Altération de l’interaction entre la PTH et LRP6 dans les ostéoblastes humains arthrosiques via DKK2

L’ostéoarthrose (OA) se caractérise par une perte du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, et une inflammation de la membrane synoviale. Des études in vivo et in vitro indiquent que les modifications du tissu osseux sont responsables de la perte du cartilage articulaire. Les ostéoblastes (Ob) OA présentent une réduction de la réponse à l’hormone parathyroïdienne (PTH), un signal anabolique important pour le tissu osseux, versus les Ob normaux. Le récepteur à la PTH (PTH-R) interagit avec le LRP6, le récepteur des ligands Wnts, et les antagonistes Dickkopf (DKK) bloquent cette interaction. Puisque le niveau de DKK2 est élevé en réponse au TGF-β1 dans les OA Ob, nous proposons que DKK2 altère l’interaction LRP6/PTH-R, le recyclage de PTH-R, et inhibe la réponse à la PTH. Nous avons utilisé des Ob OA et normaux humains en culture primaire. L’expression de PTH-R, LPR6 et DKK2 est mesurée par RT-PCR. Les niveaux protéiques de LRP6, PTH-R et DKK2 ont été déterminés par immunobuvardage. L’inhibition de DKK2 s’est effectuée par siRNA et l’AMP cyclique (AMPc) a été mesurée par ELISA. L’effet de TGF-β1 sur l’expression de DKK2 et PTH-R a été testé sur des cellules d’ostéosarcome SaOS-2. L’expression de PTH-R et LRP6 est similaire entre Ob normaux et OA, mais le niveau protéique de PTH-R est réduit dans les Ob OA. Par contre, l’expression et la production de DKK2 sont plus élevées dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 ne modifia pas l’expression de LRP6 et PTH-R dans les Ob OA mais a augmenté le niveau protéique de PTH-R détecté par immunobuvardage alors que celui de LRP-6 demeura inchangé. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA entraîna une augmentation de PTH-R dans la fraction membranaire et une diminution de la fraction intracellulaire. Les résultats de l'inhibition de la voie de clathrine par le triflupromazine ont montré une expression accrue du récepteur PTH dans la fraction membranaire qui peut être due à l'inhibition de sa dégradation par la voie de clathrine. L’induction de DKK2 dans les cellules SaOS-2 par TGF-β1 entraîna l’inhibition de PTH-R mais non celle de LRP6. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA a stimulé la production d’AMPc en réponse à la PTH par les Ob OA. En outre, le traitement de TGF-β1 dans les cellules SaOS-2 réduit la production d'AMPc en réponse à la PTH.Ces résultats démontrent que les niveaux élevés de DKK2, via l’inhibition de la signalisation Wnt/bcaténine, sont aussi responsables de l’altération de la réponse à la PTH observée dans les Ob OA. Le niveau élevé de DKK2 diminue spécifiquement l’affichage membranaire de PTH-R dans ces cellules et non son expression. Ces résultats suggèrent donc une altération du cross-talk entre LRP6 et PTH-R dans les Ob OA en lien avec leur niveau de DKK2.

Comparison of a leukocyte esterase test with endometrial cytology for the diagnosis of subclinical endometritis and correlation with first service pregnancy rate in postpartum Holstein cows

L’objectif de la présente étude était d’évaluer un test d’estérase leucocytaire (LE) pour le diagnostic de l’endométrite subclinique chez les vaches Holstein en période postpartum. Les tests effectués à partir d’échantillons provenant soit de l’endomètre (UtLE) ou du col utérin (CxLE) ont été comparés à la cytologie endométriale (CE). Par ailleurs, deux méthodes d’évaluation des lames ont été comparées. Deux cent quatre vingt-cinq vaches Holstein de 5 troupeaux laitiers commerciaux ont été évaluées entre 21 et 47 jours en lait (JEL). Soixante sept vaches ont été diagnostiquées avec une endométrite clinique suite à un examen transrectal et vaginoscopique et ont été exclues de l’étude. Deux cent dix-huit vaches ont eu des prélèvements pour la CE et le test LE. La fonction ovarienne a été déterminée à la palpation transrectale. La banque de données utilisée pour chacune des vaches a été effectuée à partir du logiciel DSA (Dossier de Santé Animale) laitier. Le pourcentage de neutrophiles était significativement corrélé avec les scores de LE utérin et cervical. L’activité de CxLE et UtLE diminuait significativement avec les JEL, mais n’était pas associée au risque de gestation à 90 JEL (n= 186). Le pourcentage de neutrophiles mesuré à la CE entre 32 et 47 JEL était associé significativement au risque de gestation à 90 JEL (n=94, P=0.04). Pour la même période, selon une analyse de survie, les vaches avec >2,6% de neutrophiles à la CE étaient définies comme étant atteintes d’une endométrite subclinique avec une prévalence de 56%. Les résultats indiquent que le test d’estérase utérin ou cervical a une bonne concordance avec le pourcentage de neutrophiles à la CE. Une endométrite subclinique diagnostiquée par cytologie endometriale entre 32 et 47 JEL est associée à une réduction du risque de gestation au premier service.

Vulnérabilité cardiaque au stress au cours du remodelage ventriculaire pathologique : rôle de la mitochondrie et du pore de perméabilité transitionnelle (PTP)

L’objectif central de cette thèse de Doctorat était d’investiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent précocement au cours de la phase compensée du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rôle causal dans la progression vers l’insuffisance cardiaque. Nos travaux antérieurs, réalisés à l’aide d’un modèle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montré qu’au cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries développaient une vulnérabilité à l’ouverture du pore de perméabilité transitionnelle (PTP : un élément clé de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci était observable au stade compensé du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observées dans le cœur insuffisant. Ces résultats nous ont amenés à suggérer que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP pourrait constituer un mécanisme précoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans l’étude 1 de cette thèse, nous avons tenté de tester cette hypothèse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de très nettes différences au niveau de la propension à développer l’insuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos études in vitro sur organelles isolées et in situ sur l’organe entier ont permis de confirmer que, dans le cœur ACF, les mitochondries développent une vulnérabilité à l’ouverture du PTP et à l’activation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsqu’exposées à des stress pertinents à la pathologie (surcharge calcique, ischémie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD démontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononcé et une progression précoce vers l’insuffisance cardiaque, aucune différence n’était observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggérant quelles ne sont pas à l’origine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, à tout le moins en réponse à la surcharge volumique. Nous avons par la suite déterminé, à l’aide des mêmes approches expérimentales, si cette vulnérabilité mitochondriale était observable dans une cardiopathie d’étiologie différente, plus spécifiquement celle qui est associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique causée par une mutation de la protéine dystrophine. Nos études menées (études 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modèle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie n’ont révélé aucune différence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modèle d’ACF, les mitochondries dans le cœur de souris mdx étaient significativement plus vulnérables à l’ouverture du PTP lorsque soumises à une I-R (étude 2). Par ailleurs, nous avons démontré que l’administration aiguë de sildénafil aux souris mdx induisait une abolition de l’ouverture du PTP et de ses conséquences signalétiques, une diminution marquée du dommage tissulaire et une meilleure récupération fonctionnelle à la suite de l’I-R (étude 3). Nous avons ensuite testé chez la souris mdx l’administration aiguë de SS31, un peptide anti-oxydant ciblé aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur n’a été observé, suggérant que le tamponnement des radicaux libres est d’une utilité limitée si les perturbations de l’homéostasie calcique typiques à cette pathologie ne sont pas traitées simultanément (étude 4). Globalement, les travaux effectués au cours de cette thèse démontrent que la vulnérabilité à l’ouverture du PTP constitue une dysfonction précoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques d’étiologies différentes. Par ailleurs, ces travaux suggèrent des stratégies d’intervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont l’efficacité pour la prévention de l’insuffisance cardiaque demande à être établie.