Étude de la relation entre les conformations et la signalisation des 7TMRs

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle.

Les récepteurs 5-HT4b adoptent différentes conformations ligand-spécifique ayant des propriétés de signalisation et de régulation distinctes

Les antidépresseurs actuels sont très similaires au niveau de leur mécanisme d’action et sont plus ou moins efficaces. Un des problèmes majeurs est leur long temps de latence à fournir une action thérapeutique dû aux adaptations des sites pré et post synaptiques. Dans un modèle animal, nous avons récemment découvert que l’agoniste RS67333 des récepteurs 5-HT4 était en mesure de produire en trois jours les mêmes effets antidépresseurs qui normalement prennent de deux à trois semaines à apparaître avec les antidépresseurs actuellement disponibles. De plus, nous avons constaté que les effets antidépresseurs de cet agoniste possédaient une résistance à la tolérance. Il y a d’autres agonistes du même récepteur, tel que le prucalopride qui ne produit pas d’effets antidépresseurs comme RS67333. Étant donné que l’efficacité du Prucalopride à stimuler les 5-HT4Rs est similaire sinon plus grande que celle de RS67333, nous avons énoncé l’hypothèse que le récepteur 5-HT4 pourrait adopter différentes conformations actives suite à son activation par différents agonistes. Nous avons ainsi décidé d’explorer les principales réponses fonctionnelles des récepteurs 5-HT4B en observant leurs propriétés de régulation et de signalisation. Nous avons montré que l’isoforme B du récepteur 5-HT4, étant hautement exprimé dans le système limbique, détient une signalisation et une régulation différentes dépendant du ligand activateur. Nos résultats indiquent que chacun des agonistes testés (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) modulent distinctivement la production d’AMPc et l’internalisation du récepteur. Les résultats nous ont clairement permis de déterminer que les agonistes possèdent une efficacité et ou puissance différentes les uns par rapport aux autres. De plus, l’ordre d’efficacité des agonistes à moduler la voie de l’AMPc était (Prucalopride > Zacopride = ML10302 = 5-HT > RS67333) et est différente de leur ordre d’efficacité à induire la régulation du récepteur par internalisation (5-HT > Zacopride > Prucalopride > ML10302 = RS67333). Ainsi, nous avons montré que les 5-HT4Rs adoptent des conformations qui sont ligand-spécifiques. Cela implique que la sélectivité fonctionnelle serait un facteur important à considérer dans les mécanismes d’action antidépresseur des agonistes de ce récepteur.

Le motif d’empaquetage le long du sillon: une nouvelle entité structurale récurrente dans les ARN ribosomiques

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes.

Effet de chaperones pharmacologiques sur les formes mutantes du récepteur mélanocortine de type 4 responsables de l'obésité morbide précoce

Le récepteur mélanocortine de type 4 (MC4R) est un récepteur couplé aux protéines G impliqué dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Quatre-vingt pour cent des mutants du MC4R reliés à l’obésité morbide précoce (OMP) sont retenus à l’intérieur de la cellule. Le système de contrôle de qualité (SCQ) est probablement responsable de cette rétention, par la reconnaissance d’une conformation inadéquate des mutants. Le rétablissement de l’expression à la surface cellulaire et de la fonctionnalité de ces mutants est donc d’intérêt thérapeutique. Dans cette optique, des composés lipophiles spécifiques pour le MC4R ont été sélectionnés sur la base de leur sélectivité. Nous avons démontré qu’ils agissent à titre de chaperone pharmacologique (CP) en rétablissant l’expression à la surface cellulaire et la fonctionnalité des récepteurs mutants S58C et R165W, et qu’ils favorisent leur N-glycosylation complexe (maturation). Le suivi par BRET du site d’action des CP du MC4R suggère une action en aval de l’interaction calnexine-MC4R. De manière générale, une CP peut avoir un effet différent selon le mutant traité en induisant des conformations distinctes du récepteur plus ou moins aptes à se dissocier du SCQ et à activer la voie de signalisation, et un mutant peut répondre différemment selon la CP utilisée par des différences d’affinité pour le ligand, la CP et les effecteurs. Une meilleure compréhension du mode d’action des CP pourrait aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques non seulement pour l’OMP, mais aussi pour d’autres maladies conformationnelles causées par le mauvais repliement de protéines.

Étude des propriétés de transport dans les hydrogels de curdlan

Les hydrogels de polysaccharide sont des biomatériaux utilisés comme matrices à libération contrôlée de médicaments et comme structures modèles pour l’étude de nombreux systèmes biologiques dont les biofilms bactériens et les mucus. Dans tous les cas, le transport de médicaments ou de nutriments à l’intérieur d’une matrice d’hydrogel joue un rôle de premier plan. Ainsi, l’étude des propriétés de transport dans les hydrogels s’avère un enjeu très important au niveau de plusieurs applications. Dans cet ouvrage, le curdlan, un polysaccharide neutre d’origine bactérienne et formé d’unités répétitives β-D-(1→3) glucose, est utilisé comme hydrogel modèle. Le curdlan a la propriété de former des thermogels de différentes conformations selon la température à laquelle une suspension aqueuse est incubée. La caractérisation in situ de la formation des hydrogels de curdlan thermoréversibles et thermo-irréversibles a tout d’abord été réalisée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) en mode réflexion totale atténuée à température variable. Les résultats ont permis d’optimiser les conditions de gélation, menant ainsi à la formation reproductible des hydrogels. Les caractérisations structurales des hydrogels hydratés, réalisées par imagerie FT-IR, par microscopie électronique à balayage en mode environnemental (eSEM) et par microscopie à force atomique (AFM), ont permis de visualiser les différentes morphologies susceptibles d’influencer la diffusion d’analytes dans les gels. Nos résultats montrent que les deux types d’hydrogels de curdlan ont des architectures distinctes à l’échelle microscopique. La combinaison de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) à gradients pulsés et de l’imagerie RMN a permis d’étudier l’autodiffusion et la diffusion mutuelle sur un même système dans des conditions expérimentales similaires. Nous avons observé que la diffusion des molécules dans les gels est ralentie par rapport à celle mesurée en solution aqueuse. Les mesures d’autodiffusion, effectuées sur une série d’analytes de diverses tailles dans les deux types d’hydrogels de curdlan, montrent que le coefficient d’autodiffusion relatif décroit en fonction de la taille de l’analyte. De plus, nos résultats suggèrent que l’équivalence entre les coefficients d’autodiffusion et de diffusion mutuelle dans les hydrogels de curdlan thermo-irréversibles est principalement due au fait que l’environnement sondé par les analytes durant une expérience d’autodiffusion est représentatif de celui exploré durant une expérience de diffusion mutuelle. Dans de telles conditions, nos résultats montrent que la RMN à gradients pulsés peut s’avérer une approche très avantageuse afin de caractériser des systèmes à libération contrôlée de médicaments. D’autres expériences de diffusion mutuelle, menées sur une macromolécule de dextran, montrent un coefficient de diffusion mutuelle inférieur au coefficient d’autodiffusion sur un même gel de curdlan. L’écart mesuré entre les deux modes de transport est attribué au volume différent de l’environnement sondé durant les deux mesures. Les coefficients d’autodiffusion et de diffusion mutuelle similaires, mesurés dans les deux types de gels de curdlan pour les différents analytes étudiés, suggèrent une influence limitée de l’architecture microscopique de ces gels sur leurs propriétés de transport. Il est conclu que les interactions affectant la diffusion des analytes étudiés dans les hydrogels de curdlan se situent à l’échelle moléculaire.

Regulation of cholesterol intake by the corpus luteum

Studies were funded by Colegio de Postgraduados, México. CONACyT, México. SRE, México. Ministère de l’Éducation du Québec, University of Montreal and an Operating Grant to B.D. Murphy from the Canadian Institutes of Health Research.

Études structurales d’interactions protéine/protéine impliquées dans l’érythropoïèse

Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes.

Développement d'un biosenseur BRET permettant le criblage de drogues qui causent l'activation de canaux Kir3 via les récepteurs couplés aux protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3.

Study of the diffusion in polymer solutions and hydrogels by NMR spectroscopy and NMR imaging

Afin d'étudier la diffusion et la libération de molécules de tailles inférieures dans un gel polymère, les coefficients d'auto-diffusion d'une série de polymères en étoile avec un noyau d'acide cholique et quatre branches de poly(éthylène glycol) (PEG) ont été déterminés par spectroscopie RMN à gradient de champ pulsé dans des solutions aqueuses et des gels de poly(alcool vinylique). Les coefficients de diffusion obtenus ont été comparés avec ceux des PEGs linéaires et dendritiques pour étudier l'effet de l'architecture des polymères. Les polymères en étoile amphiphiles ont des profils de diffusion en fonction de la concentration similaires à leurs homologues linéaires dans le régime dilué. Ils diffusent plus lentement dans le régime semi-dilué en raison de leur noyau hydrophobe. Leurs conformations en solution ont été étudiées par des mesures de temps de relaxation spin-réseau T1 du noyau et des branches. L'imagerie RMN a été utilisée pour étudier le gonflement des comprimés polymères et la diffusion dans la matrice polymère. Les comprimés étaient constitués d'amidon à haute teneur en amylose et chargés avec de l'acétaminophène (de 10 à 40% en poids). Le gonflement des comprimés, ainsi que l'absorption et la diffusion de l'eau, augmentent avec la teneur en médicament, tandis que le pourcentage de libération du médicament est similaire pour tous les comprimés. Le gonflement in vitro des comprimés d'un complexe polyélectrolyte à base d'amidon carboxyméthylé et de chitosane a également été étudié par imagerie RMN. Ces comprimés sont sensibles au pH : ils gonflent beaucoup plus dans les milieux acides que dans les milieux neutres en raison de la dissociation des deux composants et de la protonation des chaînes du chitosane. La comparaison des résultats avec ceux d'amidon à haute teneur en amylose indique que les deux matrices ont des gonflements et des profils de libération du médicament semblables dans les milieux neutres, alors que les comprimés complexes gonflent plus dans les milieux acides en raison de la dissociation du chitosane et de l'amidon.

Étude structurale conformationnelle des toxines de l’anthrax par cryo-microscopie et dynamique moléculaire

Les toxines de l’anthrax font partie de la famille des toxines A-B dans laquelle la moitié B se fixe à la membrane de la cellule permettant par la suite la translocation de la moitié A. Dans le cas de l’anthrax, la moitié B est représentée par le Protective Antigen (PA) et la moitié A par les deux protéines Edema Factor (EF) et Lethal Factor (LF). Après le recrutement par les récepteurs cellulaires (CMG2 et TEM8), PA s’organise en heptamère. Il peut fixer jusqu'à 3 ligands (EF et LF) avant d'être endocyté. Les modèles actuels de PA suggèrent que la baisse de pH à l’intérieur des endosomes permet un changement de conformation de la forme pré-pore vers la forme pore et que les ligands EF et LF passeraient au travers le pore pour entrer dans le cytoplasme. Cependant, le diamètre du pore est environ dix fois inférieur à celui des ligands (10 Å contre 100 Å). Un processus de folding/unfolding a été proposé mais demeure controversé. Afin d'identifier le processus de passage des facteurs EF et LF dans le cytoplasme, nous avons déterminé par cryo-microscopie électronique combinée avec l’analyse d’image les structures tridimensionnelles des complexes formés par PA et LF aux étapes prépore et pore. Par la suite, une étude complémentaire par dynamique moléculaire nous a permis de modéliser à haute résolution les différentes interactions qui ont lieu au sein du complexe. La structure 3D du complexe prépore combiné à 3 LF a été déterminée à une résolution de 14 Å. Nous avons aussi calculé une structure préliminaire du complexe pore également combiné à 3 LF Celles-ci n’ont jamais été résolues auparavant et leur connaissance permet d’envisager l’étude en profondeur du mécanisme infectieux de l’Anthrax in vivo.

Caractérisation de l’ADNc et de l’ADN génomique codant l’intégrine plaquettaire αIIb‐β3 chez un cheval atteint de Thrombasthénie de Glanzmann

La thrombasthénie de Glanzmann (TG) est une maladie caractérisée par un défaut d’agrégation plaquettaire. C’est une maladie génétique autosomale récessive causée par une anomalie du récepteur plaquettaire pour le fibrinogène. Ce récepteur est une intégrine localisée à la surface plasmatique qui est formée par un complexe composé des sous‐unités αIIb et β3. Nous avons identifié un cheval démontrant les caractéristiques clinicopathologiques de la TG. Des études par cytométrie de flux ont révélé une déficience au niveau de la portion αIIb du récepteur. Ces résultats suggèrent une ou plusieurs mutations au niveau du gène codant pour cette portion αIIb du récepteur. L’objectif de notre étude était de caractériser l’ADNc et l’ADN génomique codant pour les gènes ITGA2B et ITGB3 codant respectivement pour les deux sous‐unités αIIb et β3 chez un cheval atteint de la TG. L’ADNc a été synthétisé par RT‐PCR en utilisant l’ARN total récolté à partir des plaquettes. L’ADN génomique a été extrait à partir des globules blancs. Des amorces spécifiques ont été utilisées pour l’amplification par PCR d’ITGA2B et d’ITGB3. Les séquences d’ADNc et d’ADN génomique de notre patient ont été caractérisées par séquençage et comparées par l’analyse BLAST (GenBank). Une substitution d’une guanine par une cytosine a été mise en évidence au niveau de l’exon 2 d’ITGA2B amenant à la substitution d’une arginine (Arg72) par une proline (Pro72). Ce changement d’acide aminé pourrait résulter en une conformation structurelle anormale qui amènerait à une sous‐unité αIIb inactive. L’analyse de l’ADN génomique a démontré que ce cheval était homozygote pour cette mutation. Le séquençage de l’ADN génomique des parents et de la grand‐mère du patient a démontré que ces individus étaient hétérozygotes pour cette mutation. Le séquençage d’ITGB3 n’a démontré aucune anomalie.

Étude de l’issue diastéréomérique impliquant la réduction radicalaire d’α-bromoesters adjacents à un tétrahydropyrane substitué

Cet ouvrage traite de la formation diastéréosélective de tétrahydropyranes 3,7-cis et 3,7-trans polysubstitués. Des méthodologies de cycloétherification et de C-glycosidation en tandem avec une réduction radicalaire y sont décrites (pyranes 3,7- trans) tandis qu’une haloéthérification en tandem avec le même processus radicalaire conduit aux pyranes 3,7-cis. Suite à des travaux antérieurs du laboratoire, des études ont été réalisées afin de comprendre l’influence de la stéréochimie des substituants en position C3, C6, C7 et C8 sur l’issue diastéréochimique lors d’un transfert d’hydrure sous contrôle exocyclique sur un centre radicalaire adjacent à un tétrahydropyrane (C2). Ces études ont permis de solutionner les problèmes de diastéréosélectivité rencontrés lors des réductions radicalaires des centres en C2 de divers fragments élaborés d’ionophores (e.g. zincophorine, salinomycine, narasine…) réalisées par notre groupe. Des études conformationnelles réalisées sur des pyranes di- ou tri-substitués ont permis de comprendre les diastéréosélectivités notées lors du processus radicalaire en fonction des stéréochimies relatives des centres précédemment cités. En particulier, l’utilisation d’un bicycle rigide (trans-octahydrochromène) a permis de montrer l’importance du positionnement spatial (axial ou équatorial) de la chaîne portant le centre radicalaire. Par la suite, nous avons pu mettre en évidence une amplification des ratios en faveur du produit de réduction radicalaire 2,3-anti lorsque la réaction est réalisée en présence d’un acide de Lewis monodentate encombré (MAD). L’optimisation du contrôle endocyclique lors du transfert d’hydrure a permis de générer la stéréochimie complémentaire 2,3-syn. L’utilisation du TTMSS comme source d’hydrure combinée à l’utilisation d’un acide de Lewis bidentate tel que MgBr2·OEt2 a permis l’obtention d’excellentes sélectivités en faveur du produit endocyclique. Des études RMN 13C ainsi que le titrage des ions Mg2+ en solution ont été effectués afin de comprendre la nature des complexes impliqués. Finalement, ces études ont permis la formation stéréocontrôlée de centres stéréogéniques adjacents à un THP, motifs fréquement rencontrés dans certains policétides. Elles permettent ainsi d’envisager la synthèse de polyéthers de type ionophore et d’autres molécules d’intérêt biologique.

Développement d’une méthode de simulation multi-échelle pour l’étude des grandes transformations dans les protéines

Les films de simulations qui accompagnent le document ont été réalisés avec Pymol.

La sélectivité fonctionnelle des ligands du récepteur delta opiacé

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance.

Étude fonctionnelle du cotransporteur Na+/glucose (hSGLT1) : courant de fuite, vitesse de cotransport et modélisation cinétique

Les résultats présentés dans cette thèse précisent certains aspects de la fonction du cotransporteur Na+/glucose (SGLT1), une protéine transmembranaire qui utilise le gradient électrochimique favorable des ions Na+ afin d’accumuler le glucose à l’intérieur des cellules épithéliales de l’intestin grêle et du rein. Nous avons tout d’abord utilisé l’électrophysiologie à deux microélectrodes sur des ovocytes de xénope afin d’identifier les ions qui constituaient le courant de fuite de SGLT1, un courant mesuré en absence de glucose qui est découplé de la stoechiométrie stricte de 2 Na+/1 glucose caractérisant le cotransport. Nos résultats ont démontré que des cations comme le Li+, le K+ et le Cs+, qui n’interagissent que faiblement avec les sites de liaison de SGLT1 et ne permettent pas les conformations engendrées par la liaison du Na+, pouvaient néanmoins générer un courant de fuite d’amplitude comparable à celui mesuré en présence de Na+. Ceci suggère que le courant de fuite traverse SGLT1 en utilisant une voie de perméation différente de celle définie par les changements de conformation propres au cotransport Na+/glucose, possiblement similaire à celle empruntée par la perméabilité à l’eau passive. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à estimer la vitesse des cycles de cotransport de SGLT1 à l’aide de la technique de la trappe ionique, selon laquelle le large bout d’une électrode sélective (~100 μm) est pressé contre la membrane plasmique d’un ovocyte et circonscrit ainsi un petit volume de solution extracellulaire que l’on nomme la trappe. Les variations de concentration ionique se produisant dans la trappe en conséquence de l’activité de SGLT1 nous ont permis de déduire que le cotransport Na+/glucose s’effectuait à un rythme d’environ 13 s-1 lorsque le potentiel membranaire était fixé à -155 mV. Suite à cela, nous nous sommes intéressés au développement d’un modèle cinétique de SGLT1. En se servant de l’algorithme du recuit simulé, nous avons construit un schéma cinétique à 7 états reproduisant de façon précise les courants du cotransporteur en fonction du Na+ et du glucose extracellulaire. Notre modèle prédit qu’en présence d’une concentration saturante de glucose, la réorientation dans la membrane de SGLT1 suivant le relâchement intracellulaire de ses substrats est l’étape qui limite la vitesse de cotransport.