux facteurs. Les cytokines, les prostaglandines (PG), et les espèces réactives de l'oxygène sont les principaux médiateurs impliqués dans la pathophysiologie de l'OA. L'interleukine-1β (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui joue un rôle crucial dans l'OA. L'IL-1β induit l'expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2), la microsomale prostaglandine E synthase-1 (mPGES-1), la synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), ainsi que leurs produits la prostaglandine E2 (PGE2) et l'oxyde nitrique (NO). Ce sont des médiateurs essentiels de la réponse inflammatoire au cours de l'OA qui contribuent aux mécanismes des douleurs, de gonflement, et de destruction des tissus articulaires. Les modifications épigénétiques jouent un rôle très important dans la régulation de l’expression de ces gènes pro-inflammatoires. Parmi ces modifications, la méthylation/ déméthylation des histones joue un rôle critique dans la régulation des gènes. La méthylation/ déméthylation des histones est médiée par deux types d'enzymes: les histones méthyltransférases (HMT) et les histones déméthylases (HDM) qui favorisent l’activation et/ou la répression de la transcription. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression des gènes de la COX-2, la mPGES-1, et l’iNOS. L'objectif de cette étude est de déterminer si la méthylation/déméthylation des histones contribute à la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS dans des chondrocytes OA humains induits par l'IL-1β. Nous avons montré que la méthylation de la lysine K4 de l'histone H3 (H3K4) par SET-1A contribue à l’activation des gènes COX-2 et iNOS dans les chondrocytes humains OA induite par l'IL-1β. Nous avons également montré que la lysine K9 de l’histone H3 (H3K9) est déméthylée par LSD1, et que cette déméthylation contribue à l’expression de la mPGES-1 induite par IL-1β dans les chondrocytes humains OA. Nous avons aussi trouvé que les niveaux d'expression des enzymes SET-1A et LSD1 sont élevés au niveau du cartilage OA. Nos résultats montrent, pour la première fois, l'implication de la méthylation/ déméthylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS. Ces données suggèrent que ces mécanismes pourraient être une cible potentielle pour une intervention pharmacologique dans le traitement de la physiopathologie de l'OA.