Stress oxydatif cérébrovasculaire et rupture de la barrière hémato-encéphalique dans le syndrome de Wernicke-Korsakoff expérimental

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK.

Mass spectrometry as a tool to dissect the role of chromatin assembly factors in regulating nucleosome assembly

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones.

Recognition of hepatitis C virus RNA by toll like receptors 7 and 8 : implications for the initiation of innate immune response

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus à ARN simple brin positif (ssARN) qui se replique dans le foie. Deux cents millions de personnes sont infectées par le virus dans le monde et environ 80% d’entre elles progresseront vers un stade chronique de l’infection. Les thérapies anti-virales actuelles comme l’interféron (IFN) ou la ribavirin sont de plus en plus utilisées mais ne sont efficaces que dans la moitié des individus traités et sont souvent accompagnées d’une toxicité ou d’effets secondaires indésirables. Le système immunitaire inné est essentiel au contrôle des infections virales. Les réponses immunitaires innées sont activées suite à la reconnaissance par les Pathogen Recognition Receptors (PRRs), de motifs macromoléculaires dérivés du virus appelés Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Bien que l'activation du système immunitaire par l'ARN ou les protéines du VHC ait été largement étudiée, très peu de choses sont actuellement connues concernant la détection du virus par le système immunitaire inné. Et même si l’on peut très rapidement déceler des réponses immunes in vivo après infection par le VHC, l’augmentation progressive et continue de la charge virale met en évidence une incapacité du système immunitaire à contrôler l’infection virale. Une meilleure compréhension des mécanismes d’activation du système immunitaire par le VHC semble, par conséquent, essentielle au développement de stratégies antivirales plus efficaces. Dans le présent travail nous montrons, dans un modèle de cellule primaire, que le génome ARN du VHC contient des séquences riches en GU capables de stimuler spécifiquement les récepteurs de type Toll (TLR) 7 et 8. Cette stimulation a pour conséquence la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs), le production d’interféron de type I (IFN) ainsi que l’induction de chémokines et cytokines inflammatoires par les différentes types de cellules présentatrices d’antigènes (APCs). Les cytokines produites après stimulation de monocytes ou de pDCs par ces séquences ssARN virales, inhibent la production du virus de façon dépendante de l’IFN. En revanche, les cytokines produites après stimulation de cellules dendritiques myéloïdes (mDCs) ou de macrophages par ces mêmes séquences n’ont pas d’effet inhibiteur sur la production virale car les séquences ssARN virales n’induisent pas la production d’IFN par ces cellules. Les cytokines produites après stimulation des TLR 7/8 ont également pour effet de diminuer, de façon indépendante de l’IFN, l’expression du récepteur au VHC (CD81) sur la lignée cellulaire Huh7.5, ce qui pourrait avoir pour conséquence de restreindre l’infection par le VHC. Quoiqu’il en soit, même si les récepteurs au VHC comme le CD81 sont largement exprimés à la surface de différentes sous populations lymphocytaires, les DCs et les monocytes ne répondent pas aux VHC, Nos résultats indiquent que seuls les macrophages sont capables de reconnaître le VHC et de produire des cytokines inflammatoires en réponse à ce dernier. La reconnaissance du VHC par les macrophages est liée à l’expression membranaire de DC-SIGN et l’engagement des TLR 7/8 qui en résulte. Comme d’autres agonistes du TLR 7/8, le VHC stimule la production de cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-8, IL-6 et IL-1b) mais n’induit pas la production d’interféron-beta par les macrophages. De manière attendue, la production de cytokines par des macrophages stimulés par les ligands du TLR 7/8 ou les séquences ssARN virales n’inhibent pas la réplication virale. Nos résultats mettent en évidence la capacité des séquences ssARN dérivées du VHC à stimuler les TLR 7/8 dans différentes populations de DC et à initier une réponse immunitaire innée qui aboutit à la suppression de la réplication virale de façon dépendante de l’IFN. Quoiqu’il en soit, le VHC est capable d’échapper à sa reconnaissance par les monocytes et les DCs qui ont le potentiel pour produire de l’IFN et inhiber la réplication virale après engagement des TLR 7/8. Les macrophages possèdent quant à eux la capacité de reconnaître le VHC grâce en partie à l’expression de DC-SIGN à leur surface, mais n’inhibent pas la réplication du virus car ils ne produisent pas d’IFN. L’échappement du VHC aux défenses antivirales pourrait ainsi expliquer l’échec du système immunitaire inné à contrôler l’infection par le VHC. De plus, la production de cytokines inflammatoires observée après stimulation in vitro des macrophages par le VHC suggère leur potentielle contribution dans l’inflammation que l’on retrouve chez les individus infectés par le VHC.

Molecular mechanisms for a switch-like mating decision in Saccharomyces cerevisiae

Les changements évolutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant à chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire approprié, telles que les caractéristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mécanismes sensoriels y répondant. L'haploïde de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprétant le gradient de la concentration d'une phéromone sécrétée par les partenaires potentiels grâce à un réseau de protéines signalétiques de type kinase activées par la mitose (MAPK). La décision de la liaison sexuelle chez la levure est un événement en "tout–ourien", à la manière d'un interrupteur. Les cellules haploïdes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phéromones qu’il produit. Seul le partenaire à proximité sécrétant des concentrations de phéromones égales ou supérieures à une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phéromones sont attribués à des partenaires pouvant mener à des accouplements infructueux. Notre compréhension du mécanisme moléculaire contrôlant cet interrupteur de la décision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la présente thèse, je démontre que le mécanisme de décision de la liaison sexuelle provient de la compétition pour le contrôle de l'état de phosphorylation de quatre sites sur la protéine d'échafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette compétition résulte en la dissociation de type « intérupteur » entre Fus3 et Ste5, nécessaire à la prise de décision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la décision de la liaison sexuelle s'effectue à une étape précoce de la voie de réponse aux phéromones et se produit rapidement, peut-être dans le but de prévenir la perte d’un partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 génère un mécanisme inédit d'ultrasensibilité, ressemblant à "l'ultrasensibilité d'ordre zéro", qui résiste aux variations de concentration de ces protéines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dépit de la stochasticité cellulaire ou de variations génétiques entre individus.Je démontre, par la suite, qu'un évènement précoce en réponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 à la membrane plasmique est également ultrasensible à l'augmentation de la concentration de phéromones et que cette ultrasensibilité est engendrée par la déphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associée à Ste5 via la protéine polarisante, Bem1. L'interférence dans ce mécanisme provoque une perte de l'ultrasensibilité et réduit, du même coup, l'amplitude et la fidélité de la voie de réponse aux phéromones à la stimulation. Ces changements se reflètent en une réduction de la fidélité et de la précision de la morphologie attribuable à la réponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protéique à la surface de la membrane plasmique est un thème général persistant dans tous les organismes, de la bactérie à l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accroître l'efficacité, la fidélité et la spécificité de la transmission du signal. L'ensemble de nos découvertes démontre que l'ultrasensibilité, la précision et la robustesse de la réponse aux phéromones découlent de la régulation de la phosphorylation stoichiométrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 à la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rôle modulateur de Ste5 dans la décision de la destinée cellulaire étend le répertoire fonctionnel des protéines d'échafaudage bien au-delà de l'accessoire dans la spécificité et l'efficacité des traitements de l'information. La régulation de la dynamique des caractères signal-réponse à travers une telle régulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protéines d'échafaudage combinées à l'assemblage à la membrane peut être un moyen général par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mécanismes similaires peuvent contrôler les décisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent être compromis dans des dérèglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thème relié, je présente la découverte d'un nouveau mécanisme où le seuil de la concentration de phéromones est contrôlé par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manière, le point prédéterminé dans lequel la quantité et la qualité des nutriments accessibles dans l'environnement déterminent le seuil à partir duquel la levure s'accouple. La sous-unité régulatrice de la kinase à protéine A (PKA),Bcy1, une composante clé du réseau signalétique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unité α des petites protéines G, Gpa1, le premier effecteur dans le réseau de réponse aux phéromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en présence d'un sucre idéal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la décision d'accouplement est activée. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accroît la concentration seuil nécessaire à une réponse aux phéromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilité, les levures peuvent intégrer le stimulus provenant des phéromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la décision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement.

Molecular interactions of arbuscular mycorrhizal fungi with mycotoxin-producing fungi and their role in plant defense responses

Les trichothécènes de Fusarium appartiennent au groupe des sesquiterpènes qui sont des inhibiteurs la synthèse des protéines des eucaryotes. Les trichothécènes causent d’une part de sérieux problèmes de santé aux humains et aux animaux qui ont consommé des aliments infectés par le champignon et de l’autre part, elles sont des facteurs importants de la virulence chez plantes. Dans cette étude, nous avons isolé et caractérisé seize isolats de Fusarium de la pomme de terre infectée naturellement dans un champs. Les tests de pathogénicité ont été réalisés pour évaluer la virulence des isolats sur la pomme de terre ainsi que leur capacité à produire des trichothécènes. Nous avons choisi F. sambucinum souche T5 comme un modèle pour cette étude parce qu’il était le plus agressif sur la pomme de terre en serre en induisant un flétrissement rapide, un jaunissement suivi de la mort des plantes. Cette souche produit le 4,15-diacétoxyscirpénol (4,15-DAS) lorsqu’elle est cultivée en milieu liquide. Nous avons amplifié et caractérisé cinq gènes de biosynthèse trichothécènes (TRI5, TRI4, TRI3, TRI11, et TRI101) impliqués dans la production du 4,15-DAS. La comparaison des séquences avec les bases de données a montré 98% et 97% d'identité de séquence avec les gènes de la biosynthèse des trichothécènes chez F. sporotrichioides et Gibberella zeae, respectivement. Nous avons confrenté F. sambucinum avec le champignon mycorhizien à arbuscule Glomus irregulare en culture in vitro. Les racines de carotte et F. sambucinum seul, ont été utilisés comme témoins. Nous avons observé que la croissance de F. sambucinum a été significativement réduite avec la présence de G. irregulare par rapport aux témoins. Nous avons remarqué que l'inhibition de la croissance F. sambucinum a été associée avec des changements morphologiques, qui ont été observés lorsque les hyphes de G. irregulare ont atteint le mycélium de F. sambucinum. Ceci suggère que G. irregulare pourrait produire des composés qui inhibent la croissance de F. sambucinum. Nous avons étudié les patrons d’expression des gènes de biosynthèse de trichothécènes de F. sambucinum en présence ou non de G. irregulare, en utilisant le PCR en temps-réel. Nous avons observé que TRI5 et TRI6 étaient sur-exprimés, tandis que TRI4, TRI13 et TRI101 étaient en sous-exprimés en présence de G. irregulare. Des analyses par chromatographie en phase-gazeuse (GC-MS) montrent clairement que la présence de G. irregulare réduit significativement la production des trichothécènes par F. sambucinum. Le dosage du 4,15-DAS a été réduit à 39 μg/ml milieu GYEP par G. irregulare, comparativement à 144 μg/ml milieu GYEP quand F. sambucinum est cultivé sans G. irregulare. Nous avons testé la capacité de G. irregulare à induire la défense des plants de pomme de terre contre l'infection de F. sambucinum. Des essais en chambre de croissance montrent que G. irregulare réduit significativement l’incidence de la maladie causée par F. sambucinum. Nous avons aussi observé que G. irregulare augmente la biomasse des racines, des feuilles et des tubercules. En utilisant le PCR en temps-réel, nous avons étudié les niveaux d’expression des gènes impliqué dans la défense des plants de pommes de terre tels que : chitinase class II (ChtA3), 1,3-β-glucanase (Glub), peroxidase (CEVI16), osmotin-like protéin (OSM-8e) et pathogenèses-related protein (PR-1). Nous avons observé que G. irregulare a induit une sur-expression de tous ces gènes dans les racines après 72 heures de l'infection avec F. sambucinum. Nous avons également trové que la baisse provoquée par F. sambucinum des gènes Glub et CEVI16 dans les feuilles pourrait etre bloquée par le traitement AMF. Ceci montre que l’inoculation avec G. irregulare constitut un bio-inducteur systémique même dans les parties non infectées par F. sambucinum. En conclusion, cette étude apporte de nouvelles connaissances importantes sur les interactions entre les plants et les microbes, d’une part sur les effets directs des champignons mycorhiziens sur l’inhibition de la croissance et la diminution de la production des mycotoxines chez Fusarium et d’autre part, l’atténuation de la sévérité de la maladie dans des plantes par stimulation leur défense. Les données présentées ouvrent de nouvelles perspectives de bio-contrôle contre les pathogènes mycotoxinogènes des plantes.

Caractérisation de l'interaction de l'auto-antigène ADN topoisomérase I avec les fibroblastes dans la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

Les protéines Staufen et leurs rôles dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes, la réponse aux dommages à l’ADN et le cycle cellulaire

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire.

Evaluating DNA damage response (DDR) activation in human prostate cancer

Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes et le plus mortel après les cancers du poumon et du côlon. Il y a place à optimiser le traitement du cancer de la prostate de manière à mettre en œuvre une médecine personnalisée qui s’adapte aux caractéristiques de la maladie de chaque patient de façon individuelle. Dans ce mémoire, nous avons évalué la réponse aux dommages de l’ADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lésions potentiellement oncogènes de l'ADN déclenche une cascade de signalisation favorisant la réparation de l'ADN et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire pour préserver l’intégrité du génome. La RDA est un mécanisme central de suppression tumorale chez l’homme. La RDA joue un rôle important dans l’arrêt de la prolifération des cellules dont les génomes sont compromis, et donc, prévient la progression du cancer en agissant comme une barrière. Cette réponse cellulaire détermine également comment les cellules normales et cancéreuses réagissent aux agents utilisés pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothérapie ou la chimiothérapie, en plus la présence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent également influer sur l'issue de ces traitements. L’activation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lésions pré-néoplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a été démontré que la RDA est augmentée dans les cellules de néoplasie intra- épithéliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et l’adénocarcinome est encore mal documenté et aucune corrélation n'a été réalisée avec les données cliniques des patients. Notre hypothèse est que les niveaux d’activation de la RDA seront variables selon les différents grades et agressivité du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront être corrélés et possiblement prédire les réponses cliniques aux traitements des patients et aider à définir une stratégie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prédire les résultats du traitement et personnaliser les traitements en conséquence. Nos objectifs sont de caractériser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corréler ses données avec les résultats cliniques. Méthodes : Nous avons utilisé des micro-étalages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et déterminé le niveau d’expression de protéines de RDA dans le compartiment stromal et épithélial des tissus normaux et cancéreux. Les niveaux d’expression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont été quantifiés par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatisé. Ces marqueurs de RDA ont d’abord été validés sur des TMAs-cellule constitués de cellules de fibroblastes normales ou irradiées (pour induire une activation du RDA). Les données ont été quantifiées à l'aide de couches binaires couramment utilisées pour classer les pixels d'une image pour que l’analyse se fasse de manière indépendante permettant la détection de plusieurs régions morphologiques tels que le noyau, l'épithélium et le stroma. Des opérations arithmétiques ont ensuite été réalisées pour obtenir des valeurs correspondant à l'activation de la RDA qui ont ensuite été corrélées à la récidive biochimique et l'apparition de métastases osseuses. Résultats : De faibles niveaux d'expression de la protéine p65 dans le compartiment nucléaire épithélial du tissu normal de la prostate sont associés à un faible risque de récidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observé que de faibles niveaux d'expression de la protéine 53BP1 dans le compartiment nucléaire épithéliale du tissu prostatique normal et cancéreux ont été associés à une plus faible incidence de métastases osseuses. Conclusion: Ces résultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients présentant un adénocarcinome de la prostate. Ces résultats suggèrent également que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront également être corrélés aux résultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces résultats se traduisent par une corrélation avec la survie. Les niveaux d'activité de la RDA pourront éventuellement être utilisés en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement l’antigène prostatique spécifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

Identification de composé sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH à l'irradiation

Le cancer du col utérin (CCU) est dans plus de 99% des cas provoqué par une infection avec le virus du papillome humain (VPH), dont le potentiel oncogénique réside dans l'expression des proto-oncogènes viraux E6/E7. Le potentiel carcinogénique de ces protéines virales réside essentiellement dans leurs actions sur les produits des gènes suppresseurs de tumeur p53 et RB. Les produits de ces gènes, p53 et Rb, font parti des voies de signalisation de réponse aux dommages de l'ADN cellulaire (RDA) et leur perte entraine une perte de fonctionnalité qui mène à une instabilité génomique. À long terme et en présence de d'autres facteurs ceux-ci mèneront au développement d'un cancer. Les protéines E6 et E7 sont constitutivement exprimées dans les cellules du CCU ainsi que dans les cellules de tout autre cancer induit par le VPH et seulement dans ces dernières. La prise en charge des cas avancés de ces cancers se fait principalement par radiothérapie et chimiothérapie concomitante. La chimio-radiothérapie utilisée en traitement est efficace mais résulte en un taux élevé de morbidité et un nombre important de patientes récidiveront. Nous proposons que l'exploitation de l'expression spécifique d’E6 et d’E7 dans les cellules du CCU permette d’envisager une stratégie de létalité synthétique afin d'amplifier l'effet létal de l'irradiation sur les cellules CCU. Ceci permettrait potentiellement d'augmenter l'efficacité du traitement et de diminuer les récidives, ainsi que la morbidité liée au traitement. En s'appuyant sur cette hypothèse, notre objectif est d’identifier des composés dont l'action seule ou couplée à l'irradiation provoquerait préférentiellement la mort des cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH. Les cellules testées comprennent des cellules isogéniques humaines issues de kératinocytes normaux que nous avons modifiées séquentiellement pour obtenir les modifications associées aux cellules CCU (hTERT, E6 et E7), ainsi que les lignées de cellules de CCU HeLa et CaSki .Nous avons procédé à la mise au point et à la validation du protocole de criblage et des méthodes d’évaluation de la sensibilisation, qui se définit comme une perte de viabilité, un arrêt ou ralentissement de la croissance, par détection d’ATP ainsi que par coloration d’ADN génomique au DRAQ5. Suite à un criblage ciblé impliquant des inhibiteurs connus de la voie de réparation des dommages à l’ADN, nous avons identifié l’inhibiteur de mdm2, Nutlin-3, comme étant un composé sensibilisant et radio-sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant E6 et E7 du VPH. La Nutlin-3 a été testée sur des cellules HEKn-hTERT-E6-E7, des cellules CaSki et HeLa. L’effet de sensibilisation et de radio-sensibilisation a été confirmé dans ces trois lignées. Tel que suggéré par son action sur mdmd2, la Nutlin-3 permet la stabilisation de p53 dans les cellules HEKn-hTERT-E6-E7 et CaSki et sa réactivation dans les lignées cellulaires HeLa et CaSki. Malgré cette stabilisation de p53, de façon surprenante, l’effet de la Nutlin-3 sur la sensibilisation et la radio-sensibilisation des cellules HeLa et CaSki semble indépendant de p53, tel qu’observé en utilisant des cellules HeLa-GSE et CaSki-GSE dont le p53 est déficient. In vivo la Nutlin-3a montre dans un essai préliminaire l’inhibition de la croissance tumorale des xénogreffes HeLa chez des souris RAG2γc. Ce résultat reste à confirmer avec un essai impliquant un nombre d’échantillons plus grand. À plus long terme, nous comptons étudier l’implication de mdm2 dans l’effet de sensibilisant de la Nutlin-3 dans les cellules CCUs, ainsi que les autres cibles pouvant être impliquées dans la création de cet effet sensibilisant observé.

Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

The role of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus structural and non-structural proteins in virus pathogenesis.

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is an economically devastating viral disease affecting the swine industry worldwide. The etiological agent, PRRS virus (PRRSV), possesses a RNA viral genome with nine open reading frames (ORFs). The ORF1a and ORF1b replicase-associated genes encode the polyproteins pp1a and pp1ab, respectively. The pp1a is processed in nine non-structural proteins (nsps): nsp1a, nsp1b, and nsp2 to nsp8. Proteolytic cleavage of pp1ab generates products nsp9 to nsp12. The proteolytic pp1a cleavage products process and cleave pp1a and pp1ab into nsp products. The nsp9 to nsp12 are involved in virus genome transcription and replication. The 30 end of the viral genome encodes four minor and three major structural proteins. The GP2a, GP3 and GP4 (encoded by ORF2a, 3 and 4), are glycosylated membrane associated minor structural proteins. The fourth minor structural protein, the E protein (encoded by ORF2b), is an unglycosylated membrane associated protein. The viral envelope contains two major structural proteins: a glycosylated major envelope protein GP5 (encoded by ORF5) and an unglycosylated membrane M protein (encoded by ORF6). The third major structural protein is the nucleocapsid N protein (encoded by ORF7). All PRRSV non-structural and structural proteins are essential for virus replication, and PRRSV infectivity is relatively intolerant to subtle changes within the structural proteins. PRRSV virulence is multigenic and resides in both the non-structural and structural viral proteins. This review discusses the molecular characteristics, biological and immunological functions of the PRRSV structural and nsps and their involvement in the virus pathogenesis.

Étude protéomique des partenaires d`interaction de XPA en présence et en absence de dommage à l`ADN

La réparation par excision de nucléotides (NER) permet l'élimination des lésions provoquant une distorsion de la double hélice de l’ADN. Ces lésions sont induites par plusieurs agents environnementaux comme les rayons UV, ainsi que par certaines drogues chimio- thérapeutiques tel que le cisplatine. Des défauts dans la NER conduisent à de rares maladies autosomiques héréditaires : La xérodermie pigmentaire (XP), le syndrome de Cockayne (CS), le syndrome de sensibilité aux UVSS et la trichothiodystrophie (TTD). Ces maladies sont associées soit à une prédisposition élevée au cancer de la peau et / ou à de graves anomalies du développement neurologique. Le groupe de patients XP-A représente le deuxième groupe (XP) le plus fréquent, et possède la forme la plus sévère combinant cancer de la peau avec un haut risque de dégénérescence neurologique. À date, aucune explication n`a été proposée pour les symptômes neurologiques observés chez ces patients. Nous avions suggéré ainsi que la protéine XPA possède d`autres fonctions dans d`autres processus cellulaires, ceci en interagissant avec des partenaires protéiques différents de ceux déjà connus. Afin de confirmer cette hypothèse nous avions réalisé une étude protéomique à grande échelle en combinant la spectrométrie de masse à une immunoprécipitation en Tandem d`affinité (TAP), afin d`identifier de nouvelles protéines interagissant directement avec XPA. Nous avions montré que XPA peut interagir avec MRE11, la protéine clé de la réparation par recombinaison homologue. Des études additionnelles sont requises pour confirmer cette interaction et comprendre sa fonction