Comparison of a leukocyte esterase test with endometrial cytology for the diagnosis of subclinical endometritis and correlation with first service pregnancy rate in postpartum Holstein cows

L’objectif de la présente étude était d’évaluer un test d’estérase leucocytaire (LE) pour le diagnostic de l’endométrite subclinique chez les vaches Holstein en période postpartum. Les tests effectués à partir d’échantillons provenant soit de l’endomètre (UtLE) ou du col utérin (CxLE) ont été comparés à la cytologie endométriale (CE). Par ailleurs, deux méthodes d’évaluation des lames ont été comparées. Deux cent quatre vingt-cinq vaches Holstein de 5 troupeaux laitiers commerciaux ont été évaluées entre 21 et 47 jours en lait (JEL). Soixante sept vaches ont été diagnostiquées avec une endométrite clinique suite à un examen transrectal et vaginoscopique et ont été exclues de l’étude. Deux cent dix-huit vaches ont eu des prélèvements pour la CE et le test LE. La fonction ovarienne a été déterminée à la palpation transrectale. La banque de données utilisée pour chacune des vaches a été effectuée à partir du logiciel DSA (Dossier de Santé Animale) laitier. Le pourcentage de neutrophiles était significativement corrélé avec les scores de LE utérin et cervical. L’activité de CxLE et UtLE diminuait significativement avec les JEL, mais n’était pas associée au risque de gestation à 90 JEL (n= 186). Le pourcentage de neutrophiles mesuré à la CE entre 32 et 47 JEL était associé significativement au risque de gestation à 90 JEL (n=94, P=0.04). Pour la même période, selon une analyse de survie, les vaches avec >2,6% de neutrophiles à la CE étaient définies comme étant atteintes d’une endométrite subclinique avec une prévalence de 56%. Les résultats indiquent que le test d’estérase utérin ou cervical a une bonne concordance avec le pourcentage de neutrophiles à la CE. Une endométrite subclinique diagnostiquée par cytologie endometriale entre 32 et 47 JEL est associée à une réduction du risque de gestation au premier service.

Effect of interferon-TAU protein secretion in bovine endometrial cells and its modulation by steroid hormones

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Analyse de la fertilité des vaches laitières Holstein «Repeat Breeder»

L’importance de la problématique des vaches laitières non gestantes avec multiples inséminations (› 3) communément appelées « Repeat Breeder » (RB), au Québec, repose sur deux facteurs: son incidence et son impact économique. Actuellement, l’incidence du syndrome RB au Québec est de ± 25% (Rapport annuel, juin 2008, www.dsahr.ca). Les pertes monétaires associées à ce problème proviennent des frais vétérinaires et d’insémination, de la diminution de productivité ainsi que des pertes en lien avec la réforme involontaire. Afin d’avoir de meilleures connaissances sur ce syndrome, nous devons connaître les facteurs de risques généraux impliqués et ensuite explorer la condition individuelle de ces vaches problèmes. Dans la première partie de ce mémoire, une banque de données informatisées répertoriant 418 383 lactations fut analysée. L’objectif de ce projet de recherche était d’évaluer l’impact des problèmes reproducteurs post-partum et l’effet du nombre de lactations comme facteurs de risques de la vache Repeat Breeder. L’analyse a permis d’établir la dystocie comme étant la condition ayant le plus de conséquences sur la fertilité future. D’autres facteurs de risques à savoir le nombre de lactations influencent le pronostic reproducteur. La deuxième partie de ce mémoire consistait à explorer, à l’aide d’outils cliniques, la condition individuelle des vaches RB. Une étude cohorte fut menée sur des vaches Holstein en fin de période d’attente volontaire au jour 7 du cycle oestral. Les tests cliniques étudiés furent la vaginoscopie, l’examen transrectal, l’ultrasonographie du système reproducteur, la présence d’estérases leucocytaires, la bactériologie et la biochimie du liquide utérin, la cytologie endométriale et le profil de progestérone sérique. Les résultats de ces tests cliniques dévoilent que l’examen bactériologique du liquide utérin est révélateur du statut reproducteur futur.

Expression of steroidogenic proteins and genes in bovine placenta from conventional and somatic cell nuclear transfer (SCNT) gestations

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus.

Régulation dynamique de l’activité du récepteur des estrogènes beta (ERβ) par la phosphorylation,l’ubiquitination et la sumoylation

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs.

Effet d'un traitement intra-utérin de céphapirine sur les performances en reproduction des vaches laitières

La reproduction est un pilier majeur de la productivité des fermes laitières. Dans ce contexte, il est pertinent d’identifier à l’avance les animaux à risque d’avoir des performances en reproduction sous-optimales, surtout si un traitement efficace est disponible pour améliorer ces performances. Les endométrites clinique et subclinique sont des conditions définies selon leur impact sur les performances en reproduction subséquentes et donc, des outils très intéressants de surveillance de la santé utérine. Le premier objectif de cette étude était de déterminer simultanément des seuils diagnostiques pour les endométrites clinique (diagnostiquée par le Metricheck) et subclinique (diagnostiquée par la cytologie endométriale ou par l’estérase leucocytaire) selon leur impact sur les performances en reproduction à la première saillie. L’écoulement vaginal purulent a été identifié comme seuil pour l’endométrite clinique, alors que les seuils identifiés pour l’endométrite subclinique ont été un pourcentage de polymorphonucléaires de 6% à la cytologie et une « forte quantité de leucocytes » à l’estérase leucocytaire. Le second objectif de l’étude était d’évaluer l’effet d’un traitement intra-utérin de céphapirine sur les performances à la première saillie des animaux sains et atteints d’endométrite. Aucun effet du traitement n’a été observé chez les vaches saines ou atteintes d’endométrite clinique, alors qu’une tendance à l’amélioration des performances a été associée au traitement chez celles atteintes d’endométrite subclinique. L’anovulation post-partum prolongée pourrait altérer l’efficacité du traitement de céphapirine, surtout chez les vaches atteintes d’endométrite clinique.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Étude de mortalité de cinq cancers : mélanome cutané, cancer broncho-pulmonaire, leucémie myéloïde chronique, maladie de Hodgkin et cancer de l’endomètre.

Pour chacun des cinq cancers, nous avons fait un rappel de l’épidémiologie en Amérique du Nord, des classifications et des facteurs pronostics, la description des études, l’étude commentée de la mortalité, et enfin la conclusion. L’étude du mélanome cutané a montré que les mélanomes sont assurables dès les premières années aux stades IA, IB, IIA et IIIA, aux stades IIB, IIC et IIIB après cinq ans et au stade IIIC après 15ans. L’étude du cancer broncho-pulmonaire a montré que le cancer à petites cellules n’est pas assurable et que les cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules pourraient être assurables chez les moins de 65 ans aux stades IA à IIIA après dix ans, et chez les 65 ans et plus au stade IA dès les premières années, aux stades IB et IIA après cinq ans et aux stades IIB et IIIA après dix ans L’étude de la leucémie myéloïde chronique a montré l’assurabilité seulement des sujets de plus de 65 ans dès les premières années et des sujets de 60 à 65 ans après 5 ans. L’étude du lymphome de Hodgkin a montré que chez les sujets de moins de 45 ans le stade IA est assurable dès les premières années, les stades IB et IIA le sont après 5 ans et les stades IIB à IVA le sont après 10 ans. Les sujets de 45 à 64 ans aux stades IA et IIA sont assurables dès les premières années et autres stades après 5 ans. Les sujets de 65 ans et plus sont assurables dès les premières années aux stades IA à IIIA et après 5 ans aux autres stades. L’étude du cancer de l’endomètre montre qu’il n’est assurable les cinq premières années que pour le type I au stade I chez les femmes âgées de 45 ans et plus, au stade II chez les femmes de 55 ans et plus et au stade III chez les femmes de 65 ans et plus ; pour le type II au stade I chez les 65 ans et plus, et au stade II chez les 75 ans et plus ; et pour les tumeurs mullériennes malignes mixtes au stade I chez les 65 ans et plus.

Rôle de la qualité des tapis de cellules endométriales en co-culture autologue sur le développement embryonnaire

Introduction : La fécondation in vitro est de mieux en mieux connue et en amélioration constante, cependant les taux d’implantation et de grossesse sont encore bas (environ 35% par fécondation in vitro). Un des enjeux de l’amélioration de la fécondation in vitro est le développement embryonnaire et l’implantation. Pour cela, la co-culture des embryons sur un tapis de cellules endométriales maternelles autologues peut être utilisée pour améliorer le développement embryonnaire (taux d’embryon se développant jusqu’à J5 : blastocyste) et l’implantation. L’objectif de l’étude est d’étudier le lien entre la qualité du tapis cellulaire et le développement embryonnaire. Matériel et méthodes : Cette étude est une sous analyse de l’essai clinique randomisé en double aveugle OvoGen, comparant le taux de blastulation et de grossesse dans deux groupes randomisés : le groupe étude, dans lequel les embryons se développent sur un tapis cellulaire endométrial maternel et le groupe contrôle, dans lequel les embryons sont cultivés dans du milieu conventionnel. Nous avons analysé la qualité des tapis cellulaire du groupe étude (confluence des cellules, taux de cellules épithéliales et vitalité des cellules stromales) par rapport au développement embryonnaire et au taux de grossesse. Résultats : 50 tapis de cellules endométriales maternelles et 291 embryons sur les puits ont été analysés de 2012 à 2015 à la clinique ovo (Montréal, Québec). La qualité des embryons n’était pas changée par la qualité des tapis (p=0,65 pour la confluence, p=0,25 pour le taux de glande et p=0,92 pour la viabilité des cellules). En revanche, le taux de grossesse augmentait quand la confluence diminuait (p=0,022) et lorsque la viabilité des cellules stromales augmentait (p=0,001). De plus, la qualité des tapis était dépendante de la date de la biopsie : la biopsie faite à J7 après l’ovulation permettait une meilleure qualité de puits (confluence augmentée, p=0,045, taux de glande augmenté p=0,004 et viabilité stromales augmentée p=0,001) que la biopsie faite à J5 post ovulation. Discussion : Aucune des nombreuses études sur la co-culture ne porte sur la qualité des tapis cellulaire. Il est intéressant de noter que le taux de grossesse augmente avec la diminution de la confluence et l’augmentation de la viabilité des cellules stromales dans les puits contenant les embryons transférés. Comme il a déjà été démontré, (1)le jour de la biopsie endométriale influe sur la qualité du tapis cellulaire en coculture et pour que celui-ci soit de bonne qualité, il faut que l’endomètre soit réceptif (après J19 du cycle). Conclusion : Nous avons montré que la qualité des tapis cellulaires dépendait du jour de la biopsie d’endomètre et que cette qualité pouvait influencer le bénéfice de la co-culture. Il serait intéressant d’étudier la réceptivité de l’endomètre au moment de la biopsie avant utilisation des cellules en co-culture pour optimiser la qualité du tapis cellulaire.