Role of histone methylation in the regulation of COX-2, iNOS, and mPGES-1 gene expression in human chondrocytes: Implication for Osteoarthritis

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative, classée comme la forme la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée par la dégénérescence du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale, et le remodelage de l’os sous-chondral. Ces changements structurels et fonctionnels sont dues à de nombreux facteurs. Les cytokines, les prostaglandines (PG), et les espèces réactives de l'oxygène sont les principaux médiateurs impliqués dans la pathophysiologie de l'OA. L'interleukine-1β (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui joue un rôle crucial dans l'OA. L'IL-1β induit l'expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2), la microsomale prostaglandine E synthase-1 (mPGES-1), la synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), ainsi que leurs produits la prostaglandine E2 (PGE2) et l'oxyde nitrique (NO). Ce sont des médiateurs essentiels de la réponse inflammatoire au cours de l'OA qui contribuent aux mécanismes des douleurs, de gonflement, et de destruction des tissus articulaires. Les modifications épigénétiques jouent un rôle très important dans la régulation de l’expression de ces gènes pro-inflammatoires. Parmi ces modifications, la méthylation/ déméthylation des histones joue un rôle critique dans la régulation des gènes. La méthylation/ déméthylation des histones est médiée par deux types d'enzymes: les histones méthyltransférases (HMT) et les histones déméthylases (HDM) qui favorisent l’activation et/ou la répression de la transcription. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression des gènes de la COX-2, la mPGES-1, et l’iNOS. L'objectif de cette étude est de déterminer si la méthylation/déméthylation des histones contribute à la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS dans des chondrocytes OA humains induits par l'IL-1β. Nous avons montré que la méthylation de la lysine K4 de l'histone H3 (H3K4) par SET-1A contribue à l’activation des gènes COX-2 et iNOS dans les chondrocytes humains OA induite par l'IL-1β. Nous avons également montré que la lysine K9 de l’histone H3 (H3K9) est déméthylée par LSD1, et que cette déméthylation contribue à l’expression de la mPGES-1 induite par IL-1β dans les chondrocytes humains OA. Nous avons aussi trouvé que les niveaux d'expression des enzymes SET-1A et LSD1 sont élevés au niveau du cartilage OA. Nos résultats montrent, pour la première fois, l'implication de la méthylation/ déméthylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS. Ces données suggèrent que ces mécanismes pourraient être une cible potentielle pour une intervention pharmacologique dans le traitement de la physiopathologie de l'OA.

Action anti-leucémique des inhibiteurs de la méthylation de l’ADN et de la déacétylation des histones

Les gènes suppresseurs de tumeurs (TSGs) contrôlent la prolifération cellulaire et leur inactivation joue un rôle important dans la leucémogénèse. Deux mécanismes épigénétiques majeurs sont impliqués dans la répression des TSGs: 1- la méthylation de l’ADN et 2- la déacétylation des histones des chromosomes. On les dit épigénétiques car ils n’affectent pas la séquence de l’ADN. Ces phénomènes sont réversibles, faisant donc d’eux des cibles thérapeutiques de choix. Dans le cadre de cette thèse, nous avons évalué le potentiel chimiothérapeutique de différents agents qui visent ces mécanismes épigénétiques et nous les avons administrés seuls et en combinaison dans le but d’améliorer leur efficacité. La 5-aza-2’-désoxycytidine (5-Aza-CdR) est un inhibiteur de la méthylation de l’ADN qui permet la ré-expression des TSGs. Cet agent s’est avéré efficace contre certaines maladies hématologiques et est d’ailleurs approuvé aux États-Unis dans le traitement du syndrome myélodysplasique depuis 2006. Cependant, le protocole d’administration optimal de cet agent, en termes de doses et de durée, n’est toujours pas établi. Nos recherches suggèrent que le celui-ci devrait être plus intensif que ce que rapporte la littérature. Les inhibiteurs des déacétylases des histones (HDACi) ont également montré une activité antinéoplasique intéressante. De récentes recherches ont montré que la combinaison d’agents ciblant à la fois la méthylation de l’ADN et la déacétylation des histones produit une réactivation synergique des TSGs, ce à quoi nous nous sommes intéressé. Nous avons observé que la co-administration d’un HDACi avec la 5-Aza-CdR potentialise son action anti-leucémique. Il est aussi possible d’augmenter l’activité de la 5-Aza-CdR en inhibant sa dégradation par l’enzyme cytidine (CR) désaminase. Nous avons observé que la co-administration du zebularine, un inhibiteur de la CR désaminase, avec la 5-Aza-CdR accroît son efficacité. Le zebularine est aussi un inhibiteur de la méthylation de l’ADN, ce qui pourrait contribuer à la potentialisation de la réponse anti-leucémique observée lors de la co-administration de ces deux agents. En résumé, il est possible d’augmenter l’efficacité anti-leucémique de la 5-Aza-CdR en : 1- intensifiant son protocole d’administration, en termes de doses et de durée, 2- la combinant avec un HDACi, et 3- diminuant sa dégradation par la CR désaminase. L’utilisation de ces résultats précliniques dans l’élaboration de protocoles cliniques pourrait être bénéfique à beaucoup de patients.

Mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’acide polysialique (PSA) dans le néocortex visuel des souris durant la maturation des synapses GABAergiques

Le fonctionnement du cortex cérébral nécessite l’action coordonnée de deux des sous-types majeurs de neurones, soient les neurones à projections glutamatergiques et les interneurones GABAergiques. Les interneurones GABAergiques ne constituent que 20 à 30% des cellules corticales par rapport au grand nombre de neurones glutamatergiques. Leur rôle est toutefois prépondérant puisqu’ils modulent fortement la dynamique et la plasticité des réseaux néocorticaux. Il n’est donc pas surprenant que les altérations de développement des circuits GABAergiques soient associées à plusieurs maladies du cerveau, incluant l’épilepsie, le syndrome de Rett et la schizophrénie. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant le développement des circuits GABAergiques est une étape essentielle menant vers une meilleure compréhension de la façon dont les anormalités se produisent. Conséquemment, nous nous intéressons au rôle de l’acide polysialique (PSA) dans le développement des synapses GABAergiques. PSA est un homopolymère de chaînons polysialylés en α-2,8, et est exclusivement lié à la molécule d’adhésion aux cellules neuronales (NCAM) dans les cerveaux de mammifères. PSA est impliqué dans plusieurs processus développementaux, y compris la formation et la plasticité des synapses glutamatergiques, mais son rôle dans les réseaux GABAergiques reste à préciser. Les données générées dans le laboratoire du Dr. Di Cristo démontrent que PSA est fortement exprimé post- natalement dans le néocortex des rongeurs, que son abondance diminue au cours du développement, et, faits importants, que son expression dépend de l’activité visuelle i et est inversement corrélée à la maturation des synapses GABAergiques. La présente propose de caractériser les mécanismes moléculaires régulant l’expression de PSA dans le néocortex visuel de la souris. Les enzymes polysialyltransférases ST8SiaII (STX) et ST8SiaIV (PST) sont responsables de la formation de la chaîne de PSA sur NCAM. En contrôlant ainsi la quantité de PSA sur NCAM, ils influenceraient le développement des synapses GABAergiques. Mon projet consiste à déterminer comment l’expression des polysialyltransférases est régulée dans le néocortex visuel des souris durant la période post-natale; ces données sont à la fois inconnues, et cruciales. Nous utilisons un système de cultures organotypiques dont la maturation des synapses GABAergiques est comparable au modèle in vivo. L’analyse de l’expression génique par qPCR a démontré que l’expression des polysialyltransférases diminue au cours du développement; une baisse majeure corrélant avec l’ouverture des yeux chez la souris. Nous avons de plus illustré pour la première fois que l’expression de STX, et non celle de PST, est activité-dépendante, et que ce processus requiert l’activation du récepteur NMDA, une augmentation du niveau de calcium intracellulaire et la protéine kinase C (PKC). Ces données démontrent que STX est l’enzyme régulant préférentiellement le niveau de PSA sur NCAM au cours de la période post-natale dans le cortex visuel des souris. Des données préliminaires d’un second volet de notre investigation suggèrent que l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN pourraient également contribuer à la régulation de la transcription de cette enzyme durant le développement. Plus d’investigations seront toutefois nécessaires afin de confirmer cette hypothèse. En somme, la connaissance des mécanismes par lesquels l’expression des ii polysialyltransférases est modulée est essentielle à la compréhension du processus de maturation des synapses GABAergiques. Ceci permettrait de moduler pharmacologiquement l’expression de ces enzymes; la sur-expression de STX et/ou PST pourrait produire une plus grande quantité de PSA, déstabiliser les synapses GABAergiques, et conséquemment, ré-induire la plasticité cérébrale.

L'épigénétique, moteur de l'évolution d'un vertébré asexué

L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations.

Rôle de l’acétylation/déacétylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes de la COX-2, iNOS et mPGES-1 dans les tissus articulaires.

L’arthrose ou ostéoarthrose (OA) est l’affection rhumatologique la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée principalement par une perte du cartilage articulaire et l’inflammation de la membrane synoviale. L’interleukine (IL)-1ß, une cytokine pro-inflammatoire, joue un rôle très important dans la pathogenèse de l’OA. Elle exerce son action en induisant l’expression des enzymes cyclo-oxygénase 2 (COX-2), prostaglandine E synthétase microsomale 1 (mPGES-1) et l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) ainsi que la production de la prostaglandine E2 (PGE2) et de l’oxyde nitrique (NO). Ces derniers (PGE2 et NO) contribuent à la synovite et la destruction du cartilage articulaire par leurs effets pro-inflammatoires, pro-cataboliques, anti-anaboliques, pro-angiogéniques et pro-apoptotiques. Les modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l’ADN, et l’acétylation et la méthylation des histones, jouent un rôle crucial dans la régulation de l’expression des gènes. Parmi ces modifications, l’acétylation des histones est la plus documentée. Ce processus est contrôlé par deux types d’enzymes : les histones acétyltransférases (HAT) qui favorisent la transcription et les histones déacétylases (HDAC) qui l’inhibent. L’objectif de ce travail est d’examiner le rôle des enzymes HDAC dans la régulation de l’expression de la COX-2, mPGES-1 et iNOS. Nous avons montré qu’au niveau des chondrocytes, les inhibiteurs des HDAC (iHDAC), trichostatine A (TSA) et butyrate de sodium (NaBu), suppriment l’expression de la COX-2 et iNOS au niveau de l’ARNm et protéique, ainsi que la production de la PGE2 et du NO, induites par l’IL-1ß. L’effet inhibiteur à lieu sans affecter l’activité de liaison à l’ADN du facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κ B). La TSA et le NaBu inhibent également la dégradation induite par l’IL-1ß des protéoglycanes au niveau du cartilage. Nous avons également montré, qu’au niveau des fibroblastes synoviaux, les iHDAC, TSA, NaBu et acide valproïque (VA), suppriment l’expression de la mPGES-1 ainsi que la production de la PGE2 induites par l’IL-1ß. En utilisant diverses approches expérimentales, nous avons montré que HDAC4 est impliquée dans l’induction de l’expression de la mPGES-1 par l’IL-1ß. HDAC4 exerce son action, via son activité déacétylase, en augmentant l’activité transcriptionnelle de Egr-1 (early growth factor 1), facteur de transcription principal de l’expression de la mPGES-1. L’ensemble de ces résultats suggère que les inhibiteurs des HDAC pourraient être utilisés dans le traitement de l’OA.

Dynamic epigenetic changes in immune responses to infection in human dendritic cells

La méthylation de l'ADN est une marque épigénétique importante chez les mammifères. Malgré le fait que la méthylation de la cytosine en 5' (5mC) soit reconnue comme une modification épigénétique stable, il devient de plus en plus reconnu qu'elle soit un processus plus dynamique impliquant des voies de méthylation et de déméthylation actives. La dynamique de la méthylation de l'ADN est désormais bien caractérisée dans le développement et dans le fonctionnement cellulaire des mammifères. Très peu est cependant connu concernant les implications régulatrices dans les réponses immunitaires. Pour se faire, nous avons effectué des analyses du niveau de transcription des gènes ainsi que du profilage épigénétique de cellules dendritiques (DCs) humaines. Ceux-ci ont été faits avant et après infection par le pathogène Mycobacterium tuberculosis (MTB). Nos résultats fournissent le premier portrait génomique du remodelage épigénétique survenant dans les DCs en réponse à une infection bactérienne. Nous avons constaté que les changements dans la méthylation de l'ADN sont omniprésents, identifiant 3,926 régions différentiellement méthylées lors des infections par MTB (MTB-RDMs). Les MTB-RDMs montrent un chevauchement frappant avec les régions génomiques marquées par les histones associées avec des régions amplificatrices. De plus, nos analyses ont révélées que les MTB-RDMs sont activement liées par des facteurs de transcription associés à l'immunité avant même d'être infecté par MTB, suggérant ces domaines comme étant des éléments d'activation dans un état de dormance. Nos données suggèrent que les changements actifs dans la méthylation jouent un rôle essentiel pour contrôler la réponse cellulaire des DCs à l'infection bactérienne.

Le rôle du stress oxydant dans les changements épigénétiques contribuant aux complications du syndrome métabolique.

La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG. Cette modification épigénétique catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs) consiste en la méthylation du carbone 5' d’une cytosine ce qui aboutit à la formation de 5-méthylcytosine. La méthylation de l'ADN est clairement impliquée dans l'inactivation des gènes et dans l'empreinte génétique. Elle est modulée par la nutrition, en particulier par les donneurs de méthyle et par une restriction protéique. Ces modifications épigénétiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au développement de nombreuses pathologies telles que le syndrome métabolique et le diabète de type 2. En fait, de nombreux gènes clés subissent une modification de leur état de méthylation en présence des composants du syndrome métabolique. Cela montre que la méthylation de l'ADN est un processus important dans l'étiologie du syndrome métabolique. Le premier travail de ce doctorat a porté sur la rédaction d’un article de revue qui a examiné le cadre central du syndrome métabolique et analyser le rôle des modifications épigénétiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiométaboliques. D’autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées et traitées avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l’inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altérations de de la défense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnées de modifications épigénétiques. De plus, la pré-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-désoxycytidine, un agent de déméthylation et/ou l’antioxydant Trolox a normalisé la défense antioxydante, réduit la peroxydation des lipides et prévenu l'inflammation. Ce premier travail a démontré que les modifications du redox et l’inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements épigénétiques, plus particulièrement des changements dans la méthylation de l’ADN. Pour mieux définir l’impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d’Inde âgés de trois jours ont été séparés en trois groupes : 1) Témoins: alimentation régulière; 2) Nutrition parentérale (NP) 3) H2O2 : Témoins + 350 uM H2O2. Après quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont été stoppées et les animaux sacrifiés pour la collecte des foies. Pour l’autre groupe d’animaux, les perfusions ont été arrêtées et les animaux ont eu un accès libre à une alimentation régulière jusqu'à la fin de l’étude, huit semaines plus tard où ils ont été sacrifiés pour la collecte des foies. Ceci a démontré qu’à une semaine de vie, l'activité DNMT et les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient inférieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. A neuf semaines de vie, l’activité DNMT est restée basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. Ce travail a démontré que l'administration de NP ou de H2O2, tôt dans la vie, induit une hypométhylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activité DNMT. Finalement, des souris ayant reçu une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ont été utilisées comme modèle in vivo de syndrome métabolique. Les souris ont été nourris soit avec un régime standard chow (témoins), soit avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une diète HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPARα et de PPARδ, pendant 12 semaines. La diète HFHS était efficace à induire un syndrome métabolique étant donnée l’augmentation du poids corporel, du poids hépatique, des adiposités viscérales et sous-cutanées, de l’insensibilité à l’insuline, des lipides plasmatiques et hépatiques, du stress oxydant et de l’inflammation au niveau du foie. Ces perturbations étaient accompagnées d’une déficience dans l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ concomitant avec une hyperméthylation de leurs promoteurs respectifs. L’ajout de GFT505 à la diète HFHS a empêché la plupart des effets cardiométaboliques induits par la diète HFHS via la modulation négative de l’hyperméthylation des promoteurs, résultant en l’augmentation de l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ. En conclusion, GFT505 exerce des effets métaboliques positifs en améliorant le syndrome métabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications épigénétiques des gènes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thèse ont démontré que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d’importants changements épigénétiques pouvant conduire au développement du syndrome métabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prévention de la reprogrammation fœtale et du développement du syndrome métabolique. Puisque les mécanismes suggèrent que le stress oxydant agit principalement sur les métabolites du cycle de la méthionine pour altérer l’épigénétique, une supplémentation en ces molécules ainsi qu’en antioxydants permettrait de restaurer l’équilibre redox et épigénétique.

Le rôle de la méthylation de l’ADN dans les fonctions cérébrales fronto-limbiques et la réactivité au stress quotidien

La sérotonine (5-HT) joue un rôle crucial dans l'étiologie des troubles mentaux comme la dépression majeure, les troubles de comportement et les troubles anxieux. Des études ont montré que des altérations précoces du système 5-HT peuvent potentiellement influencer le développement du cerveau et le fonctionnement du système fronto-limbique, engendrant des conséquences pour la régulation émotionnelle. Il existe aussi des évidences que le stress précoce peut affecter la méthylation de l'ADN résultant d'une altération de l'expression génique. Toutefois, le lien entre la méthylation de l'ADN et la réactivité comportementale à des facteurs de stress de la vie quotidienne est inconnu. La méthylation du gène transporteur 5-HT (SLC6A4) est d'un intérêt particulier, étant donné le rôle de SLC6A4 dans le développement du cerveau, les troubles mentaux et la régulation du stress. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'association entre (1) les niveaux périphériques de méthylation de l'ADN dans le gène SLC6A4 et les réponses neurales aux stimuli émotionnels dans les circuits fronto-limbiques du cerveau, ainsi qu’entre (2) la méthylation périphérique de SLC6A4 et la réactivité comportementale au stress de la vie quotidienne. Nous explorons également l'association entre les réponses neuronales fronto-limbique à des stimuli émotionnels et la réactivité comportementale au stress de la vie quotidienne (3). À cette fin, vingt-deux personnes (11 femmes) d’âge moyen de 34,0 ans (SD : 1,5) avec différents niveaux de méthylation au gène SLC6A4 ont été recrutés à partir de deux études longitudinales. Les participants ont subi une analyse IRMf qui comprenait une tâche de traitement émotionnel. Un questionnaire en ligne sur la réactivité au stress quotidien de la vie a été réalisé pendant 5 jours consécutifs. Des analyses corrélationnelles et de régression ont été effectuées pour examiner les associations entre les variables primaires. Les résultats préliminaires de cette étude ont montré que la méthylation de l'ADN est associée à la désactivation significative du gyrus précentral et gyrus fusiforme respectivement face à des stimuli de peur et de tristesse. Aucune association significative n'a été observée entre les niveaux de méthylation et l'activation de l'amygdale. En outre, les scores obtenus aux variables de stress de la vie quotidienne tels que la détresse chronique ont été associées à la désactivation du précuneus et du cortex cingulaire postérieur face à la tristesse. Ces résultats suggèrent l'implication potentielle des processus épigénétiques dans l'activation cérébrale spécifique et la sensibilité au stress de la vie courante.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Proscillaridin A effects on histone acetylation and C-MYC degradation in acute lymphoblastic leukemia

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA.

O6-Methylguanine-DNA-Methyltransferase methylation: prevalence and predictive value in head and neck squamous cell carcinoma

Introduction: Le gène O6-méthylguanine-ADN méthyltransferase (MGMT) code pour une enzyme spécifique réparatrice de l’ADN qui protège les cellules de la toxicité des agents alkylants. Ainsi, l’activité du MGMT est un mécanisme majeur de résistance aux agents alkylants. Il a été démontré qu’une diminution de l’expression du gène MGMT par une hyperméthylation du promoteur résulte en une amélioration de la survie chez les patients avec certains types de tumeurs qui sont traitées avec des agents chimiothérapeuthique alkylants. Objectifs: Déterminer la prévalence de la méthylation du gène MGMT chez des patients avec des cancers épidermoïdes localement avancés de la sphère ORL traités avec chimioradiothérapie et évaluer l’impact de cette méthylation sur la survie. Méthodes: Sur 428 patients consécutifs, traités avec chimioradiothérapie à notre institution et suivis pour un période médiane de 37 mois, 199 spécimens chirurgicaux paraffinés ont été récupérés. L’ADN était extrait et modifié par le traitement au bisulfite. Une réaction en chaîne de la polymérase, spécifique à la méthylation était entreprise pour évaluer l’état de méthylation du promoteur du gène du MGMT. Les résultats de laboratoire étaient corrélés avec la réponse clinique. L’analyse statistique était exécutée à l’aide du test de Fisher pour les données catégoriques et à l’aide des courbes de Kaplan-Meier pour les échecs au traitement. Résultats : Des 199 extraits d’ADN initiaux, 173 (87%) étaient modifiés au bisulfite avec succès. Des ces spécimens modifiés, 71 (41%) ont démontré une hyperméthylation du MGMT. Pour les cas de méthylation et nonméthylation du MGMT, les caractéristiques des patients n’étaient pas significativement différentes. Les taux de réponse étaient 71 et 73% (p=NS) respectivement. Le contrôle locorégional était respectivement 87 et 77% (p=0.26), la survie sans maladie était 80 et 60% (p=0.38), la survie sans métastase à distance était 92 et 78% (p=0.08) et la survie globale était 64 et 62% (p=0.99) à 3 ans. Conclusions : L’état de méthylation du MGMT est fortement prévalent (41%) et semble avoir un possible impact bénéfique sur la survie quand la chimioradiothérapie est administrée aux patients avec des stades avancés de cancers tête et cou.