O6-Methylguanine-DNA-Methyltransferase methylation: prevalence and predictive value in head and neck squamous cell carcinoma

Introduction: Le gène O6-méthylguanine-ADN méthyltransferase (MGMT) code pour une enzyme spécifique réparatrice de l’ADN qui protège les cellules de la toxicité des agents alkylants. Ainsi, l’activité du MGMT est un mécanisme majeur de résistance aux agents alkylants. Il a été démontré qu’une diminution de l’expression du gène MGMT par une hyperméthylation du promoteur résulte en une amélioration de la survie chez les patients avec certains types de tumeurs qui sont traitées avec des agents chimiothérapeuthique alkylants. Objectifs: Déterminer la prévalence de la méthylation du gène MGMT chez des patients avec des cancers épidermoïdes localement avancés de la sphère ORL traités avec chimioradiothérapie et évaluer l’impact de cette méthylation sur la survie. Méthodes: Sur 428 patients consécutifs, traités avec chimioradiothérapie à notre institution et suivis pour un période médiane de 37 mois, 199 spécimens chirurgicaux paraffinés ont été récupérés. L’ADN était extrait et modifié par le traitement au bisulfite. Une réaction en chaîne de la polymérase, spécifique à la méthylation était entreprise pour évaluer l’état de méthylation du promoteur du gène du MGMT. Les résultats de laboratoire étaient corrélés avec la réponse clinique. L’analyse statistique était exécutée à l’aide du test de Fisher pour les données catégoriques et à l’aide des courbes de Kaplan-Meier pour les échecs au traitement. Résultats : Des 199 extraits d’ADN initiaux, 173 (87%) étaient modifiés au bisulfite avec succès. Des ces spécimens modifiés, 71 (41%) ont démontré une hyperméthylation du MGMT. Pour les cas de méthylation et nonméthylation du MGMT, les caractéristiques des patients n’étaient pas significativement différentes. Les taux de réponse étaient 71 et 73% (p=NS) respectivement. Le contrôle locorégional était respectivement 87 et 77% (p=0.26), la survie sans maladie était 80 et 60% (p=0.38), la survie sans métastase à distance était 92 et 78% (p=0.08) et la survie globale était 64 et 62% (p=0.99) à 3 ans. Conclusions : L’état de méthylation du MGMT est fortement prévalent (41%) et semble avoir un possible impact bénéfique sur la survie quand la chimioradiothérapie est administrée aux patients avec des stades avancés de cancers tête et cou.

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Caractérisation de la fonction des complexes histone déacétylases Rpd3S et Set3C

La chromatine est essentielle au maintien de l’intégrité du génome, mais, ironiquement, constitue l’obstacle principal à la transcription des gènes. Plusieurs mécanismes ont été développés par la cellule pour pallier ce problème, dont l’acétylation des histones composant les nucléosomes. Cette acétylation, catalysée par des histones acétyl transférases (HATs), permet de réduire la force de l’interaction entre les nucléosomes et l’ADN, ce qui permet à la machinerie transcriptionnelle de faire son travail. Toutefois, on ne peut laisser la chromatine dans cet état permissif sans conséquence néfaste. Les histone déacétylases (HDACs) catalysent le clivage du groupement acétyle pour permettre à la chromatine de retrouver une conformation compacte. Cette thèse se penche sur la caractérisation de la fonction et du mécanisme de recrutement des complexes HDACs Rpd3S et Set3C. Le complexe Rpd3S est recruté aux régions transcrites par une interaction avec le domaine C-terminal hyperphosphorylé de Rpb1, une sous-unité de l’ARN polymérase II. Toutefois, le facteur d’élongation DSIF joue un rôle dans la régulation de cette association en limitant le recrutement de Rpd3S aux régions transcrites. L’activité HDAC de Rpd3S, quant à elle, dépend de la méthylation du résidu H3K36 par l’histone méthyltransférase Set2. La fonction du complexe Set3C n’est pas clairement définie. Ce complexe est recruté à la plupart de ses cibles par l’interaction entre le domaine PHD de Set3 et le résidu H3K4 di- ou triméthylé. Un mécanisme indépendant de cette méthylation, possiblement le même que pour Rpd3S, régit toutefois l’association de Set3C aux régions codantes des gènes les plus transcrits. La majorité de ces résultats ont été obtenus par la technique d’immunoprécipitation de la chromatine couplée aux biopuces (ChIP-chip). Le protocole technique et le design expérimental de ce type d’expérience fera aussi l’objet d’une discussion approfondie.

Identification and isolation of plant promoters induced by thiocyanate

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Expression des histones déméthylases dans les cellules hématopoïétiques humaines et les leucémies aiguës

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique.

Typage de la classe génotypique du gène PRDM9 à partir de données de séquençage de Nouvelle Génération

Les positions des évènements de recombinaison s’agrègent ensemble, formant des hotspots déterminés en partie par la protéine à évolution rapide PRDM9. En particulier, ces positions de hotspots sont déterminées par le domaine de doigts de zinc (ZnF) de PRDM9 qui reconnait certains motifs d’ADN. Les allèles de PRDM9 contenant le ZnF de type k ont été préalablement associés avec une cohorte de patients affectés par la leucémie aigüe lymphoblastique. Les allèles de PRDM9 sont difficiles à identifier à partir de données de séquençage de nouvelle génération (NGS), en raison de leur nature répétitive. Dans ce projet, nous proposons une méthode permettant la caractérisation d’allèles de PRDM9 à partir de données de NGS, qui identifie le nombre d’allèles contenant un type spécifique de ZnF. Cette méthode est basée sur la corrélation entre les profils représentant le nombre de séquences nucléotidiques uniques à chaque ZnF retrouvés chez les lectures de NGS simulées sans erreur d’une paire d’allèles et chez les lectures d’un échantillon. La validité des prédictions obtenues par notre méthode est confirmée grâce à analyse basée sur les simulations. Nous confirmons également que la méthode peut correctement identifier le génotype d’allèles de PRDM9 qui n’ont pas encore été identifiés. Nous conduisons une analyse préliminaire identifiant le génotype des allèles de PRDM9 contenant un certain type de ZnF dans une cohorte de patients atteints de glioblastomes multiforme pédiatrique, un cancer du cerveau caractérisé par les mutations récurrentes dans le gène codant pour l’histone H3, la cible de l’activité épigénétique de PRDM9. Cette méthode ouvre la possibilité d’identifier des associations entre certains allèles de PRDM9 et d’autres types de cancers pédiatriques, via l’utilisation de bases de données de NGS de cellules tumorales.

A single amino acid substitution in the mRNA capping enzyme λ2 of a mammalian orthoreovirus mutant increases interferon sensitivity.

In the last few years, the development of a plasmid-based reverse genetics system for mammalian reovirus has allowed the production and characterization of mutant viruses. This could be especially significant in the optimization of reovirus strains for virotherapeutic applications, either as gene vectors or oncolytic viruses. The genome of a mutant virus exhibiting increased sensitivity to interferon was completely sequenced and compared with its parental virus. Viruses corresponding to either the parental or mutant viruses were then rescued by reverse genetics and shown to exhibit the expected phenotypes. Systematic rescue of different viruses harboring either of the four parental genes in a mutant virus backbone, or reciprocally, indicated that a single amino acid substitution in one of λ2 methyltransferase domains is the major determinant of the difference in interferon sensitivity between these two viruses.