Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

CD40-stimulated B Lymphocytes Pulsed with Tumor Antigens Are Effective Antigen-presenting Cells That Can Generate Specific T Cells

Although they are considered as antigen presenting cells (APC), the role of antigen-unspecific B-lymphocytes in antigen presentation and T lymphocyte stimulation remains controversial. In this paper, we tested the capacity of normal human peripheral activated B cells to stimulate T cells using melanoma antigens or melanoma cell lysates. B lymphocytes activated through CD40 ligation and then pulsed with tumor antigens efficiently processed and presented MHC class II restricted peptides to specific CD4+ T cell clones. This suggests that CD40-activated B cells have the functional and molecular competence to present MHC class II epitopes when pulsed with exogenous antigens, thereby making them a relevant source of APC to generate T cells. To test this hypothesis, CD40-activated B cells were pulsed with a lysate prepared from melanoma cells and used to stimulate peripheral autologous T cells. Interestingly, T cells specific to melanoma antigens were generated. Further analysis of these T cell clones revealed that they recognized MHC class II restricted epitopes from tyrosinase, a known melanoma tumor antigen. The efficient antigen presentation by antigen-unspecific activated B cells was correlated with a down-regulation in the expression of HLA-DO, a B cell specific protein known to interfere with HLA-DM function. Because HLA-DM is important in MHC class II peptide loading, the observed decrease in HLA-DO may partially explain the enhanced antigen presentation following B-cell activation. Results globally suggest that when they are properly activated, antigen-unspecific B-lymphocytes can present exogenous antigens by MHC class II molecules and stimulate peripheral antigen-specific T cells. Antigen presentation by activated B cells could be exploited for immunotherapy by allowing the in vitro generation of T cells specific against antigens expressed by tumors or viruses.

Regulation of the memory T cell development and islet beta-cell survival by DAPK-related apoptosis-inducing protein kinase 2 (Drak2)

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète.

Globin Gene Expression: Role of Transcription Factors

La dérégulation de l'expression génétique est une base pathophysiologique de plusieurs maladies. On a utilisé le locus du gène β-globine humain comme modèle pour élucider le mécanisme de régulation de la transcription génétique et évaluer son expression génétique durant l'érythropoïèse. La famille des protéines 'E' est composée de facteurs de transcription qui possèdent plusieurs sites de liaison au sein de locus du gène β-globine, suggérant leur rôle potentiel dans la régulation de l’expression de ces gènes. Nous avons montré que les facteurs HEB, E2A et ETO2 interagissent d’une manière significative avec la région contrôle du Locus (LCR) et avec les promoteurs des gènes de la famille β-globine. Le recrutement de ces facteurs au locus est modifié lors de l'érythropoïèse dans les cellules souches hematopoitiques et les cellules erythroides de souris transgéniques pour le locus de la β-globine humain, ainsi que dans les cellules progénitrices hématopoïétiques humaines. De plus par cette étude, nous démontrons pour la première fois que le gène β-globine humain est dans une chromatine active et qu’il interagit avec des facteurs de transcriptions de type suppresseurs dans les cellules progénitrices lymphoïdes (voie de différentiation alternative). Cette étude a aussi été faite dans des souris ayant une génétique mutante caractérisée par l'absence des facteurs de transcription E2A ou HEB.

Études structurales d’interactions protéine/protéine impliquées dans l’érythropoïèse

Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes.

Implication de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la transmission mère-enfant du VIH-1

La transmission mère-enfant du VIH-1 (TME) représente le principal mode d’infection chez l’enfant et se produit durant la grossesse (in utero, IU), l’accouchement (intrapartum, IP) ou l’allaitement (postpartum, PP). Les mécanismes qui sous-tendent le passage du VIH-1 à travers le placenta et les muqueuses intestinales du nouveau-né sont encore très peu décrits. « Dendritic cell-specific ICAM-grabbing non-integrin » (DC-SIGN) et son homologue DC-SIGN « related » (DC-SIGNR) sont des récepteurs d’antigènes exprimés au niveau du placenta et capables de capter et de transmettre le VIH-1 aux cellules adjacentes. Ils pourraient donc participer au passage trans placentaire du VIH-1 et le polymorphisme génétique affectant l’expression ou modifiant l’interaction avec le virus aurait une influence sur la TME du VIH-1. Afin d’explorer cette hypothèse, nous avons procédé à une analyse exhaustive du polymorphisme de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la population du Zimbabwe. Par la suite, nous avons déterminé l’association entre le polymorphisme de DC-SIGN et DC-SIGNR et la TME du VIH-1 dans une cohorte d’enfants nés de mères VIH-positives à Harare, au Zimbabwe. Enfin, nous avons défini l’impact fonctionnel des mutations associées. Les enfants homozygotes pour les haplotypes H1 et H3 dans le gène de DC-SIGNR sont 4 à 6 fois plus à risque de contracter le VIH-1 par voie IU et IP. H1 et H3 contiennent la mutation du promoteur p-198A et la mutation de l’intron 2, int2-180A, et des études fonctionnelles nous ont permis de démontrer que p-198A diminue l’activité transcriptionnelle du promoteur de DC-SIGNR et l’expression des transcrits d’ARNm dans le placenta, alors que int2-180A modifie le répertoire d’isoformes de DC-SIGNR vers une proportion diminuée d’isoformes membranaires. Les enfants porteurs des haplotypes H4 et H6 de DC-SIGN sont 2 à 6 fois plus à risque de contracter le VIH-1 par voie IU. Ces haplotypes contiennent deux mutations du promoteur (p-336T/C et p-201C/A) et quatre mutations codant pour un changement d’acide aminé dans l’exon 4 (R198Q, E214D, R221Q ou L242V) associées à un risque augmenté de transmission IU, IP et PP du VIH-1. Des études fonctionnelles ont démontré que les mutations du promoteur diminuent l’expression de DC-SIGN dans les macrophages placentaires. Toutefois, l’exposition IU au VIH-1 module le niveau d’expression de DC-SIGN, résultant en des niveaux d’expression similaires entre les macrophages des porteurs des allèles sauvages et mutés. Les mutations de l’exon 4 augmentent l’affinité de DC-SIGN pour le VIH-1 et sa capacité à capturer et à transmettre le virus aux lymphocytes T, favorisant possiblement la dissémination du VIH-1 à travers le placenta. L’association entre les mutations de DC-SIGN et la transmission IP et PP du VIH-1 suggèrent qu’il aurait aussi un rôle à jouer dans les muqueuses intestinales de l’enfant. Notre étude démontre pour la première fois l’implication de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la TME du VIH-1. L’augmentation des capacités de capture et de transmission de DC-SIGN résulte en une susceptibilité accrue de l’enfant à l’infection au VIH-1 et concorde avec un rôle dans la dissémination transplacentaire. Toutefois, la diminution préférentielle des transcrits membranaires de DC-SIGNR au placenta augmente la TME du VIH-1 et laisse croire à son implication via un autre mécanisme. Ces mécanismes pourraient aussi s’appliquer à d’autres pathogènes reconnus par DC-SIGN et DC-SIGNR et transmis de la mère à l’enfant.

Alternative splicing by hnRNP L as a new modulator of hematopoietic cell differentiation, survival and migration

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration.

Morphologie évolutive et fonctionnelle des hémichordés

L’embranchement Hemichordata regroupe les classes Enteropneusta et Pterobranchia. Hemichordata constitue, avec l’embranchement Echinodermata, le groupe-frère des chordés. Les entéropneustes sont des organismes vermiformes solitaires qui vivent sous ou à la surface du substrat et s’alimentent généralement par déposivorie, alors que les ptérobranches sont des organismes coloniaux filtreurs habitant dans un réseau de tubes appelé coenecium. Ce mémoire présente trois études dont le point commun est l’utilisation des hémichordés actuels pour répondre à des questions concernant l’évolution des hémichordés, des chordés, et du super-embranchement qui les regroupe, Deuterostomia. Notre première étude démontre que les fentes pharyngiennes, l’organe pré-oral cilié (POCO) et le pharynx de l’entéropneuste Protoglossus graveolens sont utilisés pour l’alimentation par filtration. Le système de filtration de P. graveolens permet la capture de particules jusqu’à 1.3 um, à un débit de 4.05 mm.s-1, pour une demande énergétique de 0.009 uW. Les similarités structurales et fonctionnelles avec le système de filtration des céphalochordés suggèrent que la filtration pharyngienne est ancestrale aux deutérostomes. Lors de notre deuxième étude, nous avons exploré l’hypothèse selon laquelle le POCO des entéropneustes, une structure ciliée pré-buccale au rôle possiblement chémorécepteur, serait homologue au « wheel organ » des céphalochordés et à l’adénohypophyse des vertébrés. Pour cela, nous avons déterminé par immunohistochimie l’expression de Pit-1, un facteur de transcription spécifique à ces deux structures, chez l’entéropneuste Saccoglossus pusillus. Pit-1 est exprimé dans des cellules sensorielles du POCO, mais aussi dans des cellules épithéliales distribuées dans le proboscis, collet et tronc. Ce patron d’expression ne permet pas de confirmer ou rejeter l’homologie du POCO et de l’adénohypophyse des vertébrés. Lors de notre troisième étude, nous avons caractérisé l’ultrastructure du coenecium des ptérobranches Cephalodiscus hodgsoni, Cephalodiscus nigrescens et Cephalodiscus densus par microscopie électronique à transmisison et à balayage. Cephalodiscus est le groupe frère de Graptolithina, un groupe qui inclut les graptolithes éteints ainsi que les ptérobranches du genre Rhabdopleura. Nous avons décrit les types de fibrilles de collagène présents, leur taille et leur organisation, ainsi que l’organisation globale du coenecium. Nous avons ainsi démontré la présence chez Cephalodiscus d’une organisation similaire au paracortex, pseudocortex et eucortex des graptolithes. La présence chez Cephalodiscus de ce type d’organisation suggère que le cortex est ancestral à la classe Pterobranchia. Ces trois études illustrent plusieurs axes importants de la recherche sur les hémichordés, qui en intégrant des données morphologiques, fonctionnelles et moléculaires permet de reconstruire certains évènements clés de l’évolution des deutérostomes.

Identification des peptides du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I par spectrométrie de masse

L’immunité adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertébrés à mâchoire reposent sur la présentation de peptides par les récepteurs d’histocompatibilité majeur de classe I. Les peptides antigéniques, présentés par les molécules du complexe d’histocompatibilité (CMH), sont scrutés par les lymphocytes T CD8 pour une réponse immunitaire appropriée. Le répertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appelé immunopeptidome, est généré par la dégradation protéosomale des protéines endogènes, et a un rôle essentiel dans la régulation de l’immunité cellulaire. La composition de l’immunopeptidome dépend du type de cellule et peut présenter des caractéristiques liées à des maladies comme le cancer. Les peptides antigéniques peuvent être utilisés à des fins immunothérapeutiques notamment dans le traitement voire la prévention de certains cancers. La spectrométrie de masse est un outil de choix pour l’identification, le séquençage et la caractérisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides aminés, la faible abondance et la diversité de ces peptides compliquent leur détection et leur séquençage. Nous avons développé un programme appelé StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives à la fragmentation des peptides. À l’aide de ce programme, nous montrons sans équivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent très différemment des peptides trypsiques communément utilisés en protéomique. Néanmoins, la fragmentation par décomposition induite par collision à plus haute énergie (HCD) proposée par le spectromètre LTQ-Orbitrap Velos améliore la fragmentation et fournit une haute résolution qui permet d’obtenir une meilleure confiance dans l’identification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet d’effectuer le séquençage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifiés par les recherches utilisant des bases de données. La comparaison des programmes de séquençage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en évidence que le dernier permet d’identifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intégré dans une chaîne de traitement de recherche d’antigènes mineurs d’histocompatibilité. Enfin, une base de données contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a été développée.

Effects of hypothermia on brain glucose metabolism in acute liver failure: a H/C-nuclear magnetic resonance study.

Mild hypothermia has a protective effect on brain edema and encephalopathy in both experimental and human acute liver failure. The goals of the present study were to examine the effects of mild hypothermia (35°C) on brain metabolic pathways using combined 1H and 13C-Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, a technique which allows the study not only of metabolite concentrations but also their de novo synthesis via cell-specific pathways in the brain. :1H and 13C NMR spectroscopy using [1-13C] glucose was performed on extracts of frontal cortex obtained from groups of rats with acute liver failure induced by hepatic devascularization whose body temperature was maintained either at 37°C (normothermic) or 35°C (hypothermic), and appropriate sham-operated controls. At coma stages of encephalopathy in the normothermic acute liver failure animals, glutamine concentrations in frontal cortex increased 3.5-fold compared to sham-operated controls (P < 0.001). Comparable increases of brain glutamine were observed in hypothermic animals despite the absence of severe encephalopathy (coma). Brain glutamate and aspartate concentrations were respectively decreased to 60.9% ± 7.7% and 42.2% ± 5.9% (P < 0.01) in normothermic animals with acute liver failure compared to control and were restored to normal values by mild hypothermia. Concentrations of lactate and alanine in frontal cortex were increased to 169.2% ± 15.6% and 267.3% ± 34.0% (P < 0.01) respectively in normothermic rats compared to controls. Furthermore, de novo synthesis of lactate and alanine increased to 446.5% ± 48.7% and 707.9% ± 65.7% (P < 0.001), of control respectively, resulting in increased fractional 13C-enrichments in these cytosolic metabolites. Again, these changes of lactate and alanine concentrations were prevented by mild hypothermia. Mild hypothermia (35°C) prevents the encephalopathy and brain edema resulting from hepatic devascularization, selectively normalizes lactate and alanine synthesis from glucose, and prevents the impairment of oxidative metabolism associated with this model of ALF, but has no significant effect on brain glutamine. These findings suggest that a deficit in brain glucose metabolism rather than glutamine accumulation is the major cause of the cerebral complications of acute liver failure.

La collaboration entre l'oncogène E2A-PBX1 et Hoxa9 lors de l'induction de B-ALL implique l'activation de Flt3

La protéine de fusion E2A-PBX1 induit une leucémie lymphoblastique aigüe des cellules B pédiatrique chez l’humain. E2A-PBX1 possède de puissantes propriétés de trans-activation et peut se lier à l’ADN ainsi qu’aux protéines homéotiques (HOX) via des domaines conservés dans sa portion PBX1, ce qui suggère qu’une dérégulation des gènes cibles de HOX/PBX1 contribue à la leucémogénèse. Précédemment, Bijl et al. (2008) ont démontré que certains gènes Hox collaborent de manière oncogénique avec E2A-PBX1, et que ces interactions sont cellules-spécifiques et varient en fonction du gène Hox impliqué. Une mutagénèse d’insertion provirale suggère et supporte la collaboration des gènes Hoxa et E2A-PBX1 lors de la leucémogénèse des cellules B. La présence de ces interactions dans les cellules B et leur implication dans l’induction des B-ALL est pertinente pour la compréhension de la maladie humaine, et reste encore mal comprise. Notre étude démontre qu’Hoxa9 confère un avantage prolifératif aux cellules B E2A-PBX1. Des expériences de transplantation à l’aide de cellules B E2A-PBX1/Hoxa9 positives isolées de chimères de moelle osseuse démontrent qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 en contribuant à la transformation oncogénique des cellules, et qu’Hoxa9 seul n’induit aucune transformation. Une analyse par Q-RT-PCR nous a permis de démontrer une forte inhibition de gènes spécifiques aux cellules B dans les leucémies co-exprimant Hoxa9 et E2A-PBX1, en plus d’une activation de Flt3, suggérant une inhibition de la différenciation des cellules B accompagnée d’une augmentation de la prolifération. De plus, la surexpression de Hoxa9 dans des cellules leucémiques de souris transgéniques E2A-PBX1, confère aussi un avantage prolifératif aux cellules in vitro, qui semblent être influencé par une augmentation de l’expression de Flt3 et Pdgfδ. En conclusion, nous démontrons pour la première fois à l’aide d’un modèle murin qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 lors de la transformation oncogénique des cellules B et que la signalisation via Flt3 est impliquée, ce qui est potentiellement pertinent pour la maladie humaine.

Systems biology of the human MHC class I immunopeptidome

Le système de différenciation entre le « soi » et le « non-soi » des vertébrés permet la détection et le rejet de pathogènes et de cellules allogéniques. Il requiert la surveillance de petits peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I). Les molécules du CMH I sont des hétérodimères composés par une chaîne lourde encodée par des gènes du CMH et une chaîne légère encodée par le gène β2-microglobuline. L’ensemble des peptides est appelé l’immunopeptidome du CMH I. Nous avons utilisé des approches en biologie de systèmes pour définir la composition et l’origine cellulaire de l’immunopeptidome du CMH I présenté par des cellules B lymphoblastoïdes dérivés de deux pairs de fratries avec un CMH I identique. Nous avons découvert que l’immunopeptidome du CMH I est spécifique à l’individu et au type cellulaire, qu’il dérive préférentiellement de transcrits abondants, est enrichi en transcrits possédant d’éléments de reconnaissance par les petits ARNs, mais qu’il ne montre aucun biais ni vers les régions génétiques invariables ni vers les régions polymorphiques. Nous avons également développé une nouvelle méthode qui combine la spectrométrie de masse, le séquençage de nouvelle génération et la bioinformatique pour l’identification à grand échelle de peptides du CMH I, dont ceux résultants de polymorphismes nucléotidiques simples non-synonymes (PNS-ns), appelés antigènes mineurs d’histocompatibilité (AMHs), qui sont les cibles de réponses allo-immunitaires. La comparaison de l’origine génomique de l’immunopeptidome de soeurs avec un CMH I identique a révélé que 0,5% des PNS-ns étaient représentés dans l’immunopeptidome et que 0,3% des peptides du CMH I seraient immunogéniques envers une des deux soeurs. En résumé, nous avons découvert des nouveaux facteurs qui modèlent l’immunopeptidome du CMH I et nous présentons une nouvelle stratégie pour l’indentification de ces peptides, laquelle pourrait accélérer énormément le développement d’immunothérapies ciblant les AMHs.

Monoacylglycerol, alpha/beta-hydrolase domain-6, and the regulation of insulin secretion and energy metabolism

Le cycle glycérolipides/acides gras libres (GL/FFA) est une voie métabolique clé qui relie le métabolisme du glucose et des acides gras et il est composé de deux processus métaboliques appelés lipogenèse et lipolyse. Le cycle GL/FFA, en particulier la lipolyse des triglycérides, génère diverses molécules de signalisation pour réguler la sécrétion d'insuline dans les cellules bêta pancréatiques et la thermogenèse non-frissonnante dans les adipocytes. Actuellement, les lipides provenant spécifiquement de la lipolyse impliqués dans ce processus sont mal connus. L’hydrolyse des triglycérides dans les cellules β est réalisée par les actions successives de la triglycéride lipase adipocytaire pour produire le diacylglycérol, ensuite par la lipase hormono-sensible pour produire le monoacylglycérol (MAG) et enfin par la MAG lipase (MAGL) qui relâche du glycerol et des acides gras. Dans les cellules bêta, la MAGL classique est très peu exprimée et cette étude a démontré que l’hydrolyse de MAG dans les cellules β est principalement réalisée par l'α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6) nouvellement identifiée. L’inhibition d’ABHD6 par son inhibiteur spécifique WWL70, conduit à une accumulation des 1-MAG à longues chaines saturées à l'intérieur des cellules, accompagnée d’une augmentation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS). Baisser les niveaux de MAG en surexprimant ABHD6 dans la lignée cellulaire bêta INS832/13 réduit la GSIS, tandis qu’une augmentation des niveaux de MAG par le « knockdown » d’ABHD6 améliore la GSIS. L'exposition aiguë des monoacylglycérols exogènes stimule la sécrétion d'insuline de manière dose-dépendante et restaure la GSIS supprimée par un inhibiteur de lipases appelé orlistat. En outre, les souris avec une inactivation du gène ABHD6 dans tous les tissus (ABHD6-KO) et celles avec une inactivation du gène ABHD6 spécifiquement dans la cellule β présentent une GSIS stimulée, et leurs îlots montrent une augmentation de la production de monoacylglycérol et de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. L’inhibition d’ABHD6 chez les souris diabétiques (modèle induit par de faibles doses de streptozotocine) restaure la GSIS et améliore la tolérance au glucose. De plus, les résultats montrent que les MAGs non seulement améliorent la GSIS, mais potentialisent également la sécrétion d’insuline induite par les acides gras libres ainsi que la sécrétion d’insuline induite par divers agents et hormones, sans altération de l'oxydation et l'utilisation du glucose ainsi que l'oxydation des acides gras. Nous avons démontré que le MAG se lie à la protéine d’amorçage des vésicules appelée Munc13-1 et l’active, induisant ainsi l’exocytose de l'insuline. Sur la base de ces observations, nous proposons que le 1-MAG à chaines saturées agit comme facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline et que ABHD6 est un modulateur négatif de la sécrétion d'insuline. En plus de son rôle dans les cellules bêta, ABHD6 est également fortement exprimé dans les adipocytes et son niveau est augmenté avec l'obésité. Les souris dépourvues globalement d’ABHD6 et nourris avec une diète riche en gras (HFD) montrent une faible diminution de la prise alimentaire, une diminution du gain de poids corporel et de la glycémie à jeun et une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l'insuline et ont une activité locomotrice accrue. En outre, les souris ABHD6-KO affichent une augmentation de la dépense énergétique et de la thermogenèse induite par le froid. En conformité avec ceci, ces souris présentent des niveaux élevés d’UCP1 dans les adipocytes blancs et bruns, indiquant le brunissement des adipocytes blancs. Le phénotype de brunissement est reproduit dans les souris soit en les traitant de manière chronique avec WWL70 (inhibiteur d’ABHD6) ou des oligonucléotides anti-sense ciblant l’ABHD6. Les tissus adipeux blanc et brun isolés de souris ABHD6-KO montrent des niveaux très élevés de 1-MAG, mais pas de 2-MAG. L'augmentation des niveaux de MAG soit par administration exogène in vitro de 1-MAG ou par inhibition ou délétion génétique d’ABHD6 provoque le brunissement des adipocytes blancs. Une autre évidence indique que les 1-MAGs sont capables de transactiver PPARα et PPARγ et que l'effet de brunissement induit par WWL70 ou le MAG exogène est aboli par les antagonistes de PPARα et PPARγ. L’administration in vivo de l’antagoniste de PPARα GW6471 à des souris ABHD6-KO inverse partiellement les effets causés par l’inactivation du gène ABHD6 sur le gain de poids corporel, et abolit l’augmentation de la thermogenèse, le brunissement du tissu adipeux blanc et l'oxydation des acides gras dans le tissu adipeux brun. L’ensemble de ces observations indique que ABHD6 régule non seulement l’homéostasie de l'insuline et du glucose, mais aussi l'homéostasie énergétique et la fonction des tissus adipeux. Ainsi, 1-MAG agit non seulement comme un facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline en activant Munc13-1 dans les cellules bêta, mais régule aussi le brunissement des adipocytes blancs et améliore la fonction de la graisse brune par l'activation de PPARα et PPARγ. Ces résultats indiquent que ABHD6 est une cible prometteuse pour le développement de thérapies contre l'obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique.

The role of transcription factor Pitx1 and its regulation by hypoxia in Adolescent Idiopathic Scoliosis

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est définie comme une courbure de la colonne vertébrale supérieure à 10 degrés, qui est de cause inconnue et qui affecte de façon prépondérante les adolescents. Des études précédentes sur des modèles murins ont démontré une inactivation partielle du gène Pitx1. Cette inactivation partielle provoque une déformation spinale sévère lors du développement des souris Pitx1+/-, ce qui est grandement similaire au phénotype de la SIA. En se basant sur ces observations, nous postulons que la perte de fonction de Pitx1 pourrait avoir un rôle dans la SIA et pourrait être régulée par des mécanismes moléculaires spécifiques. En effet, des études faites sur l’expression de Pitx1 révèlent une perte de son expression dans les ostéoblastes dérivés de patients SIA au niveau de l’ARNm. Nous émettons l’hypothèse que la perte de Pitx1 dans la SIA pourrait être déclenchée par des facteurs hypoxiques puisqu’il est connu que Pitx1 est réprimé par l’hypoxie et que HIF-2 alpha est surexprimés dans les ostéoblastes des patients SIA même dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons découvert une mutation dans le domaine ODD des HIF-1 alpha chez certains patients SIA (3,1%). Une fonction connue de ce domaine est de stabiliser et d’augmenter l’activité transcriptionnelle de HIF-1 alpha dans des conditions normoxiques. Nous avons confirmé, par la technique EMSA, l’existence d’un élément de réponse fonctionnel à l’hypoxie au niveau du promoteur de Pitx1. Cependant, des co-transfections avec des vecteurs d’expression pour HIF-1 alpha et HIF-2 alpha, en présence de leur sous-unité beta ARNT, ont conduit à une activation du promoteur de Pitx1 dans la lignée cellulaire MG-63 ainsi que dans les ostéoblastes des sujets contrôles. Il est intéressant de constater qu’aucune activité du promoteur de Pitx1 dans les ostéoblastes SIA n’a été observée, même après la co-expression de HIF-2 alpha et ARNT, confirmant le fait que l’expression de Pitx1 est abrogée dans la SIA. Dans l’ensemble, nos résultats démontrent un rôle important de Pitx1 dans la SIA et une possible régulation par des facteurs hypoxiques.

Yeast RNase III triggers polyadenylation-independent transcription termination

Transcription termination of messenger RNA (mRNA) is normally achieved by polyadenylation followed by Rat1p-dependent 5'-3' exoribonuleolytic degradation of the downstream transcript. Here we show that the yeast ortholog of the dsRNA-specific ribonuclease III (Rnt1p) may trigger Rat1p-dependent termination of RNA transcripts that fail to terminate near polyadenylation signals. Rnt1p cleavage sites were found downstream of several genes, and the deletion of RNT1 resulted in transcription readthrough. Inactivation of Rat1p impaired Rnt1p-dependent termination and resulted in the accumulation of 3' end cleavage products. These results support a model for transcription termination in which cotranscriptional cleavage by Rnt1p provides access for exoribonucleases in the absence of polyadenylation signals.