Epithelial-Mesenchymal-Transition : a proposed mechanism in the development of Bronchiolitis Obliterans

La transplantation pulmonaire pour les patients avec une maladie pulmonaire en phase terminale est leur seul espoir de survie. Malheureusement, certains greffés du poumon rencontrent des difficultés après la transplantation du poumon, dont l'un est le rejet chronique du greffon pulmonaire également connu histologiquement comme la bronchiolite oblitérante et cliniquement comme syndrome de bronchiolite oblitérante. L'étiologie exacte de la BO reste mal comprise. Certaines hypothèses suggèrent l'implication des cellules épithéliales dans le processus de remodelage des voies respiratoires, conduisant à l'obstruction des voies aériennes. Un des mécanismes proposés est un processus de transition, connue sous le nom de transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM). Lors de ce processus, les cellules perdent leurs propriétés épithéliales, acquièrent un phénotype mésenchymateux et deviennent plus mobiles et envahissantes. Cette transformation leur permet de participer activement au processus de remodelage bronchique dans la bronchiolite oblitérante. L’induction de la TEM peut être due à certains facteurs tels que l'inflammation et l'apoptose. Le principal objectif de ce travail de maîtrise est de détecter in vivo la présence de la TEM dans des biopsies transbronchiques obtenues chez des greffés et de l’associer à leurs conditions cliniques. Le deuxième objectif est d'induire la TEM in vitro dans les cellules épithéliales des petites voies aériennes à l'aide de milieux conditionnés apoptotiques et non apoptotiques produits par les cellules endothéliales microvasculaires humaines du poumon. D’autre part, nous avons évalué si des médiateurs connus pour participer au processus de TEM tels que le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF)et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-beta) ainsi que le perlecan sont présents dans les milieux conditionnés utilisés.

Implication de l'endosome de recyclage dans la migration cellulaire in vivo

Au cours de l’ovogenèse chez la mouche du vinaigre: Drosophila melanogaster, un groupe de cellules folliculaires appelées cellules de bord, migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Cet événement, nécessitant la transition épithélio- mésenchymateuse (TEM), la réorientation, puis l’arrêt, ressemble à la formation de métastases. L’endocytose est un régulateur clé de plusieurs événements polarisés, y compris la migration cellulaire. En effet, différentes protéines impliquées dans la migration, comme les intégrines et les E-cadhérines (cadhérines épithéliales), sont régulées par transport à travers les endosomes. De même, l’endocytose restreint au front de migration l’activité des récepteurs tyrosine kinases (RTKs) qui guident les cellules de bord dans leur mouvement. Cependant les mécanismes moléculaires de cette restriction spatiale de l’activité des RTKs demeurent largement inconnus. Nous avons testé l’implication du trafic vésiculaire à travers la machinerie d’endocytose, dans la migration dirigée des cellules de bord, car ce système est facilement accessible pour l’expression de protéines et l’analyse de mutants. Nous avons commencé par confirmer une observation précédente du rôle de l’endosome précoce dans la migration des cellules de bord. Ensuite, nous avons identifié l’endosome de recyclage (ER) comme un régulateur clé de cette migration. En effet, nous avons démontré que l’expression dans les cellules de bord d’une forme dominante négative de Rab11, la petite GTPase régulant le transport vésiculaire à travers l’ER, bloque la migration ou entraîne de sévères défauts de migration dans environ 80% des chambres d’œufs examinées. De plus, nous observons par immunofluorescence une relocalisation de l’activité des RTKs alors que d’autres protéines de migration ne sont pas affectées par Rab11 dominant négatif. Ce résultat a été par la suite confirmé par une interaction génétique entre Rab11 et les RTKs. D’autre part, nous avons montré que le complexe exocyste, un effecteur de Rab11, est impliqué dans la migration des cellules de bord. Nous avons trouvé par microscopie confocale en tissu fixé et par microscopie en temps réel que Sec15, un composant de ce complexe, est polarisé, de façon Rab11- dépendante, dans des vésicules qui s’accumulent au front de migration tout au long du mouvement des cellules de bord. De plus, la perte de l’activité de Sec15 perturbe à son tour la migration. Ainsi, toutes ces données démontrent le rôle fondamental d’un cycle d’endo- exocytose dans le maintien des RTKs actifs au niveau du front de migration des cellules de bord le long de leur mouvement.

Rôle des eicosanoïdes post-greffe : implication dans la bronchiolite oblitérante

Le rejet chronique se manifeste dans le poumon par la bronchiolite oblitérante (BO), une pathologie inflammatoire et fibrotique menant à l’oblitération des bronchioles. L’étiologie exacte de cette maladie demeure inconnue. Certaines études suggèrent qu'un déséquilibre des leucotriènes (LT) sur les prostaglandines (PG) favorise la fibrose pulmonaire. Les taux des LT et des PG dans le poumon humain post-transplantation sont inconnus. Nous proposons qu'un déséquilibre de cystéinyl leucotriènes (CysLT) sur la PGE2 existe dans le poumon transplanté et pourrait être impliqué dans la pathogenèse de la BO. Aussi, les leucotriènes contribueraient à la fibrose par la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). Afin de vérifier ces hypothèses, nous avons déterminé les taux de CysLT et de PGE2 dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) provenant de poumons transplantés chez l'homme ainsi que leurs corrélations cliniques. Nous avons également déterminé la capacité des CysLT à induire l’expression des marqueurs de la TEM in vitro. Nous avons découvert des taux de CysLT et PGE2 supérieurs à la normale dans les LBA des greffés. Un pic prédominant de CysLT sur PGE2 est observée à 52 semaines postgreffe et deux facteurs de risque de la BO, les infections au CMV et à l’Aspergillus, sont associés au ratio CysLT/PGE2> 1. In vitro, les CysLT induisent une répression des marqueurs épithéliaux mais n’induisent pas l’expression de marqueurs mésenchymateux chez les cellules épithéliales bronchiolaires.

Implications physiopathologiques de la Nestine lors du remodelage pulmonaire et cardiaque à la suite de l’infarctus du myocarde, du diabète et de l’hypertension pulmonaire

Il est reconnu que la protéine filamenteuse intermédiaire Nestine est exprimée lors du processus de cicatrisation et du remodelage fibrotique. De plus, nous avons identifié l’expression de la Nestine au sein de deux populations distinctes qui sont directement impliquées dans les réponses de fibroses réparative et réactive. Ainsi, une population de cellules souches neurales progénitrices résidentes du coeur de rat adulte exprime la Nestine et a été identifiée à titre de substrat de l’angiogenèse et de la neurogenèse cardiaque. Également, la Nestine est exprimée par les myofibroblastes cicatriciels cardiaques et il a été établi que la protéine filamenteuse intermédiaire joue un rôle dans la prolifération de ces cellules. Ainsi, l’objectif général de cette thèse était de mieux comprendre les évènements cellulaires impliqués dans la réponse neurogénique des cellules souches neurales progénitrices résidentes cardiaques Nestine(+) (CSNPRCN(+)) lors de la fibrose réparative cardiaque et d’explorer si l’apparition de fibroblastes Nestine(+) est associée avec la réponse de fibrose réactive secondaire du remodelage pulmonaire. Une première publication nous a permis d’établir qu’il existe une régulation à la hausse de l’expression de la GAP43 (growth associated protein 43) et que cet événement transitoire précède l’acquisition d’un phénotype neuronal par les CSNPRCN(+) lors du processus de cicatrisation cardiaque chez le rat ayant subi un infarctus du myocarde. De plus, la surimposition de la condition diabétique de type 1, via l’injection unique de Streptozotocine chez le rat, abolit la réponse neurogénique des CSNPRCN(+), qui est normalement induite à la suite de l’ischémie cardiaque ou de l’administration de 6-hydroxydopamine. Le second article a démontré que le développement aigu de la fibrose pulmonaire secondaire de l’infarctus du myocarde chez le rat est associé avec une augmentation de l’expression protéique de la Nestine et de l’apparition de myofibroblastes pulmonaires Nestine(+). Également, le traitement de fibroblastes pulmonaires avec des facteurs de croissances peptidiques pro-fibrotiques a augmenté l’expression de la Nestine par ces cellules. Enfin, le développement initial de la condition diabétique de type 1 chez le rat est associé avec une absence de fibrose réactive pulmonaire et à une réduction significative des niveaux protéiques et d’ARN messager de la Nestine pulmonaire. Finalement, la troisième étude représentait quant à elle un prolongement de la deuxième étude et a alors examiné le remodelage pulmonaire chronique chez un modèle établi d’hypertension pulmonaire. Ainsi, les poumons de rats adultes mâles soumis à l’hypoxie hypobarique durant 3 semaines présentent un remodelage vasculaire, une fibrose réactive et une augmentation des niveaux d’ARN messager et de la protéine Nestine. De plus, nos résultats ont démontré que la Nestine, plutôt que l’alpha-actine du muscle lisse, est un marqueur plus approprié des diverses populations de fibroblastes pulmonaires activés. Également, nos données suggèrent que les fibroblastes pulmonaires activés proviendraient en partie de fibroblastes résidents, ainsi que des processus de transition épithélio-mésenchymateuse et de transition endothélio-mésenchymateuse. Collectivement, ces études ont démontré que des populations distinctes de cellules Nestine(+) jouent un rôle majeur dans la fibrose réparative cardiaque et la fibrose réactive pulmonaire.

Modulation of epithelial sodium channel (ENaC) expression in mouse lung infected with Pseudomonas aeruginosa

Affiliation: André Dagenais: Centre hospitalier de l'Université de Montréal/ Hôtel-Dieu, Département de médecine, Université de Montréal. Yves Berthiaume: Médecine et spécialités médicales, Faculté de médecine

Formation and differentiation of multiple mesenchymal lineages during lung development is regulated by {beta}-catenin signaling.

BACKGROUND: The role of ss-catenin signaling in mesodermal lineage formation and differentiation has been elusive. METHODOLOGY: To define the role of ss-catenin signaling in these processes, we used a Dermo1(Twist2)(Cre/+) line to target a floxed beta-catenin allele, throughout the embryonic mesenchyme. Strikingly, the Dermo1(Cre/+); beta-catenin(f/-) conditional Knock Out embryos largely phenocopy Pitx1(-/-)/Pitx2(-/-) double knockout embryos, suggesting that ss-catenin signaling in the mesenchyme depends mostly on the PITX family of transcription factors. We have dissected this relationship further in the developing lungs and find that mesenchymal deletion of beta-catenin differentially affects two major mesenchymal lineages. The amplification but not differentiation of Fgf10-expressing parabronchial smooth muscle progenitor cells is drastically reduced. In the angioblast-endothelial lineage, however, only differentiation into mature endothelial cells is impaired. CONCLUSION: Taken together these findings reveal a hierarchy of gene activity involving ss-catenin and PITX, as important regulators of mesenchymal cell proliferation and differentiation.

Role of nucleotides on lung epithelial cells : mechanism of release and development of a side-view microscopic chamber to study nucleotide-dependent airway surface liquid height

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Escherichia coli STb toxin induces apoptosis in intestinal epithelial cell lines

La toxine stable à la chaleur de type b (STb) est une des toxines produites par les souches Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) impliquée dans le développement de la diarrhée. Une étude antérieure par Goncalves et al. (2009) a démontré que les cellules ayant internalisé la toxine STb démontraient une morphologie qui rappelle l’apoptose. Le changement du potentiel membranaire observé par Goncalves et al. (2009) nous a incité à vérifier la capacité de la toxine STb à induire l’apoptose des cellules HRT-18 et IEC-18 par la voie intrinsèque. Les cellules HRT-18 et IEC-18 ont été traitées avec de la toxine purifiée pour une durée de 24 heures puis ells ont été récoltées et examinées pour des caratéristiques de l’apoptose. L’activation des caspases-9 et -3, mais pas de la caspase-8, a été observée dans les deux lignées cellulaires à l’aide des substrats fluorescents spécifiques pour chaque caspase. L’ADN extrait des cellules HRT-18 et IEC-18 a révélé une fragmentation lorsque migré sur gel d’agarose. La condensation et la fragmentation des noyaux ont été observées en microscopie à fluorescence suite à une coloration de l’ADN au Hoechst 33342. Les indices apoptotiques des cellules HRT-18 et IEC-18 traitées avec des quantités croissantes de STb montrent une dose-réponse pour les deux lignées. L’activation de la caspase-9 est une indication que la voie intrinsèque de l’apoptose est activée dans les cellules HRT-18 et IEC-18. L’absence de l’activation de la caspase-8 démontre que la voie extrinsèque n’est pas impliquée dans la mort cellulaire médiée par STb.

Elucidating the crosstalk between condensin subunits and its relevance in chromosome condensation

ADN subit une série de transformations structurelles complexes au cours de la division cellulaire, ce qui entraîne dans son compactage chromosomes mitotiques par un processus appelé la condensation des chromosomes. Le complexe de condensine pentamérique est fortement impliqué comme un effecteur majeur de ce phénomène. Il s'agit d'un complexe protéine de sous-unités multiples avec deux sous-unités catalytiques [SMC- Structural Maintenance of Chromosomes] et de trois sous-unités de régulation, hautement conservés de la levure à l'homme. Le complexe de condensine dans Saccharomyces cerevisiae est constitué de deux sous-unités de SMC [Smc2 et Smc4] et trois protéines non réglementaires [Brn1, Ycs4, Ycg1]. Malgré son importance, le mécanisme d'action de condensine reste largement inconnu. Par conséquent, l'objectif de cette recherche est de comprendre le mécanisme d'action de condensine et comment elle est affectée par l'interaction entre ses sous-unités réglementaires et non-réglementaires. Cette thèse identifie quatre morphologies dépendants du cycle cellulaire distincts du locus d'ADNr. Cette transformation du phénotype ADNr de G1 à la mitose dépend condensine. Afin de déterminer le rôle de l'interaction entre les sous-unités catalytiques et réglementaires de condensine dans la régulation du complexe condensine, nous avons identifié six résidus positifs sur l'extrémité C-terminale de BRN1 qui affectent la formation du complexe condensine, l'activité de la condensation et l'interaction avec tubuline, ce qui suggère que ces résidus ont un rôle dans la régulation de condensine. Ensemble, nos résultats suggèrent un modèle de règlement du condensine par l'interaction entre les sous-unités de condensine.

Étude de l’immunité mucosale génitale chez des femmes béninoises hautement exposées au VIH-1 séronégatives (HESN) et séropositives.

Introduction : Aujourd’hui, 35,3 millions de personnes vivent avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 dans le monde ; l’Afrique subsaharienne concentre 70% des nouvelles infections et les femmes en représentent plus de la moitié. Le mode de transmission du VIH le plus répandu est par voie mucosale génitale suite à des relations sexuelles. Le tractus génital féminin (TGF) possède un milieu immunitaire complexe qui doit contrer l’invasion par des pathogènes tout en maintenant la tolérance/contrôle de la flore normale vaginale étant sous la pression de procréation sous influence des hormones sexuelles. De plus, les mécanismes favorisant ou prévenant l’infection du TGF par le VIH ne sont pas précisément identifiés. Hypothèse : Le contexte inflammatoire mucosal génital et la résultante de dialogues intercellulaires tel qu’entre les cellules épithéliales génitales (CEG) et les cellules dendritiques myéloïdes (mDC), qui sont des premières à rencontrer le virus aux portes d’entrée mucosales, modulent l’activité des lymphocytes qui est déterminante dans le type de réponse immunitaire élaborée par l’hôte. Méthodologie : Des spécimens provenant d’une cohorte de travailleuses du sexe (TS) recrutées à Cotonou au Bénin en Afrique subsaharienne ont été analysés. Nous avons caractérisé le milieu mucosal génital féminin hautement exposé au VIH de TS séronégatives (highly exposed seronegative; HESN) en comparaison avec celui de TS séropositives. Brièvement, les liquides cervicaux-vaginaux ont été déterminés par des techniques de multiplexes/Luminex ou par ELISA et le milieu cellulaire a été décrit suite à des analyses de cytométrie en flux (phénotypage et tri cellulaire). Résultats : Nous avons observé la présence augmentée d’un facteur soluble antiviral, immunomodulateur et antiprolifératif sécrété dans le TGF des TS HESN qui est l’interféron (IFN)-α. La présence augmentée de cette cytokine suggère l’existence possible de connexions intercellulaires clés qui pourraient mener à une régulation homéostatique du compartiment immunitaire génital permettant de contrôler l’infection par le VIH-1. En étudiant l’expression de molécules impliquées dans les voies de signalisation associées à la production d’IFN-α dans les CEG et les cellules myéloïdes du TGF, nous avons pu mettre en évidence l’existence d’un microenvironnement présentant un profil «tolérogénique/régulateur» dans le TGF des TS HESN. Conclusion : Nos observations nous ont permis d’élucider certaines hypothèses sur un potentiel mécanisme d’immunité naturelle protecteur chez les TS HESN. De plus, nous sommes des premiers à décrire une population myéloïde présentant des caractéristiques de DC «tolérogéniques» de par leur expression d’interleukine (IL)-10, de human leukocyte antigen (HLA)-G et de immunoglobulin-like transcript (ILT)-4 dans le TGF de TS HESN. Cette étude aura des implications majeures dans le développement de stratégies d’interventions préventives afin de moduler des conditions inflammatoires préexistantes ainsi établissant une défense mucosale rapide et durable contre le VIH-1.

Transcriptional approach to study porcine tracheal epithelial cells individually or dually infected with swine influenza virus and Streptococcus suis

Background: Swine influenza is a highly contagious viral infection in pigs affecting the respiratory tract that can have significant economic impacts. Streptococcus suis serotype 2 is one of the most important post-weaning bacterial pathogens in swine causing different infections, including pneumonia. Both pathogens are important contributors to the porcine respiratory disease complex. Outbreaks of swine influenza virus with a significant level of co-infections due to S. suis have lately been reported. In order to analyze, for the first time, the transcriptional host response of swine tracheal epithelial (NPTr) cells to H1N1 swine influenza virus (swH1N1) infection, S. suis serotype 2 infection and a dual infection, we carried out a comprehensive gene expression profiling using a microarray approach. Results: Gene clustering showed that the swH1N1 and swH1N1/S. suis infections modified the expression of genes in a similar manner. Additionally, infection of NPTr cells by S. suis alone resulted in fewer differentially expressed genes compared to mock-infected cells. However, some important genes coding for inflammatory mediators such as chemokines, interleukins, cell adhesion molecules, and eicosanoids were significantly upregulated in the presence of both pathogens compared to infection with each pathogen individually. This synergy may be the consequence, at least in part, of an increased bacterial adhesion/invasion of epithelial cells previously infected by swH1N1, as recently reported. Conclusion: Influenza virus would replicate in the respiratory epithelium and induce an inflammatory infiltrate comprised of mononuclear cells and neutrophils. In a co-infection situation, although these cells would be unable to phagocyte and kill S. suis, they are highly activated by this pathogen. S. suis is not considered a primary pulmonary pathogen, but an exacerbated production of proinflammatory mediators during a co-infection with influenza virus may be important in the pathogenesis and clinical outcome of S. suis-induced respiratory diseases.

Capsular sialic acid of Streptococcus suis serotype 2 binds to swine influenza virus and enhances bacterial interactions with virus-infected tracheal epithelial cells.

Streptococcus suis serotype 2 is an important swine bacterial pathogen, and it is also an emerging zoonotic agent. It is unknown how S. suis virulent strains, which are usually found in low quantities in pig tonsils, manage to cross the first host defense lines to initiate systemic disease. Influenza virus produces a contagious infection in pigs which is frequently complicated by bacterial coinfections, leading to significant economic impacts. In this study, the effect of a preceding swine influenza H1N1 virus (swH1N1) infection of swine tracheal epithelial cells (NTPr) on the ability of S. suis serotype 2 to adhere to, invade, and activate these cells was evaluated. Cells preinfected with swH1N1 showed bacterial adhesion and invasion levels that were increased more than 100-fold compared to those of normal cells. Inhibition studies confirmed that the capsular sialic acid moiety is responsible for the binding to virus-infected cell surfaces. Also, preincubation of S. suis with swH1N1 significantly increased bacterial adhesion to/invasion of epithelial cells, suggesting that S. suis also uses swH1N1 as a vehicle to invade epithelial cells when the two infections occur simultaneously. Influenza virus infection may facilitate the transient passage of S. suis at the respiratory tract to reach the bloodstream and cause bacteremia and septicemia. S. suis may also increase the local inflammation at the respiratory tract during influenza infection, as suggested by an exacerbated expression of proinflammatory mediators in coinfected cells. These results give new insight into the complex interactions between influenza virus and S. suis in a coinfection model.

Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect

Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral “oncolysis”, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.