Étude de l'Endothelin-converting enzyme-like 1 (ECEL1), un nouveau membre de la famille de l'endopeptidase neutre-24.11 (EPN)

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de la régulation de l'activité du ligand Delta dans le cadre de la signalisation Notch

La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l'évolution. Elle joue un rôle clé dans le développement, et elle est impliquée dans de nombreuses décisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Une dérégulation de la signalisation Notch est impliquée dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utérus, et les leucémies, comme la Leucémie Aiguë Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un récepteur transmembranaire activé par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogéniques ont été identifiées au niveau du récepteur Notch, de nombreux cancers modulés par Notch demeurent ligand-dépendants. Étonnamment, les mécanismes moléculaires régulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractérisés par rapport à ceux qui régissent le récepteur Notch lui-même. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur luciférase de Notch, nous avons effectué le premier crible d'ARNi pan-génomique visant spécifiquement à identifier des régulateurs des ligands de Notch dans la cellule émettrice du signal. Nous avons ainsi pu découvrir de nouvelles classes de régulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces régulateurs comprennent des inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, et des gènes divers à fonction inconnue, tels que Tmem128 « Transmembrane protein 128 », ou à fonction préalablement caractérisée tels que la co-chaperonne moléculaire Cdc37 « Cell division cycle 37 homolog ». Par la suite, nous avons développé des cribles secondaires fonctionnels où nous avons démontré l'importance de ces régulateurs pour des événements Notch-dépendants, comme la différenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pré-leucémiques isolées à partir d'un modèle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouvé que les régulateurs les plus forts du crible de survie sont également nécessaires pour l'activité d'auto-renouvellement des cellules souches pré-leucémiques. Finalement, nous avons entamé une caractérisation moléculaire préliminaire de deux régulateurs nouvellement identifiés; Tmem128 et Cdc37 afin d'étudier leur mécanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustré par le modèle LAL-T. La compréhension des détails moléculaires sous-jacents aux fonctions de ces régulateurs sera essentielle afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer.

Les voies de signalisation utérines à l'émergence de la diapause embryonnaire chez le vison américain

La diapause embryonnaire se manifeste par un arrêt réversible du développement embryonnaire durant la période de préimplantation et induit un retard de l’implantation. Chez le vison américain, une diapause embryonnaire obligatoire caractérise chaque gestation. Si les mécanismes de contrôle de la diapause embryonnaire obligatoire chez cette espèce sont bien connus, le rôle utérin impliqué dans la réactivation de l’embryon demeure, quant à lui, encore inconnu. Le sujet de ce doctorat a consisté dans un premier temps à explorer l’environnement utérin à la sortie de la diapause embryonnaire afin de caractériser, dans un deuxième temps, les principaux acteurs utérins qui provoquent la réactivation de l’embryon. Nous avons effectué une analyse du transcriptome utérin à l’émergence de la diapause embryonnaire ce qui a permis de construire une librairie de 123 séquences d’ADNc utérines différentiellement exprimées à la réactivation de l’embryon et homologues à des séquences de gènes connues chez d’autres espèces. Ces gènes sont impliqués dans la régulation du métabolisme (25 %), de l’expression génique (21 %), de la transduction de signal (15 %), du cycle cellulaire (15 %), du transport (10 %) et de la structure cellulaire (9 %), reflétant ainsi d’importantes modifications utérines à la réactivation embryonnaire. Nous avons validé l’expression différentielle de dix gènes ainsi identifiés : GDF3 (growth and differentiation 3), ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule), ADIPOR1 (adiponectin receptor 1), HMGN1 (high mobility group N1), TXNL1 (thioredoxin like 1), TGM2 (tissue transglutaminase 2), SPARC (secreted protein acidic rich in cystein), et trois gènes codant pour AZIN1 (antizyme inhibitor 1), ODC1 (ornithine decarboxylase 1) et SAT1 (spermidine/spermine N1-acetyltransferase), des enzymes impliquées dans la biosynthèse des polyamines. Le patron de l’expression spatio-temporel de SPARC et d’HMGN1 illustrent spécifiquement un remodelage tissulaire et de la chromatine au niveau utérin à la sortie de la diapause embryonnaire. Ayant mesuré une augmentation des concentrations utérines en polyamines à la reprise du développement embryonnaire, nous avons émis l’hypothèse que les polyamines seraient impliquées dans les événements menant à la sortie de la diapause. L’inhibition de la biosynthèse des polyamines par un traitement à l’ α-difluoromethylornithine (DFMO) a provoqué une diminution significative de la proliferation cellulaire dans les embryons à la réactivation, un retard du moment de l’implantation, mais n’a pas affecté le succès de la reproduction. De manière similaire, nous avons induit un état de dormance dans les cellules de trophoblaste de vison en présence DFMO dans le milieu de culture, et constaté que cet état était réversible. En conclusion, cette étude a non seulement ouvert de nouveaux horizons quant à la compréhension du rôle utérin dans les événements menant à la sortie de la diapause embryonnaire, mais a démontré pour la première fois, l’existence de facteurs utérins indispensables à la réactivation de l’embryon: les polyamines.

Intestin et défauts métaboliques dans la résistance à l'insuline

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2.

Corrélats neuronaux de la mémoire de travail en magnétoencéphalographie à l’état de repos.

Purpose: There are few studies demonstrating the link between neural oscillations in magnetoencephalography (MEG) at rest and cognitive performance. Working memory is one of the most studied cognitive processes and is the ability to manipulate information on items kept in short-term memory. Heister & al. (2013) showed correlation patterns between brain oscillations at rest in MEG and performance in a working memory task (n-back). These authors showed that delta/theta activity in fronto-parietal areas is related to working memory performance. In this study, we use resting state MEG oscillations to validate these correlations with both of verbal (VWM) and spatial (SWM) working memory, and test their specificity in comparison with other cognitive abilities. Methods: We recorded resting state MEG and used clinical neuropsychological tests to assess working memory performance in 18 volunteers (6 males and 12 females). The other neuropsychological tests of the WAIS-IV were used as control tests to assess the specificity of the correlation patterns with working memory. We calculated means of Power Spectrum Density for different frequency bands (delta, 1-4Hz; theta, 4-8Hz; alpha, 8-13Hz; beta, 13-30Hz; gamma1, 30-59Hz; gamma2, 61-90Hz; gamma3, 90-120Hz; large gamma, 30-120Hz) and correlated MEG power normalised for the maximum in each frequency band at the sensor level with working memory performance. We then grouped the sensors showing a significant correlation by using a cluster algorithm. Results: We found positive correlations between both types of working memory performance and clusters in the bilateral posterior and right fronto-temporal regions for the delta band (r2 =0.73), in the fronto-middle line and right temporal regions for the theta band (r2 =0.63) as well as in the parietal regions for the alpha band (r2 =0.78). Verbal working memory and spatial working memory share a common fronto-parietal cluster of sensors but also show specific clusters. These clusters are specific to working memory, as compared to those obtained for other cognitive abilities and right posterior parietal areas, specially in slow frequencies, appear to be specific to working memory process. Conclusions: Slow frequencies (1-13Hz) but more precisely in delta/theta bands (1-8Hz), recorded at rest with magnetoencephalography, predict working memory performance and support the role of a fronto-parietal network in working memory.

Modulation of Endothelin-1 and Insulin-like Growth Factor Type 1-induced Signaling by Curcumin in A-10 Vascular Smooth Muscle Cells

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire.

Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

Regulation of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) : relevance to diabetic vasculopathy

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Requirements for the selective degradation of CD4 receptor molecules by the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein in the endoplasmic reticulum.

BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Étude du rôle de la tyrosine kinase Src dans la régulation de la signalisation des récepteurs opioïdes delta (∆OR)

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue.

Les cellules stromales multipotentes accélèrent la guérison de plaies cutanées chez les souris irradiées via la sécrétion de la chimiokine SDF-1α

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes (RI) peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération des tissus. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent largement inconnus encore aujourd’hui, ce qui a pour effet de limiter le développement d’approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle de guérison de plaie cutanée chez la souris, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l’exposition aux RI limite la régénération de la peau. Nos résultats démontrent que l’induction de la "stromal-derived growth factor 1α" (SDF-1α), une cytokine normalement surexprimée dans les tissus hypoxiques, est sévèrement diminuée dans les plaies de souris irradiées versus non-irradiées. Ce défaut corrèle avec un retard de guérison des plaies et est encore évident plusieurs mois suivant l’exposition aux RI, suggérant qu’il y a une altération permanente de la capacité de la peau à se réparer. Parce que SDF-1α est secrété principalement par les fibroblastes du derme, nous avons évalué le potentiel des cellules stromales multipotentes (MSCs), qui sont reconnues pour secréter des niveaux élevés de SDF-1α, à accélérer la régénération de la peau chez les souris irradiées. L’injection de MSCs en périphéries des plaies a mené à une accélération remarquable de la guérison de la peau chez les souris exposées aux RI. Les actions des MSCs étaient principalement paracrines, dû au fait que les cellules n’ont pas migré à l’extérieur de leur site d’injection et ne se sont pas différentiées en kératinocytes. L’inhibition spécifique de l’expression de SDF-1α a mené à une réduction drastique de l’efficacité des MSCs à accélérer la fermeture de plaie indiquant que la sécrétion de SDF-1α par les MSCs est largement responsable de leur effet bénéfique. Nous avons découvert aussi qu’un des mécanismes par lequel SDF-1α accélère la guérison de plaie implique l’augmentation de la vascularisation au niveau de la peau blessée. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent collectivement que SDF-1α est une importante cytokine dérégulée au niveau des plaies cutanées irradiées, et que le déclin du potentiel de régénération des tissus qui est observé suivant une exposition au RI peut être renversé, s’il est possible de restaurer le microenvironnement de la blessure avec un support stromal adéquat.

The Origin and Stimuli Implicated in the Expression of Nestin(+) Cardiac Myocyte-like Cells in the Ischemic Heart

Nos études ont démontrées que la formation de la cicatrice et la guérison sont associées avec l’apparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) dans la région péri-infarcie. Présentement, l’étude examine le mécanisme, tel que l’hypoxie ou les hormones neuronales, possiblement impliqué dans leur recrutement et de dévoiler leur origine cellulaire. La présence de ces cellules a été détectée dans les coeurs infarcies d’une semaine et maintenue après neuf mois suite à une sujétion coronaire complète. Aussi, ces cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) ont été observées dans le coeur infarci humain. L’hypoxie représente un événement prédominant suite à un infarctus de myocarde, mais l’exposition des rats normaux à un environnement hypoxique n’a pas pu promouvoir l’apparition de ces cellules. Autrement, l’infusion de l’agoniste -adrénergique non-sélectif isoprotérénol (ISO) dans les rats adultes Sprague-Dawley a augmenté la protéine nestine dans le ventricule gauche et a été associé avec la réapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+). Cela représente possiblement un effet secondaire suite à la nécrose des myocytes cardiaques par l’administration d’isoprotérénol. Dernièrement, on a identifié une sous-population de cellules nestine(+) dans le coeur normal du rat qui co-exprime les marqueurs de cellules cardiaques progénitrices Nkx-2.5 et GATA-4. Cette sous-population de cellules nestine/Nkx-2.5/GATA-4 pourrait représenter des substrats cellulaires qui puissent se différentier en cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) suite à une ischémie. Mots clés: nestine, isoprotérénol, nécrose, cellule souche, cellule progénitrice, myocyte cardiaque

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

La régulation de l’hepcidine à travers les récepteurs Toll-like dans les macrophages

L'interaction entre le système immunitaire et le métabolisme du fer est bien illustrée par l'anémie des maladies chroniques (ACD), qui est fréquemment rencontrée dans les infections chroniques, l'inflammation et le cancer. La majorité des modifications dans les paramètres du fer observées dans l’ACD tient compte des modifications de l’homéostasie du fer, avec la délocalisation du métal de la circulation et les sites de l'érythropoïèse au compartiment de stockage dans les macrophages. Les mécanismes de la réponse hyposidérémique impliquent des cytokines, notamment TNF-alpha et IL-6, qui régulent les niveaux de plusieurs gènes du métabolisme du fer, y compris les transporteurs de fer et de l'hepcidine, un régulateur négatif de l’absorption du fer, ce qui entraîne l'inhibition de l'exportation du fer à travers la ferroportine 1 (FPN1) au niveau de l'intestin et les macrophages. Des études antérieures ont montré que l'IL-6 induit l’expression d’hepcidine dans les hépatocytes, mais il y a très peu de données concernant la façon par laquelle l'hepcidine et la FPN1 sont régulées dans les macrophages. Récemment, nous avons constaté que l'induction de l'hepcidine dans le foie par le lipopolysaccharide (LPS) dépend de la voie de signalisation médiée par le récepteur Toll-like 4 (TLR4). Le but de ce travail est d’identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages et de déterminer l’exigence des TLRs dans l’induction de l’hepcidine et le développement d’hyposidérémie. En plus, nous voulons étudier l’effet de l’inflammation causée par les ligands des TLRs sur le taux de fer sérique, la production des cytokines et l'expression de l’hepcidine et de la ferroportine. D’autre part nous voulons étudier l’effet du taux du fer sur la production d’IL-6 macrophagique en réponse à la stimulation par le TLR4. D'abord, pour identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages, nous avons traité les macrophages RAW 264.7 et les macrophages péritonéaux de souris (MPMs) avec différents ligands TLRs et on a mesuré l’expression de l'hepcidine par qRT-PCR. Nous avons observé que Pam3CSK4 (Pam), un ligand de TLR2/1; LPS, un ligand de TLR-4 et FSL1 un ligand de TLR2/6 induisent l’expression de l'hepcidine dans les cellules RAW 264.7 et les MPMs, contrairement au polyinosinic: polycytidylic acid (Poly I: C), un ligand de TLR3. De plus, LPS était capable de réprimer l’expression de la ferroportine dans les cellules RAW 264.7. Afin de mieux définir la nécessité des TLRs pour assurer cette expression, nous avons utilisé les souris TLR-2 knock-out et on a établi que l'expression de l'hepcidine dans les macrophages par LPS, Pam ou FSL1 est dépendante du TLR2. En accord avec les expériences in vitro, les études effectuées in vivo ont montré que LPS réprime l’expression de la ferroportine, ainsi que PolyI:C n’est pas capable de stimuler l'expression d'hepcidine hépatique, par contre il était efficace pour déclencher une hyposidérémie. Ensuite, on voulait déterminer la voie de signalisation utilisée dans l’induction de l’hepcidine dans les macrophages. Comme il y deux voies majeures connues pour la signalisation des TLRs : une dépendante et l’autre indépendante de la protéine MyD88, on a étudié l’expression de l’hepcidine dans les MPMs isolés des souris MyD88-/- et nous avons constaté que l'absence de signalisation MyD88 abolit l'induction de l'hepcidine déclenchée par Pam, LPS et FSL1. D’autre part, la stimulation avec du LPS induisait in vivo la production d’IL-6 et de TNF-alpha, et la stimulation d’IL-6 était renforcée in vitro par la présence du fer. Ces observations indiquent que l’expression de HAMP (Hepcidin Antimicrobial Peptide) dans les macrophages peut être régulée par différents TLRs, ce qui suggère que la production d'hepcidine macrophagique fait partie d'une réponse immunitaire activées par les TLRs.