Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

Exploring Rac GTPase regulation : the molecular mechanisms governing the DOCK180 and ELMO interaction and the role of this complex in Rac-mediated cell migration

Les protéines DOCK180 et ELMO coopèrent ensemble biochimiquement et génétiquement afin d’activer la GTPase Rac1 lors de plusieurs évènements biologiques. Toutefois, le rôle que jouent ces protéines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous émettons l’hypothèse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour l’intégration de la signalisation de Rac plutôt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de façon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protéine d’échafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans l’objectif nº 1, nous démontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site d’interaction principal entre cette protéine et DOCK180. De plus, nous démontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 n’est pas nécessaire pour l’activation de Rac, mais est plutôt essentielle pour faciliter la réorganisation du cytosquelette induite par l’activation de Rac en aval de Dock180. Ces résultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rôles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans l’objectif nº 2, nous avons découvert l’existence d’une homologie structurelle entre ELMO et un module d’autorégulation de la formine Dia1, et avons identifié trois nouveaux domaines dans la protéine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De façon analogue à Dia1, nous avons découvert que ELMO à l’état basal est autoinhibé grâce à des intéractions intramoléculaires. Nous proposons que l’état d’activation des protéines ELMO est régulé de façon similaire aux formines de la famille Dia, c’est-à-dire grâce à des interactions avec d’autres protéines. Dans l’objectif nº 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possède une double spécificité pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons découvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos résultats nous permettent de supposer que d’autres GTPases pourraient être impliquées dans l’activation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu’à l’état basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibée. Bien que le mécanisme d’activation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons découvert que, lorsqu’il y a stimulation cellulaire, certaines GTPases liées au GTP peuvent intéragir avec le domaine RBD de ELMO pour relâcher les contacts intramoléculaires et/ou localiser le complexe à la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir d’ancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de l’activation et de la signalisation de Rac.

Role of NOX2 and DUOX2 in the antiviral airway responses

Les voies respiratoires sont exposées à une panoplie de pathogènes. Lors d’une infection virale respiratoire les cellules qui recouvrent ces voies participent activement à la défense immunitaire contre ces derniers en limitant la propagation du virus et en engendrant une réponse proinflammatoire. Un évènement clef dans ces processus est l’activation des facteurs de transcription, notamment le « Nuclear Factor » (NF)-κB et l’« Interferon Regulatory Factor -3 » (IRF-3), qui régulent l’expression des cytokines antivirales et proinflammatoires. Des données récentes démontrent que les dérivés actifs de l’oxygène (ROS), produits suite à une infection virale, ont la capacité de réguler les voies de signalisation enclenchées par NF-κB et IRF-3. Une source importante de ROS est la famille de NADPH oxydases (NOX), qui contient les membres NOX1-5 et DUOX1 et 2. L’objectif de notre étude était d’identifier la NOX qui régule les mécanismes antiviraux et proinflammatoires suite à l’infection avec le virus respiratoire syncytial (RSV), qui cause des complications respiratoires majeures, et le virus Sendai (SeV), un modèle viral non-pathogène. Nos travaux ont permis d’identifier que NOX2 est une molécule clef dans la réponse proinflammatoire suite à l’infection virale. Plus spécifiquement, NOX2 est important pour l’activation de NF-κB et la sécrétion des cytokines régulées par ce dernier. De plus, nous avons observé une forte augmentation de la présence de DUOX2 dans les cellules de voies respiratoires humaines infectées par SeV. Une étude plus approfondie nous a permis de caractériser qu’une synergie entre deux cytokines secrétées lors de l’infection, soit l’interféron (IFN)β et le TNFα est responsable de l’induction de DUOX2. Nous avons aussi découvert que DUOX2 confère une activité antivirale et est nécessaire pour maintenir les taux des cytokines antivirales tardives IFNβ et IFNλ. Lors d’une infection avec RSV, l’induction de DUOX2 n’est pas détectable. Nous avons mis en évidence que RSV interfère avec l’expression de DUOX2 ce qui pourrait suggérer sa pathogénicité. En conclusion, nos travaux démontrent pour la première fois une implication spécifique des NADPH oxydase NOX2 et DUOX suite aux infections virales respiratoires.

Destins des S-RNases et interactions moléculaires dans le tube pollinique dans le cadre de l’auto-incompatibilité gamétophytique chez Solanum chacoense

L’auto-incompatibilité (AI) est une barrière reproductive prézygotique qui permet aux pistils d’une fleur de rejeter leur propre pollen. Les systèmes d’AI peuvent prévenir l’autofertilisation et ainsi limiter l’inbreeding. Dans l’AI gamétophytique, le génotype du pollen détermine son propre phénotype d’incompatibilité, et dans ce système, les déterminants mâles et femelles de l’AI sont codés par un locus multigénique et multi-allélique désigné le locus S. Chez les Solanaceae, le déterminant femelle de l’AI est une glycoprotéine stylaire extracellulaire fortement polymorphique possédant une activité ribonucléase et désignée S-RNase. Les S-RNases montrent un patron caractéristique de deux régions hypervariables (HVa et HVb), responsables de leur détermination allélique, et cinq régions hautement conservées (C1 à C5) impliquées dans l’activité catalytique ou la stabilisation structurelle de ces protéines. Dans ce travail, nous avons investigué plusieurs caractéristiques des S-RNases et identifié un nouveau ligand potentiel aux S-RNases chez Solanum chacoense. L’objectif de notre première étude était l’élucidation du rôle de la région C4 des S-RNases. Afin de tester l’hypothèse selon laquelle la région C4 serait impliquée dans le repliement ou la stabilité des S-RNases, nous avons généré un mutant dans lequel les quatre résidus chargés présents en région C4 furent remplacés par des résidus glycine. Cette protéine mutante ne s’accumulant pas à des niveaux détectables, la région C4 semble bien avoir un rôle structurel. Afin de vérifier si C4 est impliquée dans une liaison avec une autre protéine, nous avons généré le mutant R115G, dans lequel un acide aminé chargé fût éliminé afin de réduire les affinités de liaison dans cette région. Ce mutant n’affectant pas le phénotype de rejet pollinique, il est peu probable que la région C4 soit impliquée dans la liaison des S-RNases avec un ligand ou leur pénétration à l’intérieur des tubes polliniques. Enfin, le mutant K113R, dans lequel le seul résidu lysine conservé parmi toutes les S-RNases fût remplacé par un résidu arginine, fût généré afin de vérifier si cette lysine était un site potentiel d’ubiquitination des S-RNases. Toutefois, la dégradation des S-RNases ne fût pas inhibée. Ces résultats indiquent que C4 joue probablement un rôle structurel de stabilisation des S-RNases. Dans une seconde étude, nous avons analysé le rôle de la glycosylation des S-RNases, dont un site, en région C2, est conservé parmi toutes les S-RNases. Afin d’évaluer la possibilité que les sucres conjugués constituent une cible potentielle d’ubiquitination, nous avons généré une S11-RNase dont l‘unique site de glycosylation en C2 fût éliminé. Ce mutant se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage, démontrant que l’absence de glycosylation ne confère pas un phénotype de rejet constitutif du pollen. Afin de déterminer si l’introduction d’un sucre dans la région HVa de la S11-RNase pourrait affecter le rejet pollinique, nous avons généré un second mutant comportant un site additionnel de glycosylation dans la région HVa et une troisième construction qui comporte elle aussi ce nouveau site mais dont le site en région C2 fût éliminé. Le mutant comportant deux sites de glycosylation se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage mais, de manière surprenante, le mutant uniquement glycosylé en région HVa peut aussi rejeter le pollen d’haplotype S13. Nous proposons que la forme non glycosylée de ce mutant constitue un allèle à double spécificité, semblable à un autre allèle à double spécificité préalablement décrit. Il est intéressant de noter que puisque ce phénotype n’est pas observé dans le mutant comportant deux sites de glycosylation, cela suggère que les S-RNases ne sont pas déglycosylées à l’intérieur du pollen. Dans la dernière étude, nous avons réalisé plusieurs expériences d’interactions protéine-protéine afin d’identifier de potentiels interactants polliniques avec les S-RNases. Nous avons démontré que eEF1A, un composant de la machinerie de traduction chez les eucaryotes, peut lier une S11-RNase immobilisée sur résine concanavaline A. Des analyses de type pull-down utilisant la protéine eEF1A de S. chacoense étiquetée avec GST confirment cette interaction. Nous avons aussi montré que la liaison, préalablement constatée, entre eEF1A et l’actine est stimulée en présence de la S11-RNase, bien que cette dernière ne puisse directement lier l’actine. Enfin, nous avons constaté que dans les tubes polliniques incompatibles, l’actine adopte une structure agrégée qui co-localise avec les S-RNases. Ces résultats suggèrent que la liaison entre eEF1A et les S-RNases pourrait constituer un potentiel lien fonctionnel entre les S-RNases et l’altération du cytosquelette d’actine observée lors des réactions d’AI. Par ailleurs, si cette liaison est en mesure de titrer les S-RNases disponibles à l’intérieur du tube pollinique, ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi des quantités minimales ou « seuils » de S-RNases sont nécessaires au déclenchement des réactions d’AI.

Rôle de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la régulation du programme angiogénique induit par le VEGF

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique.

Implication de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la perméabilité vasculaire induite par le VEGF

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire.

Rôles de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans l'angiogenèse, la perméabilité vasculaire et la progression tumorale

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale.

Étude du rôle biologique de l'activateur de phosphatase Rrd 1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Structure d'une tagatose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : étude d'une apparente perte de stéréospécificité

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase de classe I qui fait montre d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-biphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-biphosphate (FBP), du sorbose-1,6-biphosphate et du psicose-1,6-biphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution de la structure native et en complexe avec le DHAP, a respectivement 1.87 et 1.92 Å de résolution. Ces mêmes structures ont permis de se représenter plus clairement le site actif de l'enzyme en général, et les résidus catalytiques en particulier. Le trempage des cristaux de TBP aldolase dans une solution saturante de DHAP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire iminium, ainsi que sa géométrie particulière en atteste. Des expériences d'échange de proton, entreprises afin d'évaluer le stéréoisomérisme du transfert de proton catalytique, ont également permis de faire une intéressante découverte : la TBP aldolase ne peut déprotoner le coté pro-R du C3 du DHAP, mais peut le protonner. Ce résultat, ainsi que la comparaison de la structure du complexe TBP aldolase-DHAP avec la structure du complexe FBP aldolase de muscle de lapin- DHAP, pointe vers un isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP. De plus, la résolution de ces deux structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.

L’influence du réseau de chimiokines sur les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH.

Rôles des protéines Staufen 1 et 2 dans la plasticité synaptique des cellules pyramidales hippocampiques

La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes qui demeurent encore incertains quant aux origines cellulaire et moléculaire. Il est maintenant connu que des changements au niveau des synapses, comme la plasticité synaptique, pourraient déterminer la base cellulaire de la formation de la mémoire. Alors que la potentialisation à long-terme (LTP) représente un renforcement de l’efficacité de transmission synaptique, la dépression à long-terme (LTD) constitue une diminution de l’efficacité des connexions synaptiques. Des études ont mis à jour certains mécanismes qui participent à ce phénomène de plasticité synaptique, notamment, les mécanismes d’induction et d’expression, ainsi que les changements morphologiques des épines dendritiques. La grande majorité des synapses excitatrices glutamatergiques se situe au niveau des épines dendritiques et la présence de la machinerie traductionnelle près de ces protubérances suggère fortement l’existence d’une traduction locale d’ARNm. Ces ARNm seraient d’ailleurs acheminés dans les dendrites par des protéines pouvant lier les ARNm et assurer leur transport jusqu’aux synapses activées. Le rôle des protéines Staufen (Stau1 et Stau2) dans le transport, la localisation et dans la régulation de la traduction de certains ARNm est bien établi. Toutefois, leur rôle précis dans la plasticité synaptique demeure encore inconnu. Ainsi, cette thèse de doctorat évalue l’importance des protéines Staufen pour le transport et la régulation d’ARNm dans la plasticité synaptique. Nous avons identifié des fonctions spécifiques à chaque isoforme; Stau1 et Stau2 étant respectivement impliquées dans la late-LTP et la LTD dépendante des récepteurs mGluR. Cette spécificité s’applique également au rôle que chaque isoforme joue dans la morphogenèse des épines dendritiques, puisque Stau1 semble nécessaire au maintien des épines dendritiques matures, alors que Stau2 serait davantage impliquée dans le développement des épines. D’autre part, nos travaux ont permis de déterminer que la morphogenèse des épines dendritiques dépendante de Stau1 était régulée par une plasticité synaptique endogène dépendante des récepteurs NMDA. Finalement, nous avons précisé les mécanismes de régulation de l’ARNm de la Map1b par Stau2 et démontré l’importance de Stau2 pour la production et l’assemblage des granules contenant les transcrits de la Map1b nécessaires pour la LTD dépendante des mGluR. Les travaux de cette thèse démontrent les rôles spécifiques des protéines Stau1 et Stau2 dans la régulation de la plasticité synaptique par les protéines Stau1 et Stau2. Nos travaux ont permis d’approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes de régulation des ARNm par les protéines Staufen dans la plasticité synaptique. MOTS-CLÉS EN FRANÇAIS: Staufen, hippocampe, plasticité synaptique, granules d’ARN, traduction, épines dendritiques.

Therapeutic potential of endothelin receptor type A and bradykinin receptor B1 dual antagonism in osteoarthritis treatment

Nous avons préalablement démontré que l'endothéline-1 (ET-1), un peptide vasoconstricteur de 21 acides aminés, joue un rôle central dans le métabolisme des tissus articulaires et a des fonctions cataboliques sur le cartilage articulaire dans l'ostéoarthrose, en liant son récepteur de type A (ETA). Suite à la relâche du nonapeptide vasodilatateur bradykinine (BK), et l'augmentation d'expression du récepteur B1 des kinines (BKB1), ces médiateurs engendrent un cycle d'inflammation, une destruction du cartilage, et une douleur articulaire. Lors de cette étude, l'efficacité thérapeutique des antagonistes spécifiques du ETA et/ou BKB1 dans un modèle animal d'ostéoarthrose a été testée. Notre hypothèse est que l'antagonisme va diminuer la progression de la pathologie et de la douleur articulaire. L'ostéoarthrose a été induite chez des rats par rupture chirurgicale du ligament croisé antérieur. Les animaux ont été traités par injections intra articulaire hebdomadaires des antagonistes peptidiques spécifiques du ETA et/ou BKB1. La douleur articulaire a été évaluée par le test d'incapacitance statique durant les deux mois postopératoires ; la morphologie articulaire a été examinée post mortem par radiologie et histologie. On constate que le traitement a diminué la douleur et a préservé la morphologie articulaire ; la double inhibition a été plus efficace que la simple inhibition. En conclusion, l'antagonisme double d'ETA et BKB1 améliore la douleur chronique et prévient la dégradation articulaire dans l'ostéoarthrose, ce qui suggère que ces récepteurs peuvent être des cibles thérapeutiques potentiels pour le traitement de cette pathologie.

Rôle différentiel des cellules épithéliales intestinales et pulmonaires dans le recrutement des cellules Th17 vers les sites de réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1

L’infection à VIH-1 est associée à une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales (GALT, gut-associated lymphoid tissues). Ceci conduit à la translocation microbienne, qui est une cause d’activation immunitaire chronique et de progression de la maladie. Les cellules épithéliales (CE) jouent un rôle critique dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie au niveau des muqueuses intestinales via le recrutement des cellules de l’immunité innée (e.g., neutrophiles) et adaptative (e.g., cellules Th17). Les neutrophiles produisent des molécules antivirales (e.g., défensines-) et ont la capacité de limiter la réplication virale au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 jouent un double rôle lors de l’infection à VIH. Elles contribuent d’une part à la défense contre différents pathogènes opportunistes en augmentant, via la production d’IL-17, la capacité des CE à attirer les cellules Th17 et les neutrophiles. D’autre part, les cellules Th17 jouent un rôle délétère en tant que cibles de réplication virale et sources de cytokines pro-inflammatoires. La fréquence des cellules Th17 est diminuée dans les GALT mais pas dans les poumons des patients infectés par le VIH, suggérant qu’il existe des mécanismes différents par lesquels les cellules Th17 sont recrutées vers ces sites anatomiques. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle le VIH interfère avec la capacité des CE intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 et des neutrophiles. Nous avons démontré que les CE intestinales et pulmonaires produisent des CK spécifiques pour les cellules Th17 (CCL20) et les neutrophiles (CXCL8) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IL-1 et le TNF-. Le TNF- agit en synergie avec l’IL-17, un « signal de danger » récemment identifié, et augmente la capacité des CE intestinales mais pas pulmonaires à produire la chimiokine CCL20. Cette synergie s’explique par l’augmentation préférentielle de l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des CE intestinales suite à la stimulation par le TNF-. L’exposition au VIH n’affecte pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les CE intestinales, mais altère la capacité des CE alvéolaires à produire ces chimiokines en accord avec la permissivité sélective de ces dernières à l’infection par le VIH. En conclusion, nos résultats démontrent que (i) le VIH n’interfère pas directement avec la capacité des CE intestinales à recruter des cellules Th17 et des neutrophils et que (ii) la production de CCL20 par ces cellules est dépendantes de la synergie entre le TNF- et l’IL-17. Ainsi, la déplétion des cellules Th17 et la pénurie en IL-17 dans les GALT des sujets infectés pourrait causer de façon préférentielle des altérations fonctionnelles au niveau des CE intestinales, se traduisant par l’altération du recrutement des cellules Th17 en réponse au CCL20.

The BTB/POZ Transcription Factor Miz-1 Is Required To Regulate The Commitment, Survival And Differentiation Of Early B And T Cell Lineages

Les lymphocytes B et T sont issus de cellules progénitrices lymphoïdes de la moelle osseuse qui se différencient grâce à l’action de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont l’interleukine-7 (IL-7)/IL-7 récepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprimé par les cellules lymphoïdes et contrôle leur croissance et leur différenciation. Cette régulation transcriptionnelle peut être coordonnée par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet était de comprendre les mécanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le développement des lymphocytes B et T. Pour réaliser ce projet, des souris déficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris à allèles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empêche l’interaction avec Miz-1, ont été générées. La caractérisation des souris Miz 1POZ a démontré que l’inactivation de Miz-1 perturbe le développement des lymphocytes B et T aux stades précoces de leur différenciation qui dépend de l’IL-7. L’analyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montré que ces cellules surexpriment la protéine inhibitrice SOCS1 qui empêche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la régulation à la hausse de la protéine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrôle son activité. En plus de contrôler l’axe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spécifiquement aux stades précoces du développement afin d’assurer la survie des progéniteurs B et T, Miz-1 régule l’axe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux nécessaires pour la différenciation des cellules immatures. La caractérisation des souris c-MycV394D a montré, quant à elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indépendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un défaut de différenciation additionnel au niveau de la -sélection, étape où les signaux initiés par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifération et la différenciation des thymocytes en stades plus matures. À cette étape du développement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble être requise pour contrôler le niveau d’activation de la voie p53, induite lors du processus de réarrangement V(D)J du TCR. L’expression de gènes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du régulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est régulée à la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un débalancement pro-apoptotique qui empêche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut être rétablie à ce stade de différenciation en assurant une coordination adéquate entre les signaux initiés par l’introduction d’un TCR transgénique et d’un transgène codant pour la protéine Bcl-2. En conclusion, ces études ont montré que Miz-1 intervient à deux niveaux du développement lymphoïde: l’un précoce en contrôlant la signalisation induite par l’IL-7 dans les cellules B et T, en plus de l’axe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et l’autre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. Étant donné que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets à plusieurs rondes de prolifération, ces études serviront à mieux comprendre l’implication des régulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la génération des signaux nécessaires à la différenciation non aberrante et à la survie des ces cellules. Enfin, les modèles expérimentaux, souris déficientes ou à allèles mutantes, utilisés pour ce travail permettront de mieux définir les bases moléculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de révéler les mécanismes conduisant au lymphome.

Étude de la protéine sigma 1 de réovirus par génétique inverse.

Réovirus, connu sous le nom REOLYSIN®, est présentement à l'étude à titre d'agent oncolytique. Or, la spécificité du virus pour les cellules cancéreuses pourrait être optimisée par une modification au niveau de la protéine d'attachement σ1. La présente étude vise à démontrer qu'une telle amélioration est possible par l'utilisation de la méthode nouvellement décrite de génétique inverse. Par cette technique, il est possible d'ajouter un polypeptide d'une longueur de quarante acides aminés à l'extrémité C-terminale de σ1. Il est aussi possible d'engendrer des virus mutés en leur site d'activité mucinolytique. Les virus nouvellement créés démontrent une efficacité de réplication diminuée, mais demeurent infectieux. Contrairement aux méthodes traditionnellement utilisées avec réovirus, la méthode de génétique inverse permet de conserver les mutations engendrées, par substitution ou addition, au cours des cycles de réplication. Une telle étude démontre qu'il serait possible de modifier le tropisme de réovirus.