Hydrogen peroxide enhances the expression and function of Giα proteins in aortic vascular smooth muscle cells from Sprague-Dawley rats : role of growth factor receptors transactivation

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension

Effect of knockdown of Giα proteins using antisense oligodeoxynucleotides encapsulated in cationic liposomes on the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats

L'hypertension artérielle est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. La compréhension des mécanismes qui sont à la base du développement de l'hypertension offrira de nouvelles perspectives pour un meilleur contrôle de l'hypertension. Nous avons précédemment montré que le niveau des protéines Giα-2 et Giα-3 est augmenté chez les rats spontanément hypertendus (SHR) avant l'apparition de l'hypertension. Le traitement avec les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’Angiotensine (IEC) est associé à une diminution de l’expression des protéines Gi. De plus, l'injection intrapertoneale de la toxine de la coqueluche inactive les deux protéines Giα et empêche le développement de l'hypertension chez les SHR. Cependant, la contribution spécifique des protéines Giα-2 et Giα-3 dans le développement de l'hypertension n'est pas encore connue. Dans la présente étude, l’Anti-sens oligodésoxynucléotide (AS-ODN) de Giα-2 et Giα-3 (1mg/Kg en poids corporel) encapsulé dans des liposomes cationiques PEG / DOTAP/ DOPE ont été administrés par voie intraveineuse aux SHR pré-hypertendus âgé de trois semaines et aux Wistar Kyoto (WKY) rats de même âge. Les contrôles des WKY et SHR non traités ont été injectés avec du PBS stérile, liposomes vides ou oligomères sens. La pression artérielle (PA) a été suivie chaque semaine en utilisant la technique manchon caudal. Les rats ont été sacrifiés à l'âge de six semaines et neuf semaines. Le coeur et l'aorte ont été utilisés pour étudier l'expression des protéines Gi. Le knockdown des protéines Giα-2 par l’injection de Giα-2-AS a empêché le développement de l'hypertension à l'âge de six semaines. Par la suite, la PA a commencé à augmenter rapidement et a atteint le niveau que l'on retrouve dans les groupes témoins à l'âge de neuf semaines. D'autre part, la PA du groupe traité avec le Giα-3-AS a commencé à augmenter à l'âge de quatre semaines. Dans le groupe des SHR-Giα-3-AS, la PA a augmenté à l’âgé de six semaines, mais moins que celle de SHR-CTL. Le coeur et l'aorte obtenues des SHR Giα-2-AS et Giα-3-AS à partir de l’âgé de six semaines ont eu une diminution significative de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 respectivement. Dans le groupe des WKY Giα-2-AS et Giα-3-AS l'expression des protéines Giα-2 et Giα-3 respectivement a diminué malgré l'absence de changement dans la PA par rapport aux WKY CTL. À l'âge de neuf semaines, les SHR traités avec du Giα-2-AS et Giα-3-AS avaient la même PA et expression des protéines Gi que le SHR CTL. Ces résultats suggèrent que les deux protéines Giα-2 et Giα-3 sont impliqués dans le développement de l'hypertension chez les SHR, mais le knockdown de Giα-2 et pas de Giα-3 a empêché le développement de l'hypertension.

Pseudopodial MSV-MDCK-INV glycolysis modulates the c-Met phosphorylation-dependent cell motility

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle du stress oxydatif dans l'augmentation de l'expression des protéines Gi[alpha] dans l'hypertension

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Modulation de l'expression des protéines Gi et de la signalisation de l'adénylate cyclase par le monoxyde d'azote : implication dans la régulation de la pression sanguine

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Évaluation d’une intervention infirmière Motivationnelle Selon les Stades de Changement (MSSC) sur des comportements d’auto-soins chez des patients insuffisants cardiaques

L’insuffisance cardiaque (IC), une maladie chronique caractérisée par un mauvais fonctionnement du muscle cardiaque, entraîne des symptômes comme l’essoufflement, l’œdème et la fatigue. L’IC nécessite l’adoption de comportements d’auto-soins pour prévenir les épisodes de décompensation. Le but de cette recherche est d’évaluer l’intervention infirmière motivationnelle selon les stades de changements (MSSC) sur les comportements d’auto-soins chez des patients IC. Afin de guider l’intervention MSSC, la théorie spécifique aux auto-soins chez les patients IC de Riegel et Dickson (2008) a été retenue ainsi que le modèle d’intervention de Bédard et al. (2006) combinant le modèle transthéorique (Prochaska & DiClemente, 1984) et l’entrevue motivationnelle (Miller & Rollnick, 2006). Il s’agit d’un devis expérimental randomisé (pré et post-test) avec groupe contrôle (N = 15/groupe). Les patients du groupe contrôle ont reçu les soins usuels et les patients du groupe intervention (GI) ont reçu l’intervention MSSC durant trois entretiens. Les mesures de résultats ont été collectées à un mois suite à la randomisation par une assistante de recherche aveugle à la randomisation. L’effet de l’intervention a été évalué par des analyses de covariance sur cinq mesures de résultats : la réalisation et la gestion (générale et spécifique à l’IC) des auto-soins, la confiance aux auto-soins (générale et spécifique à l’IC) et la conviction. L’acceptabilité et la faisabilité ont été évaluées. Les résultats indiquent un effet significatif sur la mesure de confiance à effectuer les auto-soins spécifiques à l’IC. La majorité des participants du GI ont progressé dans leurs stades de changement. Ces résultats soulignent le potentiel de cette approche pour favoriser l’adoption des auto-soins mais une étude à plus large échelle est proposée afin d’évaluer l’effet de cette approche dans un essai clinique randomisé.

Rôle des GTPases ARF dans la migration des cellules endothéliales et la sécrétion du NO

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse.

Interaction de Tau avec la petite GTPase Rab5

La protéine Tau joue un rôle essentiel dans les neurones, notamment par ses interactions avec les éléments du cytosquelette. Des études récentes ont également montré que Tau était impliquée dans la motilité des organelles le long des microtubules axonaux. Dans ce mémoire de Maîtrise, nous avons démontré par recouvrement sur gel une nouvelle interaction in vitro pour Tau avec la petite GTPase Rab5, qui est impliquée dans l’endocytose précoce. De plus, nous avons montré que Tau et Rab5 immuno-précipitaient sur une même population de vésicules in vivo. La sur-expression de Tau dans des neurones primaires de l’hippocampe nous a permis de montrer que Tau et Rab5 avaient une distribution similaire dans l’axone des neurones, suggérant un rôle de Tau dans l’ancrage des endosomes précoces sur les microtubules. Par contre, à la différence de ce qui a pu être observé dans certaines études, la sur-expression de Tau n’a pas inhibé le transport axonal des endosomes précoces. Enfin, nous avons montré que Tau interagissait préférentiellement avec la Rab5 active liée au GTP et des résultats préliminaires nous laissent penser que Tau serait un effecteur ou une GAP pour Rab5. Dans les tauopathies, la Tau devient hyperphosphorylée, décroche des microtubules axonaux et forme des agrégats dans le corps cellulaire du neurone. Ces modifications biochimiques et de localisation de la protéine Tau pourraient être la source d’une perte d’interaction de la Tau avec Rab5 et être responsable de certaines atteintes neurologiques observées dans les tauopathies.

Le rôle des récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2 dans le guidage axonal

Au cours du développement, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) voyagent sur de longues distances pour établir des connexions avec leurs cellules cibles. La navigation des cônes de croissance est guidée par différentes molécules chimiotropiques présentes dans leur environnement. Les endocannabinoïdes (eCB) sont d’importants neuromodulateurs qui régulent de manière rétrograde la fonction de nombreuses synapses du cerveau. Ils agissent principalement par le biais de leurs récepteurs liés à une protéine Gi/o CB1 (CB1R) et CB2 (CB2R). La présence des eCBs durant le stade fœtal et la période postnatale suggère leur implication dans des événements régulant le développement du système nerveux. Cette thèse confirme l’expression des récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2 ainsi que l’enzyme dégradant les eCBs lors du développement embryonnaire et perinatal des CGRs et de la voie rétinothalamique in vivo. La manipulation pharmacologique de l’activité de CB1R et CB2R réorganise la morphologie du cône de croissance des CGRs et des neurones corticaux in vitro. De plus, la stimulation locale avec un agoniste de CB1R ou de CB2R modifie le comportement du cône de croissance entraînant sa répulsion. CB1R et CB2R modulent par le biais de la voie de signalisation AMPc/PKA, la mobilisation de DCC à la membrane plasmique. Par ailleurs, les résultats de cette recherche démontrent également l’implication de CB1R et CB2R dans la ségrégation des projections ipsi- et controlatérales et le développement de la voie rétinothalamique.

Évaluation gastro-intestinale chez des chiens présentant un comportement de léchage excessif de surface

L’objectif de cette étude était de démontrer que le léchage excessif de surface (LES) chez le chien représente un signe clinique d’un trouble digestif sous-jacent plutôt qu’un trouble obsessionnel compulsif. Vingt chiens présentés pour LES (groupe L) ont été divisés en 2 sous-groupes de 10 chiens chacun : L0, sans, et LD, avec des signes cliniques digestifs concomitants. Dix chiens en santé ont été assignés à un groupe contrôle (groupe C). Une évaluation comportementale complète, un examen physique et neurologique ont été réalisés avant un bilan diagnostic gastro-intestinal (GI) complet (hématologie, biochimie, analyse urinaire, mesure des acides biliaires pré et post-prandiaux et de l’immunoréactivité spécifique de la lipase pancréatique canine, flottaison fécale au sulfate de zinc, culture de selles, échographie abdominale et endoscopie GI haute avec prise de biopsies). En fonction des résultats, un interniste recommandait un traitement approprié. Les chiens étaient suivis pendant 90 jours durant lesquels le comportement de léchage était enregistré. Des troubles GI ont été identifiés chez 14/20 chiens du groupe L. Ces troubles GI sous-jacents incluaient une infiltration éosinophilique du tractus GI, une infiltration lymphoplasmocytaire du tractus GI, un retard de vidange gastrique, un syndrome du côlon irritable, une pancréatite chronique, un corps étranger gastrique et une giardiose. Une amélioration >50% en fréquence ou en durée par rapport au comportement de léchage initial a été observée chez une majorité de chiens (56%). La moitié des chiens ont complètement cessé le LES. En dehors du LES, il n’y avait pas de différence significative de comportement (p.ex. anxiété), entre les chiens L et les chiens C. Les troubles GI doivent être considérés dans le diagnostic différentiel du LES chez le chien.

Étude ultrastructurale et développementale du récepteur EphA4 dans l’hippocampe du rat

Afin de mieux comprendre l’évolution des fonctions du récepteur EphA4 pendant le développement du système nerveux central (SNC), nous avons étudié sa localisation cellulaire et subcellulaire dans l’hippocampe du rat, d’abord chez l’adulte, puis pendant le développement postnatal, ainsi que ses rôles potentiels dans la genèse, la migration ou la maturation des cellules granulaires dans l’hippocampe adulte. Pour ce faire, nous avons utilisé la méthode d’immunocytochimie en microscopie photonique, électronique et confocale. En microscopie photonique, une forte immunoréactivité (peroxydase/DAB) pour EphA4 est observée aux jours 1 et 7 suivant la naissance (P1 et P7) dans les couches de corps cellulaires, avec un marquage notamment associé à la surface des corps cellulaires des cellules granulaires et pyramidales, ainsi que dans les couches de neuropile du gyrus dentelé et des secteurs CA3 et CA1. L’intensité du marquage diminue progressivement dans les couches de corps cellulaires, entre P7 et P14, pour devenir faible à P21 et chez l’adulte, tandis qu’elle persiste dans les couches de neuropile, sauf celles qui reçoivent des afférences du cortex entorhinal. En microscopie électronique, après marquage à la peroxydase/DAB, EphA4 décore toute la surface des cellules pyramidales et granulaires, du corps cellulaire jusqu’aux extrémités distales, entre P1 et P14, pour devenir confiné aux extrémités synaptiques, c’est-à-dire les terminaisons axonales et les épines dendritiques, à P21 et chez l’adulte. À la membrane plasmique des astrocytes, EphA4 est redistribué comme dans les neurones, marquant le corps cellulaire et ses prolongements proximaux à distaux, à P1 et P7, pour devenir restreint aux prolongements périsynaptiques distaux, à partir de P14. D’autre part, des axones en cours de myélinisation présentent souvent une forte immunoréactivité punctiforme à leur membrane plasmique, à P14 et P21. En outre, dans les neurones et les astrocytes, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi et les vésicules de transport, organelles impliquées dans la synthèse, la modification posttraductionnelle et le transport des protéines glycosylées, sont aussi marqués, et plus intensément chez les jeunes animaux. Enfin, EphA4 est aussi localisé dans le corps cellulaire et les dendrites des cellules granulaires générées chez l’adulte, au stade de maturation où elles expriment la doublecortine (DCX). De plus, des souris adultes knockouts pour EphA4 présentent des cellules granulaires DCX-positives ectopiques, c’est-à-dire positionnées en dehors de la zone sous-granulaire, ce qui suggère un rôle d’EphA4 dans la régulation de leur migration. Ces travaux révèlent ainsi une redistribution d’EphA4 dans les cellules neuronales et gliales en maturation, suivant les sites cellulaires où un remodelage morphologique s’effectue : les corps cellulaires lorsqu’ils s’organisent en couches, les prolongements dendritiques et axonaux pendant leur croissance, guidage et maturation, puis les épines dendritiques, les terminaisons axonales et les prolongements astrocytaires distaux associés aux synapses excitatrices, jusque chez l’adulte, où la formation de nouvelles synapses et le renforcement des connexions synaptiques existantes sont exercés. Ces localisations pourraient ainsi correspondre à différents rôles d’EphA4, par lesquels il contribuerait à la régulation des capacités plastiques du SNC, selon le stade développemental, la région, l’état de santé, ou l’expérience comportementale de l’animal.

Régulation du cycle cellulaire par le récepteur natriurétique de type C dans les cellules du muscle lisse vasculaire : mécanismes moléculaires

Nous avons précédemment montré que l’activation du récepteur natriurétique de type C (NPR-C) par son agoniste spécifique, le C-ANP4-23, atténue l’augmentation de la prolifération des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) induite par les peptides vasoactifs (Ang II, ET-1 et l’AVP). Puisque les CMLV provenant de rats spontanément hypertendus (SHR) montrent elles aussi un taux de prolifération plus élevé que leur contrôle, les CMLV de rats Wystar-Kyoto (WKY), nous avons entrepris cette étude dans le but de déterminer si C-ANP4-23 peut également diminuer le taux élevé de prolifération des CMLV de SHR et, le cas échéant déterminer les mécanismes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que le taux de prolifération des CMLV de SHR est significativement plus élevé que celui des CMLV de WKY et que la présence de C-ANP4-23 diminue de manière-dose dépendante le taux de prolifération des CMLV de SHR. En plus, l’expression des protéines de la phase G1 du cycle cellulaire, la cycline D1, la kinase dépendante des cyclines 2 (cdk2) et la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome (pRb) est augmentée dans les CMLV de SHR comparativement aux CMLV de WKY et est atténué par C-ANP4-23. De plus, nos résultats montrent que les inhibiteurs du complexe cycline D1/cdk4 (NSC 625987) et cdk2 (NU2058) diminue le taux de prolifération élevé des CMLV de SHR. Les CMLV de SHR montrent également un taux de phosphorylation de ERK1/2 et d’AKT et est atténué par C-ANP4-23. De plus, le taux d’expression élevé des protéines cycline D1, cdk2 et pRb des CMLV de SHR est diminué par la toxine pertussis qui inactive la protéine Giα, le PD 98095, un inhibiteur de MEK de la voie des MAPK, du wortmannin, un inhibiteur de la PI3-K et finalement du losartan, un antagoniste du récepteur AT1. Ces résultats suggèrent que l’activation du récepteur NPR-C par C-ANP4-23 diminue le taux de prolifération élevé des CMLV de SHR par une régulation à la baisse des composantes du cycle cellulaire via l’inhibition de la protéine Giα et des voies signalétique MAP kinase/PI3-K.

Couplage du récepteur à sept domaines transmembranaires GABA-B1 aux voies intracellulaires de signalisation en absence de GABA-B2

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs.