Directed evolution of human dihydrofolate reductase: towards a better understanding of binding at the active site

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Antagonism of tetherin restriction of HIV-1 release by Vpu involves binding and sequestration of the restriction factor in a perinuclear compartment

The Vpu accessory protein promotes HIV-1 release by counteracting Tetherin/BST-2, an interferon-regulated restriction factor, which retains virions at the cell-surface. Recent reports proposed beta-TrCP-dependent proteasomal and/or endo-lysosomal degradation of Tetherin as potential mechanisms by which Vpu could down-regulate Tetherin cell-surface expression and antagonize this restriction. In all of these studies, Tetherin degradation did not, however, entirely account for Vpu anti-Tetherin activity. Here, we show that Vpu can promote HIV-1 release without detectably affecting Tetherin steady-state levels or turnover, suggesting that Tetherin degradation may not be necessary and/or sufficient for Vpu anti-Tetherin activity. Even though Vpu did not enhance Tetherin internalization from the plasma membrane (PM), it did significantly slow-down the overall transport of the protein towards the cell-surface. Accordingly, Vpu expression caused a specific removal of cell-surface Tetherin and a re-localization of the residual pool of Tetherin in a perinuclear compartment that co-stained with the TGN marker TGN46 and Vpu itself. This re-localization of Tetherin was also observed with a Vpu mutant unable to recruit beta-TrCP, suggesting that this activity is taking place independently from beta-TrCP-mediated trafficking and/or degradation processes. We also show that Vpu co-immunoprecipitates with Tetherin and that this interaction involves the transmembrane domains of the two proteins. Importantly, this association was found to be critical for reducing cell-surface Tetherin expression, re-localizing the restriction factor in the TGN and promoting HIV-1 release. Overall, our results suggest that association of Vpu to Tetherin affects the outward trafficking and/or recycling of the restriction factor from the TGN and as a result promotes its sequestration away from the PM where productive HIV-1 assembly takes place. This mechanism of antagonism that results in TGN trapping is likely to be augmented by beta-TrCP-dependent degradation, underlining the need for complementary and perhaps synergistic strategies to effectively counteract the powerful restrictive effects of human Tetherin.

TAR DNA-Binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1

TDP-43 est une protéine multifonctionnelle possédant des rôles dans la transcription, l'épissage des pré-ARNm, la stabilité et le transport des ARNm. TDP-43 interagit avec d'autres hnRNP, incluant hnRNP A2, via son extrémité C-terminale. Plusieurs membres de la famille des hnRNP étant impliqués dans la réponse au stress cellulaire, alors nous avons émis l’hypothèse que TDP-43 pouvait y participer aussi. Nos résultats démontrent que TDP-43 et hnRNP A2 sont localisés au niveau des granules de stress, à la suite d’un stress oxydatif, d’un choc thermique, et lors de l’exposition à la thapsigargine. TDP-43 contribue à la fois à l'assemblage et au maintien des granules de stress en réponse au stress oxydatif. TDP-43 régule aussi de façon différentielle les composants clés des granules de stress, notamment TIA-1 et G3BP. L'agrégation contrôlée de TIA-1 est perturbée en l'absence de TDP-43. En outre, TDP-43 régule le niveau d`ARNm de G3BP, un facteur de granule de stress de nucléation. La mutation associée à la sclérose latérale amyotrophique, TDP-43R361S, compromet la formation de granules de stress. Ainsi, la fonction cellulaire de TDP-43 s'étend au-delà de l’épissage; TDP-43 est aussi un composant de la réponse cellulaire au stress central et un acteur actif dans le stockage des ARNs.

Identification and characterization of a new adhesin involved in the binding of Streptococcus suis to the extracellular matrix proteins

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Caractérisation de l'interaction de l'auto-antigène ADN topoisomérase I avec les fibroblastes dans la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique.

Purification and identification of specific RNA-binding protein that binds to the 3'UTR region of cytochrome P450aromatase mRNA in bovine granulosa cells

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Induction d’anticorps anti-idiotypiques contre les protéoglycanes de la matrice extracellulaire dans la réduction des lésions athérosclérotiques

L’athérosclérose est caractérisée par l’accumulation de lipoprotéines de basse densité (LDL) liées aux protéoglycanes de la paroi artérielle. Des anticorps chimériques (ch) qui se lient aux glycosaminoglycanes (GAG) ont été générés. L'hypothèse est que la vaccination avec le chP3R99, un anticorps chimérique mutant de l'hybridome P3, pouvait interférer avec la rétention des LDL par l’induction d’une cascade d’anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les GAG. Des souris mâles déficientes en apolipoprotéine E ont été soumises à une diète hypercholestérolémique et ont reçu 5 injections sous-cutanées de 50 μg de vaccin chP3R99 ou de vaccin chP3S98 (un mutant de faible réactivité). Les injections ont été effectuées à chaque semaine ou aux 2 semaines. Au moment du sacrifice, l'aorte perfusée avec du PBS a été excisée et analysée après coloration au Oil Red-O. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de lésions sur la superficie totale de l'aorte. La réactivité contre le chP3R99, chP3S98, l’héparine, le sulfate de dermatane et de chondroïtine des sérums de souris immunisées a été mesurée par ELISA. De plus, la liaison de l'anticorps chP3R99 aux GAG dans la lésion d'athérosclérose a été observée par un appareil de visualisation in vivo.Nos résultats montrent que l’immunogénicité des anticorps chP3R99 est supérieure à celle des anticorps chP3S98 et que le sérum des souris immunisées avec le chP3R99 présente des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les GAG. Cet effet est associé à une réduction de 42 % (p < 0.01) du pourcentage de lésions athérosclérotiques chez les souris vaccinées. L'utilisation d’une immunisation active avec l’anticorps chP3R99 pourrait constituer une approche thérapeutique pour le traitement de l'athérosclérose.

Les substrats neuronaux sous-tendant le binding automatique et contrôlé en mémoire de travail dans la schizophrénie : une étude en IRMf.

Le déficit de mémoire de travail est une des caractéristiques centrales de la schizophrénie et est associé aux problèmes de fonctionnement quotidien des patients. Parmi les différents processus sous-tendus par la mémoire de travail, nous nous intéressons au binding. Le binding est un processus qui permet d’associer plusieurs informations (par exemple, associer le nom d’une personne avec son adresse). En mémoire de travail, les patients schizophrènes ne présentent pas de déficit de binding lorsque les informations sont associées involontairement. Ce type de binding est appelé binding automatique. Cependant, les informations peuvent aussi être associées sous le contrôle volontaire et attentionnel des participants, nous parlons alors de binding contrôlé. À l’heure actuelle, aucune étude n’a été effectuée sur le binding contrôlé en schizophrénie. Notre objectif est de déterminer s'il existe un déficit spécifique de binding contrôlé dans la schizophrénie, et de décrire les substrats neuronaux qui le sous-tendent. Dix-neuf patients schizophrènes et 18 sujets témoins ont effectué une tâche de binding en mémoire de travail dans un scanner IRM. Celle-ci consistait à mémoriser des mots et des positions spatiales dont l’association variait selon deux conditions. Dans la condition de binding contrôlé, les mots et les positions spatiales étaient présentés séparément et les participants devaient faire l’association entre les deux informations eux-mêmes. Dans la condition de binding automatique, les mots étaient d’emblée associés aux positions spatiales. Nos résultats suggèrent que les patients schizophrènes n’auraient pas de déficit de binding automatique alors qu’ils auraient un déficit de binding contrôlé par rapport aux sujets témoins. Le déficit de binding contrôlé serait sous-tendu par des niveaux d’activation plus faibles du cortex préfrontal dorsolatéral. Les processus contrôlés seraient altérés alors que les processus automatiques seraient préservés dans la schizophrénie.

Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.