Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.

Régulation de l’identité des membres postérieurs par le facteur de transcription à boîte T Tbx4

Bien que partageant une homologie structurelle évidente, les membres antérieurs (MA) sont toujours différents des membres postérieurs (MP). Ceci suggère l’existence d’un programme générique de formation d’un membre, un bauplan, qui doit être modulé de façon spécifique pour engendrer cette différence antéro-postérieure de l’identité. Nous avons donc voulu identifier les mécanismes déployés durant l’évolution pour permettre la mise en place de l’identité des membres. Le laboratoire avait précédemment caractérisé, chez les souris où le gène Pitx1 est inactivé, une transformation partielle des MP en MA couplée à une perte de croissance. Nous avons donc cherché à comprendre les mécanismes en aval de Pitx1 dans la détermination de l’identité postérieure. Notre démarche nous a permis d’identifier les gènes affectés par la perte de Pitx1 dans les MP, où nous avons confirmé une dérégulation de l’expression de Tbx4. Tbx4 et Tbx5 sont des candidats évidents pour déterminer l’identité, leur expression étant restreinte aux MP et MA, respectivement, mais leur implication dans ce processus était sujette à controverse. Nous avons donc évalué l’apport de Tbx4 en aval de Pitx1 dans les processus d’identité en restaurant son expression dans les MP des souris Pitx1-/-. Ce faisant, nous avons pu montrer que Tbx4 est capable de pallier la perte de Pitx1 dans le MP, en rétablissant à la fois les caractères d’identité postérieure et la croissance. En parallèle, nous avons montré que Tbx5 était capable de rétablir la croissance mais non l’identité des MP Pitx1-/-, démontrant ainsi de façon définitive une propriété propre à Tbx4 dans la détermination de l’identité des membres postérieure. La caractérisation de l’activité transcriptionnelle de Tbx4 et Tbx5 nous a permis de mettre en évidence un domaine activateur conservé mais aussi un domaine spécifique à Tbx4, répresseur de la transcription. Par ailleurs, une mutation faux-sens de TBX4 dans les patients atteints du syndrome coxo-podo-patellaire, TBX4Q531R, inactive le domaine répresseur, empêchant la compensation de l’identité mais non de la croissance des MP dépourvus de Pitx1, démontrant l’importance de cette fonction dans l’identité postérieure. La caractérisation de l’activité répressive de Tbx4, qui se manifeste seulement dans les membres postérieurs démontre l’importance de cette fonction dans l’identité postérieure. Nous avons aussi été en mesure d’identifier un corépresseur qui est suffisant pour supporter cette activité de Tbx4. Enfin, nous avons pu aussi démontrer l’activité transcriptionnelle d’un représentant du gène ancestral, présent chez Amphioxus, qui se comporte strictement comme un activateur et semble dépourvu du domaine répresseur. En somme, nous avons précisé le rôle de Tbx4 et Tbx5, ainsi que leur mécanisme, dans la détermination de l’identité des membres. Globalement, nos travaux permettent d’élaborer une théorie où une divergence d’activité transcriptionnelle de Tbx4 et Tbx5 est responsable de l’identité des membres et même entrevoir que cette divergence d’activité soit à la base de son apparition durant l’évolution.

Les partenaires d'interactions de Cirhin, la protéine portant la mutation responsable de la Cirrhose Amérindienne Infantile (NAIC)

La Cirrhose Amérindienne Infantile (CAI, NAIC) est une forme de cholestase non-syndromique héréditaire à transmission autosomique récessive, décrite uniquement chez les enfants autochtones du Nord-Ouest québécois et issue d’un effet fondateur. La maladie se présente d’abord sous la forme d’une jaunisse néonatale chez un enfant autrement en bonne santé, qui progresse en cirrhose de type biliaire dans l’enfance et dans l’adolescence. Le taux de survie à l’âge adulte est inférieur à 50% et la seule thérapie efficace à ce jour pour les patients avancés dans la maladie demeure la transplantation hépatique. Les recherches antérieures menées par le groupe ont permis d’identifier le locus ainsi que le gène responsable de NAIC, qui encode la protéine nucléolaire Cirhin. Cirhin est exprimée uniquement dans le foie et tous les patients sont homozygotes pour la mutation R565W. La fonction de Cirhin est inconnue, mais les motifs WD40 retrouvés dans sa séquence indiquent qu’elle participerait à des interactions protéine-protéine et serait impliquée dans un mécanisme moléculaire de base. Cirhin interagit avec la protéine nucléaire Cirip, qui a un effet positif important sur la transcription de l’élément activateur HIV-1 LTR et qui a un rôle dans la prolifération cellulaire. L’interaction de Cirhin et Cirip est affectée par la mutation R565W. À l’aide de la technique du double hybride chez la levure, la protéine nucléolaire Nol11 a été identifiée comme étant un partenaire d’interaction de Cirhin. Par son interaction avec MARK3 et c-Myc, Nol11 serait impliquée dans des processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la polarité, la croissance cellulaire et possiblement la biogenèse des ribosomes. La portion C-terminale de Nol11 interagirait avec Cirhin, et la mutation R565W abolit cette interaction. Le résidu R565 serait donc important pour la fonctionnalité de Cirhin.

New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Exploring TERRA (TElomeric Repeat-containing RNA) Expression and Regulation During Cell Growth in Saccharomyces cerevisiae

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Pathogenèse moléculaire de la neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux

La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC.

Reproduction et échanges génétiques horizontaux chez les champignons mycorhiziens à arbuscules

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GREBP, un nouveau facteur de transcription contrôlant l’expression de la guanylate cyclase A, récepteur de l’ANP, via l’élément de réponse au cGMP

La découverte du système des peptides natriurétiques (NP), au début des années 80, fut une découverte majeure qui révéla le rôle endocrinien du cœur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurèse et la natriurèse provoquées par ce système ont évolué vers un niveau de complexité insoupçonné à cette époque. Nous savons à présent que les NP sont impliqués dans plusieurs autres mécanismes dont la prolifération cellulaire, l’apoptose, l’inhibition du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) et le métabolisme des adipocytes. Le métabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre l’obésité. Cette condition aux proportions pandémiques est un facteur de risque majeur dans l’apparition de l’hypertension et du syndrome métabolique (MetS). La compréhension des mécanismes et des défauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrôle du MetS et de l’hypertension. L’expression du récepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrôlée par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurétique de l’oreillette (ANP). La découverte d’une boucle de retro-inhibition, dans les années 90, a été un événement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite à une stimulation à l’ANP, le NPR1/GCA peut inhiber l’activité transcriptionnelle de son propre gène par un mécanisme dépendant du cGMP. Notre groupe a identifié un élément cis-régulateur responsable de cette sensibilité au cGMP et mon projet consistait à identifier la ou les protéine(s) liant cet élément de réponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifié un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque d’ADN complémentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient d’un ADNc de 1083-bp dont le gène est localisé sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protéine dont la fonction était inconnue jusqu’ici. Nous avons nommé cette nouvelle protéine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison à l’ADN ont montré que cette protéine possède une affinité 18 fois plus élevée pour le cGMP-RE que le contrôle, tandis que des expériences de retard sur gel (EMSA) ont confirmé la spécificité des interactions protéine-ADN. De plus, l’immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) a prouvé que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe l’expression du gène rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur de npr1/gca. L’inhibition de GREBP à l’aide d’ARN interférant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, l’ANP stimule l’expression de grebp de 60% après seulement 3 heures et inhibe l’expression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protéine nucléaire surtout exprimée dans le cœur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nucléotidiques du gène sont plus fréquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici l’existence d’un gène spécifique à l’humain qui agit comme répresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqué dans le développement de l’hypertension.

Régulation transcriptionnelle du gène de la protéine de liaison de la chlorophylle-a et de la péridinine chez le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes.

Impacts and Detection of Design Smells

Les changements sont faits de façon continue dans le code source des logiciels pour prendre en compte les besoins des clients et corriger les fautes. Les changements continus peuvent conduire aux défauts de code et de conception. Les défauts de conception sont des mauvaises solutions à des problèmes récurrents de conception ou d’implémentation, généralement dans le développement orienté objet. Au cours des activités de compréhension et de changement et en raison du temps d’accès au marché, du manque de compréhension, et de leur expérience, les développeurs ne peuvent pas toujours suivre les normes de conception et les techniques de codage comme les patrons de conception. Par conséquent, ils introduisent des défauts de conception dans leurs systèmes. Dans la littérature, plusieurs auteurs ont fait valoir que les défauts de conception rendent les systèmes orientés objet plus difficile à comprendre, plus sujets aux fautes, et plus difficiles à changer que les systèmes sans les défauts de conception. Pourtant, seulement quelques-uns de ces auteurs ont fait une étude empirique sur l’impact des défauts de conception sur la compréhension et aucun d’entre eux n’a étudié l’impact des défauts de conception sur l’effort des développeurs pour corriger les fautes. Dans cette thèse, nous proposons trois principales contributions. La première contribution est une étude empirique pour apporter des preuves de l’impact des défauts de conception sur la compréhension et le changement. Nous concevons et effectuons deux expériences avec 59 sujets, afin d’évaluer l’impact de la composition de deux occurrences de Blob ou deux occurrences de spaghetti code sur la performance des développeurs effectuant des tâches de compréhension et de changement. Nous mesurons la performance des développeurs en utilisant: (1) l’indice de charge de travail de la NASA pour leurs efforts, (2) le temps qu’ils ont passé dans l’accomplissement de leurs tâches, et (3) les pourcentages de bonnes réponses. Les résultats des deux expériences ont montré que deux occurrences de Blob ou de spaghetti code sont un obstacle significatif pour la performance des développeurs lors de tâches de compréhension et de changement. Les résultats obtenus justifient les recherches antérieures sur la spécification et la détection des défauts de conception. Les équipes de développement de logiciels doivent mettre en garde les développeurs contre le nombre élevé d’occurrences de défauts de conception et recommander des refactorisations à chaque étape du processus de développement pour supprimer ces défauts de conception quand c’est possible. Dans la deuxième contribution, nous étudions la relation entre les défauts de conception et les fautes. Nous étudions l’impact de la présence des défauts de conception sur l’effort nécessaire pour corriger les fautes. Nous mesurons l’effort pour corriger les fautes à l’aide de trois indicateurs: (1) la durée de la période de correction, (2) le nombre de champs et méthodes touchés par la correction des fautes et (3) l’entropie des corrections de fautes dans le code-source. Nous menons une étude empirique avec 12 défauts de conception détectés dans 54 versions de quatre systèmes: ArgoUML, Eclipse, Mylyn, et Rhino. Nos résultats ont montré que la durée de la période de correction est plus longue pour les fautes impliquant des classes avec des défauts de conception. En outre, la correction des fautes dans les classes avec des défauts de conception fait changer plus de fichiers, plus les champs et des méthodes. Nous avons également observé que, après la correction d’une faute, le nombre d’occurrences de défauts de conception dans les classes impliquées dans la correction de la faute diminue. Comprendre l’impact des défauts de conception sur l’effort des développeurs pour corriger les fautes est important afin d’aider les équipes de développement pour mieux évaluer et prévoir l’impact de leurs décisions de conception et donc canaliser leurs efforts pour améliorer la qualité de leurs systèmes. Les équipes de développement doivent contrôler et supprimer les défauts de conception de leurs systèmes car ils sont susceptibles d’augmenter les efforts de changement. La troisième contribution concerne la détection des défauts de conception. Pendant les activités de maintenance, il est important de disposer d’un outil capable de détecter les défauts de conception de façon incrémentale et itérative. Ce processus de détection incrémentale et itérative pourrait réduire les coûts, les efforts et les ressources en permettant aux praticiens d’identifier et de prendre en compte les occurrences de défauts de conception comme ils les trouvent lors de la compréhension et des changements. Les chercheurs ont proposé des approches pour détecter les occurrences de défauts de conception, mais ces approches ont actuellement quatre limites: (1) elles nécessitent une connaissance approfondie des défauts de conception, (2) elles ont une précision et un rappel limités, (3) elles ne sont pas itératives et incrémentales et (4) elles ne peuvent pas être appliquées sur des sous-ensembles de systèmes. Pour surmonter ces limitations, nous introduisons SMURF, une nouvelle approche pour détecter les défauts de conception, basé sur une technique d’apprentissage automatique — machines à vecteur de support — et prenant en compte les retours des praticiens. Grâce à une étude empirique portant sur trois systèmes et quatre défauts de conception, nous avons montré que la précision et le rappel de SMURF sont supérieurs à ceux de DETEX et BDTEX lors de la détection des occurrences de défauts de conception. Nous avons également montré que SMURF peut être appliqué à la fois dans les configurations intra-système et inter-système. Enfin, nous avons montré que la précision et le rappel de SMURF sont améliorés quand on prend en compte les retours des praticiens.

Accumulation et résistance aux Philippines : conflits fonciers dans les hautes-terres du Negros Oriental

La convergence des crises mondiales financière, énergétique et alimentaire des dernières années a contribué à une intensification du contrôle de la terre par des intervenants étatiques et non-étatiques. Des entreprises nationales et transnationales, aidées par les gouvernements locaux, s’empressent d’acquérir de grandes superficies agricoles dans le but défini de produire des cultures de rentes pour la production d'agrocarburants. Parfois désigné « acquisition foncière », « investissement étranger en agriculture » ou « accaparement de terres », ce phénomène semble décrire le futur des politiques agricoles de nombreux pays. Aux Philippines, plusieurs accords sont en vigueur pour le développement de la filière des agrocarburants. Selon le gouvernement du pays, ces ententes, en plus de dynamiser le secteur de l’agriculture, peuvent générer des effets positifs au sein des régions rurales en sécurisant une part des revenus des agriculteurs engagés dans ce type de production, tout en favorisant la pluriactivité dans ces mêmes régions. Cette recherche a été réalisée dans les hautes-terres du sud de la province de Negros Oriental, où 10 000 hectares de terres agricoles ont été concédés à une entreprise coréenne spécialisée dans la production d’éthanol. Cette acquisition a mené à un processus d’exclusion et de dépossession par les élites traditionnelles au détriment des populations jusqu’alors tournées vers les productions vivrières. Ces populations ont été expulsées de la terre et privées des ressources constituant l’essentiel de leurs revenus. Suite à l’opposition des paysans, plusieurs détachements militaires se sont installés dans la région, menant à une intensification des conflits. Plusieurs unités paramilitaires se partagent dorénavant l’espace occupé initialement par ces paysans qui ont dû quitter en raison de l’augmentation de l’intimidation et de la violence. Cette recherche a permis d’examiner les façons dont les accaparements des terres transforment le système foncier antérieur à l'entente et modifient les conditions socioéconomiques d’une région caractérisée par un système hybride de production.

Sels d’imidazolium avec des anions catalytiques : vers le développement de nouveaux catalyseurs bio-hybrides actifs en milieu liquide ionique

Les liquides ioniques connaissent depuis quelques décennies un essor particulier en raison de leurs nombreuses propriétés physico-chimiques intéressantes, telles qu’une faible pression de vapeur saturante, une viscosité limitée, une faible miscibilité avec la plupart des solvants communs, ou encore des propriétés d’agencement supramoléculaire, qui en font des outils puissants dans de nombreux domaines de la chimie. Les sels d’imidazolium représentent la plus grande famille de liquides ioniques à ce jour. Leur modulabilité leur permet d’être dérivés pour de nombreuses applications spécifiques, notamment en synthèse organique, où ils sont utilisés majoritairement comme solvants, et plus récemment comme catalyseurs. Les travaux présentés dans cette thèse se concentrent sur leur utilisation en synthèse organique, à la fois comme solvants et principalement comme catalyseurs chiraux, catalyseurs pour lesquels l’anion du sel est l’espèce catalytique, permettant d’ajouter de la flexibilité et de la mobilité au système. En tirant parti de la tolérance des liquides ioniques envers la majorité des macromolécules naturelles, l’objectif principal des travaux présentés dans cette thèse est le développement d’un nouveau type de catalyseur bio-hybride reposant sur l’encapsulation d’un sel d’imidazolium dans une protéine. Par le biais de la technologie biotine-avidine, l’inclusion supramoléculaire de sels d’imidazolium biotinylés portant des contre-anions catalytiques dans l’avidine a été réalisée et exploitée en catalyse. Dans un premier temps, le développement et l’étude de deux sels de 1-butyl-3-méthylimidazolium possédant des anions chiraux dérivés de la trans-4-hydroxy-L-proline sont rapportés, ainsi que leur comportement dans des réactions énantiosélectives d’aldol et d’addition de Michael. Ces types de composés se sont révélés actifs et performants en milieu liquide ionique. Dans un second temps, la préparation de sels d’imidazolium dont le cation est biotinylé et portant un contre-anion achiral, a été réalisée. Le comportement de l’avidine en milieu liquide ionique et son apport en termes de chiralité sur le système bio-hybride ont été étudiés. Les résultats montrent le rôle crucial des liquides ioniques sur la conformation de la protéine et l’efficacité du catalyseur pour des réactions d’aldol. Dans un dernier temps, l’influence de la structure du cation et de l’anion sur le système a été étudiée. Différents espaceurs ont été introduits successivement dans les squelettes cationiques et anioniques des sels d’imidazolium biotinylés. Dans le cas du cation, les résultats ne révèlent aucune influence majeure sur l’efficacité du catalyseur. La structure de l’anion se montre cependant beaucoup plus importante : la préparation de différents catalyseurs bio-hybrides possédant des anions aux propriétés physico-chimiques différentes a permis d’obtenir de plus amples informations sur le mode de fonctionnement du système bio-hybride et de la coopérativité entre l’avidine et l’anion du sel d’imidazolium.La nature ionique de la liaison cation-anion offrant une liberté de mouvement accrue à l’anion dans la protéine, la tolérance à différents substrats a également été abordée après optimisation du système.

Évaluation de l'acquisition de la résistance à la colistine chez Escherichia coli O149 chez le porc.

La diarrhée post-sevrage est une maladie d’importance dans l’industrie porcine et est principalement causée Escherichia coli O149. Le traitement habituellement utilisé est la néomycine. Cependant, en raison de l’antibiorésistance, les vétérinaires se tournent vers la colistine sulfate (CS). La CS lie les lipopolysaccharides (LPS) et provoque un déplacement des cations divalents causant la formation de pores entrainant la mort cellulaire. Le système à deux composantes PmrA/PmrB est le plus incriminé dans la résistance à la colistine en ajoutant un groupement 4-amino-4-déoxy-L-arabinose (L-Ara4N) au lipide A des LPS, augmentant ainsi la charge du LPS et diminuant son affinité pour la CS. L’objectif principal est d’évaluer l’acquisition de la résistance à la CS d’E. coli in vitro et dans un modèle in vivo. Nous avons utilisé des souches associées à des cas cliniques d’E. coli O149 et avons créé 22 mutants résistants à la CS. La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été mesurée par une méthode de double dilution et comparée au seuil de résistance. Suite au séquençage des gènes pmrA/pmrB, nous avons identifié sept nouveaux polymorphismes, trois dans PmrA : A80V, N128I, S144G et quatre dans PmrB : V87E, D148Y, D148V et T156M. Pour l’essai in vivo, nous avons suivi une souche expérimentale ETEC:F4 (E. coli O149) et isolé des E. coli de la flore commensale. Le séquençage des gènes pmrA et pmrB de ces isolats a montré un polymorphisme spécifique, G15R et T156M respectivement. Cependant, plusieurs souches récoltées possédaient une résistance à la CS, mais sans polymorphisme de PmrA/PmrB, suggérant d’autre(s) mécanisme(s) de résistance.

Providing Genetic Testing Through the Private Sector: A View From Canada

Genetic testing technologies are rapidly moving from the research laboratory to the market place. Very little scholarship considers the implications of private genetic testing for a public health care system such as Canada’s. It is critical to consider how and if these tests should be marketed to, and purchased by, the public. It is also imperative to evaluate the extent to which genetic tests are or should be included in Canada’s public health care system, and the impact of allowing a two-tiered system for genetic testing. A series of threshold tests are presented as ways of clarifying whether a genetic test is morally appropriate, effective and safe, efficient and appropriate for public funding and whether private purchase poses special problems and requires further regulation. These thresholds also identify the research questions around which professional, public and policy debate must be sustained: What is a morally acceptable goal for genetic services? What are the appropriate benefits? What are the risks? When is it acceptable that services are not funded under health care? And how can the harms of private access be managed?