Traitement de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par la photophérèse extra corporelle au TH9402 : m écanisme de régulation de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par les cellules T régulatrices

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) est la principale cause de mortalité et de morbidité suite aux greffes de cellules souches hématopoïétiques. Plusieurs patients demeurent réfractaires aux traitements actuels ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies afin de combattre cette maladie. Dans l’étude qui suit, nous avons utilisé un nouvel agent thérapeutique, le TH9402, une molécule photosensible et démontré qu’elle permet, lorsqu’exposée à la lumière visible (514 nm), d’éliminer sélectivement les cellules T activées in vivo tout en préservant les cellules T au repos et les cellules T régulatrices (Tregs). Les Tregs ainsi préservés peuvent abroger la réponse alloréactive par la sécrétion d’IL-10 ou par contact cellule-cellule via un mécanisme impliquant le CTLA-4. Nous avons découvert que la signalisation du CTLA-4 était associée à une hausse de la population Treg in vitro. Cette hausse est due à la conversion de cellules T CD4+CD25- en Tregs et non à une prolifération sélective des Tregs. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons démontré que la signalisation de CTLA-4 était associée à une augmentation de l’expression de la protéine Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). Ces effets nécessitent la déplétion du tryptophane ainsi que de la protéine de phase aigue GCN2. Finalement, nous avons observé que l’infusion de cellules traitées au TH9402 chez des patients souffrant de GVHD chronique est associée à une augmentation de la population Treg chez ces patients sans causer de lymphopénie ni de diminution de la réponse immunitaire dirigée contre les antigènes viraux. Ces résultats suggèrent que le traitement au TH9402 pourrait représenter une approche particulièrement intéressante pour le traitement de la GVHD chronique réfractaire aux traitements actuels. De plus, l’augmentation de l’expression d’IDO pourrait être utilisée comme valeur prédictive de la réponse du patient au traitement. Ceci pourrait permettre d’améliorer la qualité de soins ainsi que de la qualité de vie des patients souffrant de GVHD chronique.

Mechanisms of translation regulation in long-term synaptic plasticity

Les souvenirs sont encodés dans le cerveau grâce aux configurations uniques de vastes réseaux neuronaux. Chaque connexion dans ces circuits est apte à être modifiée. Ces changements durables s’opèrent au niveau des synapses grâce à une synthèse de protéines de novo et génèrent ce qu’on nomme des traces mnésiques. Plusieurs preuves indiquent que, dans certaines formes de plasticité synaptique à long terme, cette synthèse a lieu dans les dendrites près des synapses activées plutôt que dans le corps cellulaire. Cependant, les mécanismes qui régulent cette traduction de protéines demeurent encore nébuleux. La phase d’initiation de la traduction est une étape limitante et hautement régulée qui, selon plusieurs chercheurs, constitue la cible principale des mécanismes de régulation de la traduction dans la plasticité synaptique à long terme. Le présent projet de recherche infirme cette hypothèse dans une certaine forme de plasticité synaptique, la dépression à long terme dépendante des récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR-LTD). À l’aide d’enregistrements électrophysiologiques de neurones hippocampiques en culture couplés à des inhibiteurs pharmacologiques, nous montrons que la régulation de la traduction implique les étapes de l’élongation et de la terminaison et non celle de l’initiation. De plus, nous démontrons grâce à des stratégies de knockdown d’expression d’ARN que la protéine de liaison d’ARNm Staufen 2 joue un rôle déterminant dans la mGluR-LTD induite en cultures. Dans leur ensemble, les résultats de la présente étude viennent appuyer un modèle de régulation de la traduction locale de protéines qui est indépendante de l’initiation.

Feedback regulation of Gab2-dependent signaling by the Ras/MAPK pathway

La voie de signalisation des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation et la motilité. Une régulation anormale des RTKs mène à plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalité chez les femmes à cause de l’amplification et la mutation fréquente de la protéine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protéine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour réguler de multiples voies de signalisation. En réponse à la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recruté à la membrane plasmique où il potentialise l’activation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus d’occuper un rôle essentiel durant le développement du système hématopoïétique, Gab2 est souvent amplifié dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mélanomes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est établi que lors de l’activation des RTKs, Gab2 est phosphorylé au niveau de plusieurs résidus Tyrosine, menant à l’association de différentes protéines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que d’autres groupes de recherche avons identifié que Gab2 est aussi phosphorylé au niveau de résidus Ser/Thr suite à l’activation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la régulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est régulé par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilisé différentes approches. Dans la première partie de ma thèse, nous avons déterminé un nouveau mécanisme démontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phénomène se produit à la fois in vivo et in vitro au niveau de trois résidus Ser/Thr conservés. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant à l’augmentation de la motilité cellulaire, ce qui suggère que les protéines RSK restreignent les fonctions dépendantes de Gab2. Ce phénomène est le résultat de la participation de RSK dans la boucle de rétroaction négative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que les protéines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs résidus pS/T-P à la fois in vitro et in vivo, entrainant l’inhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons établi pour la première fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de l’activation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montré un nouveau domaine d’attache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les résidus essentiels de ce domaine d’attache n’entrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent également la phosphorylation dépendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos données montrent que la voie de signalisation MAPK régule les fonctions de la protéine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thèse élabore par ailleurs un schéma complet des fonctions de Gab2 dépendantes de la voie de signalisation MAPK dans le développement de nombreux cancers.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.

Biochemical mechanisms involved in pulmonary hypo-alveolarization induced by peroxides contaminating parenteral nutrition in newborn guinea pig

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP), caractérisée par un défaut de l’alvéolarisation, est une complication pathologique associée à un stress oxydant chez le nouveau-né prématuré. La DBP est présente chez près de 50 % des nouveau-nés de moins de 29 semaines de gestation. La nutrition parentérale (NP) que ces nouveau-nés reçoivent pour cause d’immaturité gastro-intestinale est une source importante de stress oxydant. En effet, leur NP est contaminée par des peroxydes, dont l’ascorbylperoxyde qui est une forme peroxydée du déshydroascorbate. La génération des peroxydes est catalysée par la lumière ambiante. La photoprotection de la NP, quoique difficile d’application en clinique, est associée à une diminution de l’incidence de la DBP chez les enfants prématurés. Chez l’animal nouveau-né, la photoprotection de la NP est associée à un meilleur développement alvéolaire. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que l’ascorbylperoxide infusé avec la NP cause la perte d’alvéoles suite à une apoptose exagérée induite par l’oxydation du potentiel redox du glutathion. Cette oxydation du potentiel redox serait occasionnée par l’inhibition de la transformation hépatique de la méthionine en cystéine, menant à une diminution de la synthèse de glutathion au foie et dans les tissus tels que les poumons. La confirmation de cette hypothèse suggérera qu’un ajout de glutathion dans la NP permettra une meilleure détoxification de l’ascorbylperoxide par l’action de la glutathion peroxydase, et préviendra l’oxydation du potentiel redox et ainsi, la perte d'alvéoles par apoptose. Objectifs : Le but de mon projet de recherche est de comprendre les mécanismes biochimiques liant la NP et le développement de la DBP chez le nouveau-né prématuré et de proposer une alternative nutritionnelle prévenant le développement de cette complication fréquemment observée dans cette population. Les objectifs spécifiques sont : 1) d’évaluer l’impact, au poumon, de l’infusion de l’ascorbylperoxyde sur l’axe métabolique potentiel redox du glutathion - apoptose - le développement alvéolaire; 2) d’étudier l’impact de l’ascorbylperoxyde et du potentiel redox sur l’activité hépatique de la méthionine adénosyltransférase (MAT), première enzyme de la cascade métabolique transformant la méthionine en cystéine; et 3) de tenter de prévenir l’impact négatif de la NP ou de l’infusion d’ascorbylperoxyde sur le poumon en améliorant le statut en glutathion. Méthodes: Par un cathéter fixé dans la jugulaire, des cochons d’Inde de trois jours de vie (n = 8 par groupe) ont reçu en continu durant 4 jours une NP ou une solution de base (dextrose + NaCl) enrichie des différentes molécules à l’essai. Le premier objectif a été atteint en enrichissant la solution de base en ascorbylperoxyde à 0, 20, 60 et 180 μM. Ces solutions contenaient ou non 350 μM H2O2 pour se rapprocher des conditions cliniques. Le second objectif a été atteint en investiguant les mécanismes d’inhibition de la MAT dans des animaux infusés ou non avec des solutions contenant la solution de base, des peroxydes, du glutathion et la NP (dextrose + acides aminés + multivitamines + lipides). Le troisième objectif a été atteint en ajoutant ou non à une solution d’ascorbylperoxide ou à la NP 10 μM de glutathion (GSSG), afin d’obtenir une concentration plasmatique normale de glutathion. Après 4 jours, les poumons étaient prélevés et traités pour la détermination de GSH et GSSG par électrophorèse capillaire, le potentiel redox était calculé selon l'équation de Nernst et le niveau de caspase-3 actif (marqueur d’apoptose) par Western blot et l’index d’alvéolarisation quantifié par le nombre d’interceptes entre des structures histologiques et une droite calibrée. Les données étaient comparées par ANOVA, les effets étaient considérés comme significatifs si le p était inférieur à 0,05. Résultats: L’infusion de l’ascorbylperoxyde, indépendamment du H2O2, a induit une hypoalvéolarisation, une activation de la caspase-3 et une oxydation du potentiel redox de manière dose-dépendante. Ces effets ont été empêchés par l’ajout de GSSG à la NP ou à la solution d’ascorbylperoxyde (180 M). L’ascorbylperoxyde et le H2O2 ont inhibé l’activité de MAT tandis qu’elle était linéairement modulée par la valeur du potentiel redox hépatique. Conclusion : Nos résultats suggèrent que l’ascorbylperoxyde est l’agent actif de la NP conduisant au développement de la DBP. Ainsi la correction des bas niveaux de glutathion induits par les peroxydes de la NP favorise la détoxification des peroxydes et la correction du potentiel redox pulmonaire ; ce qui a protégé les poumons des effets délétères de la NP en outrepassant l’inhibition de la MAT hépatique. Nos résultats sont d'une grande importance car ils donnent de l'espoir pour une prévention possible de la DBP.