Analyse de la réponse macrophagique au Candida albicans chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection opportuniste la plus répandue chez les patients infectés au VIH-1. Un modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) exprimant une partie du génome du VIH-1 (CD4C/HIVMutA) est maintenant disponible. Grâce à ce modèle, il est possible d’étudier les perturbations quantitatives et fonctionnelles des macrophages exprimant les gènes nef, rev et env du VIH-1 dans le contexte d’une COP. Cette étude démontre que la présence du transgène n’influence pas le pourcentage des macrophages dans la muqueuse buccale et le petit intestin, malgré le fait que la charge buccale de C. albicans soit significativement plus élevée chez les souris Tg. Cependant, l’expression du transgène cause une diminution de la production de H2O2 par les macrophages, ainsi que l’augmentation de la production de la cytokine proinflammatoire IL-6 et de la chimiokine MCP-1.

HIV-1 Vpr up-regulates expression of ligands for the activating NKG2D receptor and promotes NK cell-mediated killing

HIV upregulates cell-surface expression of specific ligands for the activating NKG2D receptor, including ULBP-1, -2, -3, but not MICA or MICB, in infected cells both in vitro and in vivo. However, the viral factor(s) involved in NKG2D ligand expression still remains undefined. HIV-1 Vpr activates the DNA damage/stress-sensing ATR kinase and promotes G2 cell-cycle arrest, conditions known to upregulate NKG2D ligands. We report here that HIV-1 selectively induces cell-surface expression of ULBP-2 in primary CD4+ T-lymphocytes by a process that is Vpr-dependent. Importantly, Vpr enhanced the susceptibility of HIV-1-infected cells to NK cell-mediated killing. Strikingly, Vpr alone was sufficient to upregulate expression of all NKG2D ligands and thus promoted efficient NKG2D-dependent NK cell-mediated killing. Delivery of virion-associated Vpr via defective HIV-1 particles induced analogous biological effects in non-infected target cells, suggesting that Vpr may act similarly beyond infected cells. All these activities relied on Vpr ability to activate the ATR-mediated DNA damage/stress checkpoint. Overall, these results indicate that Vpr is a key determinant responsible for HIV-1-induced upregulation of NKG2D ligands and further suggest an immunomodulatory role for Vpr that may not only contribute to HIV-1-induced CD4+ T-lymphocyte depletion but may also take part in HIV-1-induced NK cell dysfunction.

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

Immunopathogenèse de la cryptococcose chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La cryptococcose chez les patients atteints du VIH-1 est principalement causée par Cryptococcus neoformans var. grubii tandis que Cryptococcus gattii infecte surtout les personnes immunocompétentes. Afin d’élucider les mécanismes causant la susceptibilité différentielle à l’égard de ces deux espèces de Cryptococcus dans le contexte de l’infection au VIH-1, nous avons utilisé un modèle novateur de la cryptococcose chez la souris transgénique CD4C/HIVMutA, qui exprime les gènes nef, env et rev du VIH-1. L’expression du transgène VIH-1 a augmenté le recrutement pulmonaire des macrophages alvéolaires mais a diminué celui des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en réponse à l’infection par le C. neoformans ou le C. gattii. La production pulmonaire des chimiokines MCP-1 (CCL2) et RANTES (CCL5) était également réduite chez les souris transgéniques infectées par l’une ou l’autre de ces espèces de Cryptococcus. La production pulmonaire de MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4 et IL-13 était augmentée chez la souris infectée au C. neoformans comparativement à C. gattii. In vitro, les macrophages alvéolaires prélevés chez la souris Tg et stimulés par des agonistes ont produit davantage de MIP-1β, alors que les chimiokines MCP-1 et RANTES n’ont pas été détectées.

Transcriptional regulation of effector CD8+ T cell differentiation and molecular dysfunction during HIV-1 infection

Les cellules T CD8+ jouent un rôle primordial dans le contrôle des infections virales en limitant la dissémination des cellules infectées. Lors de l’infection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spécifiques ne se différencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectées par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de proliférer ou de produire l’ IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et l’engagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces déficits fonctionnels des cellules T . Le rôle de PD-1 dans la régulation d'évènements transcriptionnels contrôlant la différentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste à démontrer. Id2 joue un rôle central dans la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons émis l’hypothèse que le défaut de maturation observé chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spécifiques (CD8+PD-1hi) au cours de l’infection chronique par le virus HIV pouvait être lié à la diminution d’expression du régulateur Id2. Nous avons ainsi démontré que l'engagement de PD-1 contribuait à une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir l’expression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines à chaine gamma joue un rôle clef dans la survie et l’homéostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons démontré que l’IL-15 était unique grâce à ses capacités de stimulation de l’expression d’Id2 et ses propriétés favorisant la survie ainsi que la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. l’IL-15 induit la prolifération de toutes les populations de cellules T mémoires provenant de donneurs sains. L’addition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur différenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par l’IL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur différenciation. Un test de cytotoxicitié par cytométrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spécifiques par l’IL-15 favorisait l’expression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spécifiques. En conclusion, nous avons pour la première fois dans cette thèse défini les mécanismes moléculaires impliqués dans la modulation de l’expression du régulateur transcriptionnel Id2 par l’IL-15. Nous avons également révélé comment l’engagement de PD-1 conduisait a une altération de l’expression et de la fonction d’Id2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spécifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que l’IL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer à une meilleure stimulation des réponses immunes favorisant ainsi la réactivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectées de manière latente.

Rôle de l'autophagie dans la dissémination du VIH-1 par les cellules dendritiques dérivées des monocytes circulants

Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART.

Analysis of HIV-1 Vpr determinants responsible for cell growth arrest in Saccharomyces cerevisiae

Affiliation: Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Exploration fonctionnelle des réponses cellulaires T CD4+ et CD8+ dans l’infection par le VIH-1

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1.

HIV-1 Vpr induces the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of target cellular proteins to activate ATR and promote G2 arrest

HIV-1 viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest at the G2/M phase by a mechanism involving the activation of the DNA damage sensor ATR. We and others recently showed that Vpr performs this function by subverting the activity of the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase. Vpr could thus act as a connector between the E3 ligase and an unknown cellular factor whose ubiquitination would induce G2 arrest. While attractive, this model is solely based on the indirect observation that some mutants of Vpr retain their interaction with the E3 ligase but fail to induce G2 arrest. Using a tandem affinity purification approach, we observed that Vpr interacts with ubiquitinated cellular proteins and that this association requires the recruitment of an active E3 ligase given that depletion of VPRBP by RNA interference or overexpression of a dominant-negative mutant of CUL4A decreased this association. Importantly, G2-arrest-defective mutants of Vpr in the C-terminal putative substrate-interacting domain displayed decreased association with ubiquitinated proteins. We also found that inhibition of proteasomal activity increased this association and that the ubiquitin chains were at least in part constituted of classical K48 linkages. Interestingly, inhibition of K48 polyubiquitination specifically impaired Vpr-induced phosphorylation of H2AX, an early target of ATR, but did not affect UV-induced H2AX phosphorylation. Overall, our results provide direct evidence that association of Vpr with the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase induces the K48-linked polyubiquitination of yet-unknown cellular proteins resulting in their proteasomal degradation and ultimately leading to activation of ATR and G2 arrest.

Antagonism of tetherin restriction of HIV-1 release by Vpu involves binding and sequestration of the restriction factor in a perinuclear compartment

The Vpu accessory protein promotes HIV-1 release by counteracting Tetherin/BST-2, an interferon-regulated restriction factor, which retains virions at the cell-surface. Recent reports proposed beta-TrCP-dependent proteasomal and/or endo-lysosomal degradation of Tetherin as potential mechanisms by which Vpu could down-regulate Tetherin cell-surface expression and antagonize this restriction. In all of these studies, Tetherin degradation did not, however, entirely account for Vpu anti-Tetherin activity. Here, we show that Vpu can promote HIV-1 release without detectably affecting Tetherin steady-state levels or turnover, suggesting that Tetherin degradation may not be necessary and/or sufficient for Vpu anti-Tetherin activity. Even though Vpu did not enhance Tetherin internalization from the plasma membrane (PM), it did significantly slow-down the overall transport of the protein towards the cell-surface. Accordingly, Vpu expression caused a specific removal of cell-surface Tetherin and a re-localization of the residual pool of Tetherin in a perinuclear compartment that co-stained with the TGN marker TGN46 and Vpu itself. This re-localization of Tetherin was also observed with a Vpu mutant unable to recruit beta-TrCP, suggesting that this activity is taking place independently from beta-TrCP-mediated trafficking and/or degradation processes. We also show that Vpu co-immunoprecipitates with Tetherin and that this interaction involves the transmembrane domains of the two proteins. Importantly, this association was found to be critical for reducing cell-surface Tetherin expression, re-localizing the restriction factor in the TGN and promoting HIV-1 release. Overall, our results suggest that association of Vpu to Tetherin affects the outward trafficking and/or recycling of the restriction factor from the TGN and as a result promotes its sequestration away from the PM where productive HIV-1 assembly takes place. This mechanism of antagonism that results in TGN trapping is likely to be augmented by beta-TrCP-dependent degradation, underlining the need for complementary and perhaps synergistic strategies to effectively counteract the powerful restrictive effects of human Tetherin.

Implication de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la transmission mère-enfant du VIH-1

La transmission mère-enfant du VIH-1 (TME) représente le principal mode d’infection chez l’enfant et se produit durant la grossesse (in utero, IU), l’accouchement (intrapartum, IP) ou l’allaitement (postpartum, PP). Les mécanismes qui sous-tendent le passage du VIH-1 à travers le placenta et les muqueuses intestinales du nouveau-né sont encore très peu décrits. « Dendritic cell-specific ICAM-grabbing non-integrin » (DC-SIGN) et son homologue DC-SIGN « related » (DC-SIGNR) sont des récepteurs d’antigènes exprimés au niveau du placenta et capables de capter et de transmettre le VIH-1 aux cellules adjacentes. Ils pourraient donc participer au passage trans placentaire du VIH-1 et le polymorphisme génétique affectant l’expression ou modifiant l’interaction avec le virus aurait une influence sur la TME du VIH-1. Afin d’explorer cette hypothèse, nous avons procédé à une analyse exhaustive du polymorphisme de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la population du Zimbabwe. Par la suite, nous avons déterminé l’association entre le polymorphisme de DC-SIGN et DC-SIGNR et la TME du VIH-1 dans une cohorte d’enfants nés de mères VIH-positives à Harare, au Zimbabwe. Enfin, nous avons défini l’impact fonctionnel des mutations associées. Les enfants homozygotes pour les haplotypes H1 et H3 dans le gène de DC-SIGNR sont 4 à 6 fois plus à risque de contracter le VIH-1 par voie IU et IP. H1 et H3 contiennent la mutation du promoteur p-198A et la mutation de l’intron 2, int2-180A, et des études fonctionnelles nous ont permis de démontrer que p-198A diminue l’activité transcriptionnelle du promoteur de DC-SIGNR et l’expression des transcrits d’ARNm dans le placenta, alors que int2-180A modifie le répertoire d’isoformes de DC-SIGNR vers une proportion diminuée d’isoformes membranaires. Les enfants porteurs des haplotypes H4 et H6 de DC-SIGN sont 2 à 6 fois plus à risque de contracter le VIH-1 par voie IU. Ces haplotypes contiennent deux mutations du promoteur (p-336T/C et p-201C/A) et quatre mutations codant pour un changement d’acide aminé dans l’exon 4 (R198Q, E214D, R221Q ou L242V) associées à un risque augmenté de transmission IU, IP et PP du VIH-1. Des études fonctionnelles ont démontré que les mutations du promoteur diminuent l’expression de DC-SIGN dans les macrophages placentaires. Toutefois, l’exposition IU au VIH-1 module le niveau d’expression de DC-SIGN, résultant en des niveaux d’expression similaires entre les macrophages des porteurs des allèles sauvages et mutés. Les mutations de l’exon 4 augmentent l’affinité de DC-SIGN pour le VIH-1 et sa capacité à capturer et à transmettre le virus aux lymphocytes T, favorisant possiblement la dissémination du VIH-1 à travers le placenta. L’association entre les mutations de DC-SIGN et la transmission IP et PP du VIH-1 suggèrent qu’il aurait aussi un rôle à jouer dans les muqueuses intestinales de l’enfant. Notre étude démontre pour la première fois l’implication de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la TME du VIH-1. L’augmentation des capacités de capture et de transmission de DC-SIGN résulte en une susceptibilité accrue de l’enfant à l’infection au VIH-1 et concorde avec un rôle dans la dissémination transplacentaire. Toutefois, la diminution préférentielle des transcrits membranaires de DC-SIGNR au placenta augmente la TME du VIH-1 et laisse croire à son implication via un autre mécanisme. Ces mécanismes pourraient aussi s’appliquer à d’autres pathogènes reconnus par DC-SIGN et DC-SIGNR et transmis de la mère à l’enfant.

The Role of Second Generation Antiretroviral Drugs in HIV-1 Subtype B and non-B Variants Harboring Natural Polymorphisms and Drug Resistance Mutations.

Cette thèse traite de la résistance du VIH-1 aux antirétroviraux, en particulier de l'activité antivirale de plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ainsi que des inhibiteurs de protéase (IP). Nous avons exploré l’émergence et la spécificité des voies de mutations qui confèrent la résistance contre plusieurs nouveaux INNTI (étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV)) (chapitres 2 et 3). En outre, le profil de résistance et le potentiel antirétroviral d'un nouvel IP, PL-100, est présenté dans les chapitres 4 et 5. Pour le premier projet, nous avons utilisé des sous-types B et non-B du VIH-1 pour sélectionner des virus résistants à ETR, et ainsi montré que ETR favorise l’émergence des mutations V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y et M230L, et ce, en 18 semaines. Fait intéressant, E138K a été la première mutation à émerger dans la plupart des cas. Les clones viraux contenant E138K ont montré un faible niveau de résistance phénotypique à ETR (3,8 fois) et une diminution modeste de la capacité de réplication (2 fois) par rapport au virus de type sauvage. Nous avons également examiné les profils de résistance à ETR et RPV dans les virus contenant des mutations de résistance aux INNTI au début de la sélection. Dans le cas du virus de type sauvage et du virus contenant la mutation unique K103N, les premières mutations à apparaître en présence d’ETR ou de RPV ont été E138K ou E138G suivies d’autres mutations de résistance aux INNTI. À l’inverse, dans les mêmes conditions, le virus avec la mutation Y181C a évolué pour produire les mutations V179I/F ou A62V/A, mais pas E138K/G. L'ajout de mutations à la position 138 en présence de Y181C n'augmente pas les niveaux de résistance à ETR ou RPV. Nous avons également observé que la combinaison de Y181C et E138K peut conduire à un virus moins adapté par rapport au virus contenant uniquement Y181C. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que les mutations Y181C et E138K peuvent être antagonistes. L’analyse de la résistance au PL-100 des virus de sous-type C et CRF01_AE dans les cellules en culture est décrite dans le chapitre 4. Le PL-100 sélectionne pour des mutations de résistance utilisant deux voies distinctes, l'une avec les mutations V82A et L90M et l'autre avec T80I, suivi de l’addition des mutations M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S et I85V. Une accumulation d'au moins trois mutations dans le rabat protéique et dans le site actif est requise dans chaque cas pour qu’un haut niveau de résistance soit atteint, ce qui démontre que le PL-100 dispose d'une barrière génétique élevée contre le développement de la résistance. Dans le chapitre 5, nous avons évalué le potentiel du PL-100 en tant qu’inhibiteur de protéase de deuxième génération. Les virus résistants au PL-100 émergent en 8-48 semaines alors qu’aucune mutation n’apparaît avec le darunavir (DRV) sur une période de 40 semaines. La modélisation moléculaire montre que la haute barrière génétique du DRV est due à de multiples interactions avec la protéase dont des liaison hydrogènes entre les groupes di-tétrahydrofuranne (THF) et les atomes d'oxygène des acides aminés A28, D29 et D30, tandis que la liaison de PL-100 est principalement basée sur des interactions polaires et hydrophobes délocalisées à travers ses groupes diphényle. Nos données suggèrent que les contacts de liaison hydrogène et le groupe di-THF dans le DRV, ainsi que le caractère hydrophobe du PL-100, contribuent à la liaison à la protéase ainsi qu’à la haute barrière génétique contre la résistance et que la refonte de la structure de PL-100 pour inclure un groupe di-THF pourrait améliorer l’activité antivirale et le profil de résistance.

L'impact des cellules dendritiques dans la dérégulation des cellules B dans un contexte d'infection au virus d'immunodéficience humaine

Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières cellules à rencontrer le virus d’immunodéficience humaine (VIH) au niveau des muqueuses. De plus, le fait que les DC sont, de manière directe ou indirecte par le virus et ses composantes, altérées tant par leur nombre, leur phénotype et leur fonction suggère leur implication dans les dérégulations des cellules B. Selon cette hypothèse, des études longitudinales impliquant des individus infectés au VIH-1 présentant différents profils de progression clinique menées dans notre laboratoire ont démontré que les altérations des cellules B sont concomitantes à une augmentation de l’expression de BLyS/BAFF dans le sang ainsi que par les DC myéloïdes (mDC) sanguines. De plus, lors de travaux antérieurs utilisant le modèle murin VIH-transgénique, les altérations des cellules B ont démontré une implication des DC et d’un excès de BLyS/BAFF, et ce, dépendamment du facteur négatif du VIH (Nef). Dans cette optique, nous investiguons dans cette présente étude l’implication de Nef dans la modulation du phénotype des DC ainsi que dans les dérégulations des cellules B. Chez tous les patients virémiques infectés au VIH-1, nous avons détecté la présence de Nef dans le plasma ainsi qu’au niveau des mDC et de leurs précurseurs d’origine monocytaire, tout au long du suivi de la progression clinique et au-delà de la thérapie antirétrovirale (ART). La surexpression de BLyS/BAFF est associée à la présence de Nef au niveau des mDC et de leur précurseur.. Des essais in vitro ont permis de démontrer l’induction d’un phénotype proinflammatoire par des mDC dérivés de monocytes lorsqu’en présence de Nef soluble, via l’augmentation de l’expression de BLyS/BAFF et de TNF-α, et où cet effet est bloqué par l’ajout de l’acide rétinoïque. Nos résultats suggèrent donc que Nef est impliquée dans le déclenchement et la persistance des dérégulations des cellules B retrouvées chez les individus infectés au VIH-1. Basé sur nos observations, une thérapie adjointe impliquant le blocage de BLyS/BAFF et/ou Nef pourrait contribuer au contrôle de l’inflammation et des altérations des cellules B. De plus, la quantification de Nef post-ART pourrait s’avérer utile dans l’évaluation du statut des réservoirs. Précédemment, nous avons démontré que les dérégulations des cellules B sanguines de ces mêmes individus présentant un profil de progression rapide et classique sont accompagnées par l’augmentation de la fréquence d’une population partageant des caractéristiques des cellules B transitionnelles immatures (TI) et des cellules B de la zone marginale (ZM), que nous avons nommé les cellules B précurseur de la ZM. Toutefois, cette population est préservée chez les contrôleurs élites, chez qui nous avons trouvé une diminution significative de la fréquence des cellules B de la ZM présentant des marqueurs phénotypiques plus matures. Récemment, ces cellules ont été associées à un potentiel de fonction régulatrice (Breg), motivant ainsi notre poursuite, dans cette étude, de la caractérisation de ces cellules B. Comme pour les individus non infectés au VIH-1, nous avons démontré que les cellules B matures de la ZM contrôlent leur capacité de production d’IL-10 chez les contrôleurs élites, contrairement à une augmentation chez les progresseurs rapides et classiques. Aussi, les cellules B précurseur de la ZM des contrôleurs élites fournissent une expression importante de LT-α lorsque comparés aux individus non infectés au VIH-1, alors que cet apport de LT-α est attribué aux cellules B TI chez les progresseurs. Le contrôle de la progression clinique semble associé à un ratio en faveur de LT-α vs IL-10 au niveau des cellules B précurseur de la ZM. Nos résultats suggèrent qu’un maintien de l’intégrité du potentiel régulateur ainsi qu’une expression augmentée de LT-α par les cellules B de première ligne, telles les populations de la ZM, sont impliqués dans le contrôle de la progression clinique du VIH-1, possiblement par leur contribution à la modulation et l’homéostasie immunitaire. De telles populations doivent être considérées lors de l’élaboration de vaccins, ces derniers cherchant à générer une réponse protectrice de première ligne et adaptative.

La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.