19 resultados para Cytosolic Na
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.
Resumo:
Lexpansion des maladies mtaboliques dans les socits modernes exige plus dactivits de recherche afin daugmenter notre comprhension des mcanismes et lidentification de nouvelles cibles dinterventions cliniques. Lobsit, la rsistance linsuline (RI) et la dyslipidmie, en particulier sont tous des facteurs de risque associs la pathogense du diabte de type 2 (DT2) et des maladies cardiovasculaires. Ainsi, la dyslipidmie postprandiale, notamment la surproduction des lipoprotines hpatiques et intestinales, contribue dune faon significative lhypertriglycridmie. Quoique plusieurs tudes cliniques et fondamentales chez lhomme et les modles animaux aient mis en vidence les rles importants jous par le foie et lintestin dans la dyslipidmie, les mcanismes molculaires en cause ne sont pas bien lucids. Lune des voies principales rgulant le mtabolisme lipidique est la voie de la protine kinase AMPK. Lpuisement de lATP intracellulaire entrane une activation de lAMPK qui va uvrer pour rtablir lquilibre nergtique en stimulant des voies gnratrices dATP et en inhibant des voies anaboliques consommatrices dATP. Les effets positifs de lactivation de lAMPK comprennent laugmentation de la sensibilit linsuline dans les tissus priphriques, la rduction de lhyperglycmie et la rduction de la lipogense, do son importance dans les interventions cliniques pour la correction des drangements mtaboliques. Il est souligner que le rle de lAMPK dans le foie et lintestin semble plus complexe et mal compris. Ainsi, la voie de signalisation de lAMPK nest pas bien lucide dans les situations pathologiques telles que le DT2, la RI et lobsit. Dans le prsent projet, notre objectif consiste caractriser le rle de cette voie de signalisation dans la lipogense hpatique et dans le mtabolisme des lipides dans lintestin chez le Psammomys obesus, un modle animal dobsit, de RI et de DT2. cette fin, 3 groupes danimaux sont tudis (i.e. contrle, RI et DT2). En caractrisant la voie de signalisation de lAMPK/ACC dans le foie, nous avons constat une augmentation de lexpression gnique des enzymes cls de la lipogense (ACC, FAS, SCD-1 et mGPAT) et des facteurs de transcription (ChREBP, SREBP-1) qui modulent leur niveau dexpression. Nos analyses dtailles ont rvl, par la suite, une nette augmentation de lexpression de lisoforme cytosolique de lACC, ACC1 (impliqu dans la lipogense de novo) concomitante avec une invariabilit de lexpression de lisoforme mitochondrial ACC2 (impliqu dans la rgulation ngative de la -oxydation). En dpit dun tat adaptatif caractris par une expression protique et une phosphorylation (activation) leves de lAMPK, lactivit de la kinase qui phosphoryle et inhibe lACC reste trs leve chez les animaux RI et DT2. Au niveau de lintestin grle des animaux RI et DT2, nous avons dmontr que laugmentation de la lipogense intestinale est principalement associe avec une diminution de la voie de signalisation de lAMPK (i.e. expression protique et phosphorylation/activation rduites des deux isoformes AMPK1 et AMPK2). La principale consquence de la diminution de lactivit AMPK est la rduction de la phosphorylation de lACC. tant donn que le niveau dexpression totale dACC reste inchang, nos rsultats suggrent donc une augmentation de lactivit des deux isoformes ACC1 et ACC2. En parallle, nous avons observ une rduction de lexpression protique et gnique de la CPT1 [enzyme cl de la -oxydation des acides gras (AG)]. Lensemble de ces rsultats suggre une inhibition de loxydation des AG concomitante avec une stimulation de la lipogense de novo. Enfin, nous avons dmontr que lintestin grle est un organe sensible laction de linsuline et que le dveloppement de la rsistance linsuline pourrait altrer les deux voies de signalisation (i.e. Akt/GSK3 et p38MAPK) essentielles dans plusieurs processus mtaboliques. En conclusion, nos rsultats indiquent que laugmentation de la lipogense qui contribue pour une grande partie la dyslipidmie dans la rsistance linsuline et le diabte serait due, en partie, des dfauts de signalisation par lAMPK. Nos observations illustrent donc le rle crucial du systme AMPK au niveau hpatique et intestinal, ce qui valide lapproche thrapeutique consistant activer lAMPK pour traiter les maladies mtaboliques.
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Le bleuet dmontre un potentiel thrapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodgnratives. Ces effets bnfiques sont attribuables aux composs phnoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonodes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composs phnoliques et son activit anti-oxydante, et modifie ses activits physiologiques. Lobjectif de la prsente tude est dvaluer lactivit neuroprotectrice et le potentiel antidiabtique du jus de bleuet biostranform (BJ). Le BJ est tudi dans diffrents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde dhydrogne; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) Lactivit anti-hyperglycmique chez les souris obses diabtiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal na aucun effet, le BJ augmente lactivit des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protge les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicit induite par le peroxyde dhydrogne. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation nest pas explique par une augmentation du calcium cytosolique mais plutt par une stimulation de la phosphorylation de lAMPK. De plus, le BJ inhibe ladipogense chez les 3T3-L1. Le BJ diminue galement lhyperglycmie chez les souris obses diabtiques KKAy et protge les jeunes souris pr-diabtiques contre le dveloppement de lobsit et du diabte. Lactivit anti-hyperglycmique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau dadiponectine chez les souris diabtiques. Le BJ reprsente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabte et les maladies neurodgnratives et une source de nouveaux agents thrapeutiques contre ces maladies.
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Le diabte est une maladie mtabolique qui se caractrise par une rsistance linsuline des tissus priphriques et par une incapacit des cellules pancratiques scrter les niveaux dinsuline appropris afin de compenser pour cette rsistance. Pour mieux comprendre les mcanismes dficients dans les cellules des patients diabtiques, il est ncessaire de comprendre et de dfinir les mcanismes impliqus dans le contrle de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Dans les cellules pancratiques, le mtabolisme du glucose conduit la production de facteurs de couplage mtabolique, comme lATP, ncessaires la rgulation de lexocytose des vsicules dinsuline. Le mcanisme par lequel la production de lATP par le mtabolisme oxydatif du glucose dclenche lexocytose des vsicules dinsuline est bien dcrit dans la littrature. Cependant, il ne peut lui seul rguler adquatement la scrtion dinsuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage mtaboliques qui ont t suggrs afin de relier le mtabolisme du glucose la rgulation de la scrtion dinsuline. Les mcanismes impliqus demeurent cependant tre caractriss. Le but de la prsente thse tait de dterminer limplication des navettes du pyruvate, dcoulant du mtabolisme mitochondrial du glucose, dans la rgulation de la scrtion dinsuline. Dans les cellules , les navettes du pyruvate dcoulent de la combinaison des processus danaplrose et de cataplrose et permettent la transduction des signaux mtaboliques provenant du mtabolisme du glucose. Dans une premire tude, nous nous sommes intresss au rle de la navette pyruvate/citrate dans la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose, puisque cette navette conduit la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage mtabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux mtabolique travers la glycolyse en roxydation le NADH. Une tude effectue prcdemment dans notre laboratoire avait suggr la prsence de cette navette dans les cellules pancratique. Afin de tester notre hypothse, nous avons cibl trois tapes de cette navette dans la ligne cellulaire pancratique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et lactivit de lATP-citrate lyase (ACL) et lenzyme malique (MEc), deux enzymes cls de la navette pyruvate/citrate. Linhibition de chacune de ces tapes par lutilisation dun inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interfrant a corrl avec une rduction significative de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Les rsultats obtenus suggrent que la navette pyruvate/citrate joue un rle critique dans la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Paralllement notre tude, deux autres groupes de recherche ont suggr que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate taient aussi importantes pour la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Ainsi, trois navettes dcoulant du mtabolisme mitochondrial du glucose pourraient tre impliques dans le contrle de la scrtion dinsuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage mtabolique possiblement trs important pour la scrtion dinsuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est form par MEc, alors que lisocitrate dshydrognase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate. Dans notre premire tude, nous avions dmontr limportance de lexpression de ME pour la scrtion adquate dinsuline en rponse au glucose. Dans notre deuxime tude, nous avons test limplication de IDHc dans les mcanismes de rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. La diminution de lexpression de IDHc dans les INS 832/13 a stimul la scrtion dinsuline en rponse au glucose par un mcanisme indpendant de la production de lATP par le mtabolisme oxydatif du glucose. Ce rsultat a ensuite t confirm dans les cellules disperses des lots pancratiques de rat. Nous avons aussi observ dans notre modle que lincorporation du glucose en acides gras tait augmente, suggrant que la diminution de lactivit de IDHc favorise la redirection du mtabolisme de lisocitrate travers la navette pyruvate/citrate. Un mcanisme de compensation travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la scrtion dinsuline observe en rponse la diminution de lexpression de IDHc. Les travaux effectus dans cette deuxime tude remettent en question limplication de lactivit de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate, dans la transduction des signaux mtaboliques reliant le mtabolisme du glucose la scrtion dinsuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate conduire la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules . Le malonyl-CoA rgule le mtabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transfrase 1, lenzyme limitante dans loxydation des acides gras. Ainsi, llvation des niveaux de malonyl-CoA en rponse au glucose entrane une redirection du mtabolisme des acides gras vers les processus destrification puis de lipolyse. Plus prcisment, les acides gras sont mtaboliss travers le cycle des triglycrides/acides gras libres (qui combinent les voies mtaboliques destrification et de lipolyse), afin de produire des molcules lipidiques signaltiques ncessaires la modulation de la scrtion dinsuline. Des tudes effectues prcdemment dans notre laboratoire ont dmontr que lactivit lipolytique de HSL (de langlais hormone-sensitive lipase) tait importante, mais non suffisante, pour la rgulation de la scrtion dinsuline. Dans une tude complmentaire, nous nous sommes intresss au rle dune autre lipase, soit ATGL (de langlais adipose triglyceride lipase), dans la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose et aux acides gras. Nous avons dmontr que ATGL est exprim dans les cellules pancratiques et que son activit contribue significativement la lipolyse. Une rduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interfrant ou son absence dans les lots pancratiques de souris dficientes en ATGL a conduit une rduction de la scrtion dinsuline en rponse au glucose en prsence ou en absence dacides gras. Ces rsultats appuient lhypothse que la lipolyse est une composante importante de la rgulation de la scrtion dinsuline dans les cellules pancratiques. En conclusion, les rsultats obtenus dans cette thse suggrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Ce mcanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du mtabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question limplication de la navette pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate dans la rgulation de la scrtion dinsuline. Le rle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant tre dtermin. Finalement, nos travaux ont aussi dmontr un rle pour ATGL et la lipolyse dans les mcanismes de couplage mtabolique rgulant la scrtion dinsuline.
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Le VIH-1 a dvelopp plusieurs mcanismes menant la dgradation de son rcepteur cellulaire, la molcule CD4, dans le but daugmenter la relche de particules virales infectieuses et dviter que la cellule soit surinfecte. Lun de ces mcanismes est la dgradation, induite par la protine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthtis au niveau du rticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter lubiquitine ligase cellulaire SCF-TrCP, via sa liaison -TrCP, afin de dgrader CD4. Puisque CD4 doit tre retenu au RE pour permettre Vpu dinduire sa dgradation via le systme ubiquitine-protasome, il a t suggr que ce processus implique un mcanisme semblable une voie cellulaire de dgradation des protines mal-replies appele ERAD ( endoplasmic reticulum-associated degradation ). La dgradation par ERAD implique gnralement la dislocation des protines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dgradation par le protasome. Nous avons dmontr que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos rsultats suggrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin dtre dgrad par le protasome en prsence de Vpu. De plus, un mutant transdominant ngatif de lATPase p97, qui est implique dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe compltement la dgradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos rsultats ont montr que lubiquitination sur des rsidus accepteurs de lubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 ntait pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dgradation de CD4. Ce rsultat suggre que lubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait reprsenter un vnement important dans le processus de dgradation induit par Vpu. Lattachement de lubiquitine a gnralement lieu sur les lysines de la protine cible. Toutefois, lubiquitination sur des rsidus non-lysine (srine, thronine et cystine) a aussi t dmontre. Nous avons dmontr que la mutation de tous les sites potentiels dubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dgradation par Vpu. De plus, la prsence de cystines dans la queue cytoplasmique apparat suffisante pour rendre CD4 sensible Vpu en absence de lysine, srine et thronine. Afin dexpliquer ces rsultats, nous proposons un modle dans lequel lubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait ncessaire sa dgradation et o les sites dubiquitination de CD4 seraient slectionns de faon non spcifique par lubiquitine ligase recrute par Vpu. Enfin, nous avons observ que la co-expression dune protine Vpu incapable de recruter -TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, dautres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter -TrCP et CD4 sont toutefois incapables dinduire sa dgradation. Ces rsultats suggrent que lassociation de Vpu CD4 et -TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dgradation de CD4. Par consquent, ces rsultats soulvent la possibilit que Vpu puisse recruter dautres facteurs cellulaires pour induire la dgradation de CD4. Les rsultats prsents ont permis de mieux dfinir le mcanisme de dgradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces rsultats nous ont permis dlaborer un modle dans lequel lubiquitine ligase cellulaire SCF-TrCP dmontre de la flexibilit dans le choix des rsidus ubiquitiner afin dinduire la dgradation de CD4. Enfin, ces tudes jettent un oeil nouveau sur le rle de Vpu dans ce processus puisque nos rsultats suggrent que Vpu doive recruter dautres partenaires cellulaires, mis part -TrCP, pour induire la dgradation de CD4.
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PHEX est une protine importante dans le processus de minralisation osseuse. Des mutations ou la dltion dune partie de ce gne causent lhypophosphatmie lie au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractrise par une hypophosphatmie, accompagne de dfauts de minralisation, de rachitisme et de lsions ostomalaciques. Avec lhypophosphatmie, les taux circulants de vitamine D devraient tre augments, ce qui nest pas le cas do une rgulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgr le fait que cette protine soit une peptidase, aucun substrat physiologique na encore t rpertori pour PHEX. PHEX est une protine membranaire de type II de la famille M13 des mtalloendopeptidases zinc possdant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire denviron 20 acides amins et une large portion C-terminale extracellulaire o se trouve le site actif de lenzyme. PHEX est exprime de faon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparat linitiation de la minralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modle animal de la maladie humaine, montrent des quantits importantes de la protine FGF23. De plus, FGF23 est impliqu dans une autre maladie relie au mtabolisme du phosphate, lhypophosphatmie rachitique autosomale dominante (ADHR) o des mutations de FGF23 causent sensiblement les mmes symptmes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostoblastes et les ostocytes. FGF23 cause une hypophosphatmie par la diminution de lexpression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la rabsorption du phosphate rnal. Lhypothse propose dans la littrature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minralisation osseuse. Plus spcifiquement, lactivation ou linactivation de ces peptides aurait pour rle de rguler les quantits de FGF23. Selon lhypothse mentionne prcdemment, la rgulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minralisation. Une quantit croissante de donnes sur la rgulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue lexpression de PHEX tandis que les glucocorticodes et lhormone de croissance augmentent son expression. Dans une premire tude, nous avons voulu dterminer si un peptide reli la minralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait rguler lexpression de PHEX. Nous avons dtermin que le PTHrP1-34 peut rguler de faon ngative lexpression de PHEX dans les cellules UMR-106, une ligne cellulaire ostoblastique. Cette rgulation passe par la voie de lAMPc/protine kinase A. De plus, cette diminution dexpression est galement observe au jour 7 dans des cultures primaires dostoblastes de rat en minralisation. Par la suite, nous avons tudi un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouv chez un patient souffrant de XLH, o la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation ninterfre pas avec le site catalytique de lenzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthtique que la protine sauvage. Il a t dtermin que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons dmontr que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX COPII, responsable de la formation de vsicules de scrtion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, lincorporation de PHEX dans des vsicules de calcification, lesdites vsicules tant importantes dans le processus de minralisation. Finalement, des essais de comptitions ont dmontr que la minralisation pouvait tre perturbe lorsque lon surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement la queue mute. Ceci suggre possiblement que linteraction avec COPII menant lincorporation de PHEX dans les vsicules de calcification ou dautres protines comprenant de tels motifs pourrait tre importante pour la minralisation. Finalement, la dernire tude porte sur la protine FGF23. Nous avons dmontr, par la surexpression de FGF23 dans la ligne MC3T3 dostoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la snescence de ces cellules. En effet, des essais de snescence ont montr laugmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprim. Par contre, la prolifration nest pas altre. De plus, il semblerait que la diffrenciation soit plus rapide, tel quobserv par une minralisation survenant plus tt, mais ntant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostoblastes se diffrencient plus rapidement et passent donc un tat de snescence prmatur comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littrature o KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinit sur son rcepteur, lorsquinactiv dmontre un phnotype similaire au vieillissement incluant un phnotype de snescence.
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La fertilisation chez les plantes dpend de la livraison des cellules spermatiques contenues dans le pollen lovule. Au contact du stigmate, le grain de pollen shydrate et forme une protubrance, le tube pollinique, charg de livrer les noyaux spermatiques lovule. Le tube pollinique est une cellule croissance rapide, anisotrope et non autotrophe; ainsi tout au long de sa croissance travers lapoplaste du tissu pistillaire, le tube pollinique puise ses sources de carbohydrates et de minraux du pistil. Ces lments servent la synthse des constituants de la paroi qui seront achemins par des vsicules de scrtion jusqu lapex du tube. Ce dernier doit aussi rsister des pressions mcaniques pour maintenir sa forme cylindrique et doit rpondre diffrents signaux directionnels pour pouvoir atteindre lovule. Mon projet de doctorat tait de comprendre le rle du cytosquelette dans la croissance anisotrope du tube pollinique et didentifier les lments responsables de sa croissance et de son guidage. Le cytosquelette du tube pollinique est compos des microfilaments dactine et des microtubules. Pour assurer une bonne croissance des tubes polliniques in vitro, les carbohydrates et les lments de croissance doivent tre ajouts au milieu des concentrations bien spcifiques. Jai donc optimis les conditions de croissance du pollen dArabidopsis thaliana et de Camellia japonica qui ont t utiliss avec le pollen de Lilium longiflorum comme modles pour mes expriences. Jai dvelopp une mthode rapide et efficace de fixation et de marquage du tube pollinique base sur la technologie des microondes. Jai aussi utilis des outils pharmacologiques, mcaniques et molculaires coupls diffrentes techniques de microscopie pour comprendre le rle du cytosquelette dactine lors de la croissance et le tropisme du tube pollinique. Jai trouv que le cytosquelette dactine et plus prcisment lanneau dactine localis dans la partie sub-apicale du tube est fortement impliqu dans la croissance et le maintien de larchitecture du tube travers le contrle de la livraison des vsicules de scrtion. Jai construit une chambre galvanotropique qui peut tre monte sur un microscope invers et qui sert envoyer des signaux tropistiques bien prcis des tubes polliniques en croissance. Jai trouv que les filaments dactine sont impliqus dans la capacit du tube pollinique changer de direction. Ce comportement tropistique dpend de la concentration du calcium dans le milieu de croissance et du flux de calcium travers des canaux calciques. Le gradient de calcium tabli dans le tube pollinique affecte lactivit de certaines protines qui se lient lactine et dont le rle est la rorganisation des filaments dactine. Parmi ces protines, il y a celles de dpolymrisation de lactine (ADF) dont deux spcifiquement exprimes dans le gamtophyte mle dArabidopsis (ADF7 et ADF10). Par marquage avec des proteins fluorescents, jai trouv que lADF7 et lADF10 ont des expressions diffrentielles pendant la microsporogense et la germination et croissance du tube pollinique et quelles partagent entre elles des rles importants durant ces diffrents stades.
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Lautophagie est un processus cellulaire catabolique qui a t conserv durant lvolution de la levure lhomme. Cet important mcanisme consiste en une dgradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de lautophagie : la microautophagie, lautophagie mdie par les chaperones et la macroautophagie nomme autophagie . Il a t dmontr que lors de lautophagie, le matriel cytoplasmique (protines cytosoliques et organites) est squestr dans lautophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi lautophagolysosome. Le matriel squestr et la membrane interne de lautophagosome seront dgrads par les hydrolases lysosomales. Plusieurs tudes se sont focalises sur la dtermination de la machinerie molculaire et les mcanismes de lautophagie. Il a t dmontr limplication de 31 molcules Atg essentielles dans le processus de lautophagie. Lidentification de ces protines a permis de dceler le rle de lautophagie non seulement dans le maintien de lhomostasie cellulaire mais aussi dans la dfense contre les agents pathognes. En effet, lautophagie joue un rle important dans limmunit inne conduisant contrler lvasion des pathognes dont les bactries et les virus. galement, lautophagie est implique dans limmunit adaptative en favorisant la prsentation des antignes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une tude rcente suggre que lautophagie contribue la prsentation antignique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu dvelopper des mcanismes pour contourner et inhiber en partie le rle protecteur de lautophagie. Rcemment, une tude dans notre laboratoire a mis en vidence, lors dune infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la prsence dune nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de linfection. Cette nouvelle structure est diffrente des autophagosomes classiques double membrane et est caractrise morphologiquement par quatre membranes drives de lenveloppe nuclaire interne et externe. Peu de choses ont t rapportes sur cette nouvelle voie autophagique qui peut tre un mcanisme de dfense cellulaire quand lautophagie classique dans le cytosol est inhibe par HSV-1. Il devient donc intressant de caractriser les molcules impliques dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectromtrie de masse. Pour ce faire, il tait impratif dtablir un outil disolation des noyaux partir de macrophages infects par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront forms. La validation de cette mthode disolation a t effectue en dterminant la puret et lintgrit des noyaux isols partir des cellules non infectes (contrle) et infectes par HSV-1. La puret des prparations de noyaux isols a t caractrise par labsence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. galement, il a fallu dterminer la cintique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignes cellulaires de macrophages utilises dans ce projet. Dans une perspective future, lanalyse protomique partir des chantillons purs des noyaux isols (non infects et infects) mnera identifier les protines impliques dans la formation des autophagosomes drivs des noyaux, ce qui permettra ultrieurement deffectuer des tudes sur les mcanismes molculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.
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Limplantation retarde ou diapause embryonnaire dcrit l'arrt ou le retardement pendant l'embryogense. Chez le vison, la diapause est corrle avec une scrtion pituitaire insuffisante de la prolactine, ayant pour rsultat la diffrentiation incomplte du corpus luteum et rduction de la progestrone. Des tudes antrieures suggrent que le blastocyste de vison en diapause demeure dans un tat de quiescence ou se dveloppe lentement. Pour lucider ceci, la rplication de l'ADN a t tudie. Les rsultats dmontrent synthse de lADN et prolifration cellulaire dans les embryons au stade de morula, avant la diapause et dans les blastocystes aprs la ractivation. La rplication de l'ADN a t galement dtecte dans des blastocystes en diapause et en diapause prolonge. L'implantation est considre comme une interaction bidirectionnelle entre le blastocyste et l'utrus. Il a t montr que les prostaglandines sont importantes pour la vascularisation de lutrus au moment de limplantation et peuvent ractiver l'utrus des visons aprs la diapause. La concentration protinique et la localisation de la phospholipase citosolique A2 (CPLA2) et de la cyclooxygenase 2 (COX2) ont t tudies dans l'utrus de vison. Lexpression de la CPLA2 et COX2 taient sur-rgules au moment de l'implantation. Il est connu que la prolactine active les corpus luteum des visons. L'ide de un lien entre la prolactine et la voie de signalisation des prostaglandines a t teste en mesurant les rcepteurs de prolactine. Les rsultats montrent une augmentation de lexpression des rcepteurs de prolactine l'implantation suggrant que la prolactine pourrait activer la voie de prostaglandine l'utrus par son propre rcepteur. La conclusion, les embryons pendant la diapause ne sont pas arrtes compltement et les protines lies la voie de prostaglandine sont implique dans la ractivation de l'utrus.
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Langiogense, caractrise par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins partir de vaisseaux prexistants, est un processus accompagn par linflammation, impliquant la synthse et la relche de diffrents facteurs de croissance par les cellules inflammatoires. Parmi ces facteurs, seuls le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopotines (Ang1 et Ang2) peuvent participer la rgulation de linflammation et de langiogense. La famille des angiopotines comporte quatre membres, desquels lAng1 et lAng2 ont t les plus tudis. Ces deux mdiateurs inflammatoires sont capables dactiver le rcepteur Tie2, dont lexpression a initialement t rapporte sur les cellules endothliales (CE). Notre laboratoire a t le premier dmontrer lexpression de Tie2 la surface des neutrophiles, ainsi que sa capacit, suite son activation par lAng1 ou lAng2, induire la synthse du facteur dactivation plaquettaire (PAF), lactivation de la 2-intgrine, la migration des neutrophiles ainsi que leur adhsion aux CE. Dautres tudes ont montr que les CE emmagasinent et relchent le VEGF et lAng2, tandis que les pricytes et les cellules musculaires lisses contiennent lAng1. Puisque les neutrophiles relchent le VEGF et que les deux angiopotines ont la capacit dactiver Tie2 sur ces derniers, nous avons voulu dterminer si les neutrophiles contiennent lAng1 et/ou lAng2 et si elles peuvent tre relches suite une stimulation avec des agonistes proinflammatoires. Nous avons dcouvert que lAng1, mais pas lAng2 est prsente dans les neutrophiles, et quelle est relche suite une stimulation au phorbol myristate acetate (PMA). De plus, nous avons dmontr que lAng1 est localise au niveau du cytosol et que sa relche est calcium-indpendante, contrairement au VEGF, qui est localis dans les granules et sa relche est calcium-dpendante. Cette tude dmontre pour la premire fois lexpression et la localisation de lAng1 dans les neutrophiles. Une rcente tude effectue dans notre laboratoire a dmontr que les angiopotines induisent la migration des neutrophiles en activant le rcepteur Tie2 et la voie de la PI3K. De plus, les angiopotines ont potentialis la migration induite par lIL-8. Ainsi, nous avons mis lhypothse que lAng1 et/ou lAng2 seraient capables dinduire la relche et/ou la synthse de lIL-8 par les neutrophiles. Nous avons dmontr pour la premire fois, la capacit de lAng1 induire lexpression de lARNm, ainsi que la synthse et la relche dIL-8 par les neutrophiles. Cependant, un traitement avec lAng2 seule ou en combinaison avec lAng1 na eu aucun effet sur les activits mentionnes ci-dessus. Nous avons aussi observ que la synthse et la relche dIL-8 induite par lAng1 requirent la transcription de lADN en ARNm, suivie par la stabilisation de ce dernier, qui ultimement induit la traduction de lARNm de lIL-8 en sa protine. Finalement, nous avons dmontr que la stimulation des neutrophiles avec lAng1 induit ces activits en activant la voie de la p42/44 MAPK, tout en tant indpendantes de la p38 MAPK et la PI3K/Akt. Ces rsultats sont en lien direct avec une rcente tude dans laquelle nous avons observ que lAng1, mais pas lAng2 est capable daugmenter la survie des neutrophiles via la relche dIL-8.
Caractrisation et tude de la rgulation dune isoforme cytosolique de peroxyrdoxine chez les solanaces
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Les peroxyrdoxines (PRXs) forment une famille de peroxydases communes tous les organismes vivants et ubiquitaires dans la cellule. Leur particularit provient dun ou deux rsidus cystines accomplissant un cycle doxydo-rduction laide dun donneur dlectron. Ces protines thiols sensibles au potentiel redox sont impliques dans le mcanisme de dtoxification du H2O2, une molcule oxydante induite lors de situations de stress. Les PRXs pourraient tre induites par le stress et rgules par phosphorylation. En effet, des exprimentations in vitro ont dmontr que la nucloside diphosphate kinase 1 (NDPK1) a la capacit de phosphoryler une PRX cytosolique de pomme de terre. Ce mmoire dcrit les travaux exprimentaux effectus pour caractriser la fonction de la PRX. Pour cela, le clonage dune isoforme a t effectu, suivi dune caractrisation biochimique et dune tude dexpression de la protine. Les donnes de squenage rvlent quil sagit dune PRX de type II phylogntiquement lie aux PRXs cytosoliques. LADNc codant pour cette peroxyrdoxine (PRX1) a t clon chez Solanum chacoense. Une protine recombinante portant une tiquette (6xHis) en N-terminale a t produite. Des essais enzymatiques ont confirm la fonction antioxydante de la protine recombinante et un anticorps polyclonal a t gnr chez le lapin puis utilis en conjonction avec un anticorps anti-NDPK1 pour dterminer les patrons dexpression gnraux de ces protines chez Solanum lycopersicum et Solanum tuberosum lors de situations de stress. Les donnes dmontrent que les deux protines sont gnralement co-exprimes mais pas co-rgules et que la PRX1 est induite en certaines situations de stress.
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Ce projet a pour but dvaluer la capacit de la voie des pentoses phosphates (VPP) dans les racines transgniques de pomme de terre (Solanum tuberosum) modifies pour exprimer diffrents niveaux de l'hexokinase (HK) et de la triosephosphate isomrase cytosolique (cTPI). Dans les racines, la VPP alimente la voie de lassimilation de lazote en equivalents rducteurs et permet donc la biosynthse des acides amins. Le glucose-6-phosphate produit par lHK est consomm par la partie oxydative de la VPP catalyse par la glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PDH) et la 6-phosphogluconate dshydrognase (6PGDH). Les changements dans l'expression de HK et cTPI peuvent affecter le fonctionnement de la VPP et les mcanismes qui sont lis lutilisation des quivalents rducteurs produits par la VPP, comme l'assimilation de lazote et la synthse des acides amins. Afin dvaluer leffet des manipulations gntiques de lHK et de la cTPI sur lassimilation de lazote, nous avons cultiv les racines transgniques sur des milieux contenant des concentrations leves (7 mM) ou basses (0,7 mM) de nitrate dammonium comme source dazote. Les rsultats montrent que la culture sur un milieu riche en azote induit les activits G6PDH et 6PGDH. Les donnes montrent que la capacit de la VPP est plus grande avec des niveaux levs en HK ou en cTPI. Nous avons aussi pu dmontrer une plus grande activit spcifique de lHK dans les conditions pauvres en azote. Ces donnes ont t complmentes par des mesures des pools dacides amins dans les racines transgniques cultives sur diffrents niveaux dazote. Aucune tendance notable des pools dacides amins na t remarque dans les racines modifies pour leur contenu en HK suggrant que la manipulation de HK naffecte pas l'assimilation de lazote. Dans les racines transgniques modifies pour la cTPI, les ratios Gln/Glu et Asn/Asp sont plus levs chez les clones antisens, indiquant une assimilation de lazote plus leve. Ces rsultats ont dmontr l'activation de l'assimilation de lazote chez les clones antisens cTPI dans les conditions leves et basses dazote alors que la manipulation de lHK naffecte pas lassimilation de lazote.
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Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus a ARN de polarite negative. Les etudes demontrent que toute la population sera infectee par ce virus au moins deux fois avant lage de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aigue et la pneumonie. Les infections severes correlent avec le developpement de lasthme. Lors dune infection virale, les particules du RSV sont detectees par le senseur RIG-I qui induit lactivation des facteurs de transcription NF-B et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les reponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une reponse immunitaire mal adaptee. Plus precisement, par lentremise de NF-B, le RSV provoque une production exageree de cytokines et chimiokines qui induisent une reponse inflammatoire demesuree provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable dechapper a la reponse antivirale. Ces deux phenomenes sont controles par lentremise des proteines non structurales NS1 et NS2. Le mecanisme delimitant le mode daction de NS1 et NS2 sur la reponse antivirale reste a etre determine. Avec pour objectif delucider comment NS1 et NS2 inhibent la reponse antivirale, nous avons investigue le mecanisme de reconnaissance de lhote vis-a-vis de RSV. Nous demontrerons, pour la premiere fois, que le senseur cytosolique MDA5 est implique dans la reponse antivirale contre le RSV. Nous presenterons des resultats preliminaires qui suggerent que le role de MDA5 est non redondant a RIG-I. A laide dARN interferant dirige contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous demontrerons que MDA5 ne contribue pas a la phosphorylation dIRF-3, mais plutot quelle regit la stabilite du facteur de transcription. Nous demontrerons aussi que, contrairement a lhypothese actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, linhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN. Cependant, lexpression ectopique de NS1 et NS2 reduit lactivite du promoteur de lIFN- et de la proteine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsquelle est mesuree par essai luciferase.
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Hyperammonemia is a key factor in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) as well as other metabolic encephalopathies, such as those associated with inherited disorders of urea cycle enzymes and in Reye's syndrome. Acute HE results in increased brain ammonia (up to 5 mM), astrocytic swelling, and altered glutamatergic function. In the present study, using fluorescence imaging techniques, acute exposure (10 min) of ammonia (NH4+/NH3) to cultured astrocytes resulted in a concentration-dependent, transient increase in [Ca2+]i. This calcium transient was due to release from intracellular calcium stores, since the response was thapsigargin-sensitive and was still observed in calcium-free buffer. Using an enzyme-linked fluorescence assay, glutamate release was measured indirectly via the production of NADH (a naturally fluorescent product when excited with UV light). NH4+/NH3 (5 mM) stimulated a calcium-dependent glutamate release from cultured astrocytes, which was inhibited after preincubation with 1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid acetoxymethyl ester but unaffected after preincubation with glutamate transport inhibitors dihydrokainate and DL-threo-beta-benzyloxyaspartate. NH4+/NH3 (5 mM) also induced a transient intracellular alkaline shift. To investigate whether the effects of NH4+/NH3 were mediated by an increase in pH(i), we applied trimethylamine (TMA+/TMA) as another weak base. TMA+/TMA (5 mM) induced a similar transient increase in both pH(i) and [Ca2+]i (mobilization from intracellular calcium stores) and resulted in calcium-dependent release of glutamate. These results indicate that an acute exposure to ammonia, resulting in cytosolic alkalinization, leads to calcium-dependent glutamate release from astrocytes. A deregulation of glutamate release from astrocytes by ammonia could contribute to glutamate dysfunction consistently observed in acute HE.
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BACKGROUND/AIMS: It has been proposed that, in acute liver failure, skeletal muscle adapts to become the principle organ responsible for removal of blood-borne ammonia by increasing glutamine synthesis, a reaction that is catalyzed by the cytosolic ATP-dependent enzyme glutamine synthetase. To address this issue, glutamine synthetase expression and activities were measured in skeletal muscle of rats with acute liver failure resulting from hepatic devascularization. METHODS: Glutamine synthetase protein and gene expression were investigated using immunoblotting and semi-quantitative RT-PCR analysis. Glutamine synthetase activity and glutamine de novo synthesis were measured using, respectively, a standard enzymatic assay and [13C]-nuclear magnetic resonance spectroscopy. RESULTS: Glutamine synthetase protein (but not gene) expression and enzyme activities were significantly up-regulated leading to increased de novo synthesis of glutamine and increased skeletal muscle capacity for ammonia removal in acute liver failure. In contrast to skeletal muscle, expression and activities of glutamine synthetase in the brain were significantly decreased. CONCLUSIONS: These findings demonstrate that skeletal muscle adapts, through a rapid induction of glutamine synthetase, to increase its capacity for removal of blood-borne ammonia in acute liver failure. Maintenance of muscle mass together with the development of agents with the capacity to stimulate muscle glutamine synthetase could provide effective ammonia-lowering strategies in this disorder.
