Tachykinins Processing is Significantly Impaired in PC1 and PC2 Mutant Mouse Spinal Cord S9 Fractions

Substance P (SP) play a central role in nociceptive transmission and it is an agonist of the Neurokinin-1 receptor located in the lamina I of the spinal cord. SP is a major proteolytic product of the protachykinin-1 primarily synthesized in neurons. Proprotein convertases (PCs) are extensively expressed in the central nervous system (CNS) and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous protachykinins has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis surrogate protachykinins (i.e. Tachykinin 20-68 and Tachykinin 58-78) using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Full-length Tachykinin 20-68 and Tachykinin 58-78 was incubated for 30 minutes in WT, PC1-/+ and PC2-/+ mouse spinal cord S9 fractions and specific C-terminal peptide fragments were identified and quantified by mass spectrometry. The results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 mediate the formation of SP and Tachykinin 58-71, an important SP precursor, with over 50% reduction of the rate of formation in mutant PC 1 and PC2 mouse S9 spinal cord fractions. The results obtained revealed that PC1 and PC2 are involved in the C-terminal processing of protachykinin peptides and suggest a major role in the maturation of the protachykinin-1 protein.

Étude du rôle de Pax6 dans la gliogenèse

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules.

The orphan nuclear receptor NR5A2 regulates peri-ovulatory events and their consequent luteinization in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2, également connu sous le nom de liver receptor homolog-1 (Lrh-1), est exprimé au niveau de l’ovaire chez la souris, exclusivement dans les cellules lutéales et de la granulosa. La perturbation de Nr5a2, spécifique aux cellules de la granulosa chez la souris à partir des follicules primaires dans la trajectoire du développement folliculaire a démontré que Nr5a2 est un régulateur clé de l’ovulation et de la fertilité chez la femelle. Notre hypothèse veut que Nr5a2 régule les évènements péri- et post-ovulatoires dans une séquence temporelle lors de la folliculogénèse. Afin d'étudier l’implication de Nr5a2 lors de l’ovulation et de la lutéinisation à différents stades du développement folliculaire, nous avons généré deux modèles de souris knockout spécifiques aux cellules de la granulosa pour Nr5a2: 1) Nr5a2Amhr2-/-, avec une réduction de Nr5a2 à partir des follicules primaires et subséquents; 2) Nr5a2Cyp19-/-, avec une réduction de Nr5a2 débutant au stade antral de développement en progressant. L’absence de Nr5a2 à partir des follicules antraux a résulté en une infertilité chez les femelles Nr5a2Cyp19-/-, de même qu’en des structures non-fonctionnelles similaires aux structures lutéales au niveau des ovaires, en une réduction des niveaux de progestérone synthétisée ainsi qu’en un échec dans le support d’une pseudo-gestation. La synthèse de progestérone a été entravée suite à l’absence de Nr5a2 par l’entremise d’une régulation à la baisse des gènes reliés au transport du cholestérol, Scarb1, StAR et Ldlr, démontré par qPCR. Les complexes cumulus-oocytes des femelles Nr5a2Cyp19-/- immatures super-stimulées ont subi une expansion in vivo, mais l’ovulation a été perturbée, possiblement par une régulation à la baisse du gène du récepteur de la progestérone (Pgr). Un essai d’expansion du cumulus in vitro a démontré une expansion défectueuse du cumulus chez les Nr5a2Amhr2-/-, associée à un dérèglement de la protéine des jonctions communicantes (Gja1; Cx43). Cependant, l’expansion du cumulus chez les Nr5a2Cyp19-/- n’a pas été autant affectée. Des résultats obtenus par qPCR ont démontré une régulation à la baisse dans l’expression des gènes Areg, Ereg, Btc et Tnfaip6 chez les deux modèles de cellules ovariennes knockout à 2h et 4h post hCG. Nous avons observé que 85% des oocytes, chez les deux génotypes mutants, peuvent subir une rupture de la vésicule germinative, confirmant leur capacité de maturation in vivo. La technique d’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïdes a prouvé que les oocytes des deux génotypes mutants sont fertilisables et que 70% des embryons résultants ont poursuivi leur développement vers le stade de blastocyste, et ce, indépendamment du génotype. En conclusion, Nr5a2 régule la fertilité chez les femelles tout au long du processus du développement folliculaire. Il a été démontré que Nr5a2 est essentiel à la lutéinisation et que sa perturbation dans les cellules somatiques ovariennes ne compromet pas la capacité des oocytes à être fertilisés. En vue d’ensemble, nous avons fourni une investigation inédite et complète, utilisant de multiples modèles et techniques afin de déterminer les mécanismes par lesquels Nr5a2 régule les importants processus que sont l’expansion du cumulus, l’ovulation ainsi que la formation du corps jaune.

The role of the nuclear receptor Nr5a2 in ovulation in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux.

Characterization of Endoproteolytic Processing of Dynorphins by Proprotein Convertases using Mouse Spinal Cord S9 Fractions and Mass Spectrometry

Dynorphins are important neuropeptides with a central role in nociception and pain alleviation. Many mechanisms regulate endogenous dynorphin concentrations, including proteolysis. Proprotein convertases (PCs) are widely expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous Big Dynorphin (BDyn) and Dynorphin A (Dyn A) levels has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis control of BDyn and Dyn A levels using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Our results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 are involved in the proteolysis regulation of BDyn and Dyn A with a more important role for PC1. C-terminal processing of BDyn generates specific peptide fragments Dynorphin 1-19, Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7 and C-terminal processing of Dyn A generates Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7, all these peptide fragments are associated with PC1 or PC2 processing. Moreover, proteolysis of BDyn leads to the formation of Dyn A and Leu-Enk, two important opioid peptides. The rate of formation of both is significantly reduced in cellular fractions of spinal cord mutant mice. As a consequence, even partial inhibition of PC1 or PC2 may impair the endogenous opioid system.