Analyse des protéines cellulaires incorporées dans les particules matures du virus de l’Herpès simplex de type 1

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l’hôte de façon très variée et plusieurs types vont même jusqu’à incorporer certaines protéines cellulaires. Nous avons récemment effectué la première analyse protéomique du virion mature de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de déterminer que jusqu’à 49 protéines cellulaires différentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de déterminer leur importance dans le cycle de réplication d’HSV-1, nous avons mis au point un système de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relâché dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqué à la GFP ainsi que des petits ARN interférents (pARNi) ciblant spécifiquement ces protéines cellulaires. Cette approche nous a permis de démontrer que 17 des protéines identifiées précédemment jouaient un rôle critique dans la réplication d’HSV-1, suggérant ainsi que leur incorporation dans le virus n’est pas aléatoire. Nous avons ensuite examiné le rôle d’une de ces protéines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protéine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de réplication de plusieurs virus humains. À l’aide de pARNi ainsi que de différentes lignées cellulaires, dont une lignée DDX3X thermosensible, nous avons démontré que l’inhibition de DDX3X résultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de l’expression des gènes viraux. Nous avons aussi démontré que la fraction de DDX3X incorporée dans le virion contribuait activement au cycle infectieux d’HSV-1. Ces résultats confirment l’intérêt de notre approche afin d’étudier les interactions hôte-pathogène en plus de démontrer la contribution des protéines cellulaires incorporées à HSV-1 dans l’infection virale.

Caractérisation clinique et moléculaire de nouvelles translocations chromosomiques ciblant le gène RUNX1 dans les leucémies aiguës de l’adulte

La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës.

HIV-1 Vpr induces the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of target cellular proteins to activate ATR and promote G2 arrest

HIV-1 viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest at the G2/M phase by a mechanism involving the activation of the DNA damage sensor ATR. We and others recently showed that Vpr performs this function by subverting the activity of the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase. Vpr could thus act as a connector between the E3 ligase and an unknown cellular factor whose ubiquitination would induce G2 arrest. While attractive, this model is solely based on the indirect observation that some mutants of Vpr retain their interaction with the E3 ligase but fail to induce G2 arrest. Using a tandem affinity purification approach, we observed that Vpr interacts with ubiquitinated cellular proteins and that this association requires the recruitment of an active E3 ligase given that depletion of VPRBP by RNA interference or overexpression of a dominant-negative mutant of CUL4A decreased this association. Importantly, G2-arrest-defective mutants of Vpr in the C-terminal putative substrate-interacting domain displayed decreased association with ubiquitinated proteins. We also found that inhibition of proteasomal activity increased this association and that the ubiquitin chains were at least in part constituted of classical K48 linkages. Interestingly, inhibition of K48 polyubiquitination specifically impaired Vpr-induced phosphorylation of H2AX, an early target of ATR, but did not affect UV-induced H2AX phosphorylation. Overall, our results provide direct evidence that association of Vpr with the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase induces the K48-linked polyubiquitination of yet-unknown cellular proteins resulting in their proteasomal degradation and ultimately leading to activation of ATR and G2 arrest.

Development of cellular and gene therapies for b[beta]-Thalassemia and sickle cell disease

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Polymeric nanoparticles : from microporosity and drug release kinetics to cellular interactions

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Ionic, cellular and molecular mechanisms underlying the QT prolongation and arrhythmias in diabetic cardiocomplications

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Modulation of I����/I�� by cellular metabolites : implication in the arrhythmogenesis during myocardial ischemia

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.