82 resultados para Cd4 Lymphocytes-t
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
La barrire hmato-encphalique (BHE) protge le systme nerveux central (SNC) en contrlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est forme de cellules endothliales lies ensemble par des jonctions serres et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci scrtant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protomique de radeaux lipidiques de cellules endothliales de la BHE humaine a identifi la prsence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent lies des processus de dveloppement embryologique ainsi quau niveau des tissus adultes. Suite nos expriences, jai dtermin que les astrocytes produisent et secrtent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothliales humaines en cultures primaires expriment le rcepteur Patched (Ptch)-1, le co-rcepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, lactivation de la voie Hh augmente ltanchit des cellules endothliales de la BHE in vitro. Le blocage de lactivation de la voie Hh en utilisant lantagoniste cyclopamine ainsi quen utilisant des souris Shh dficientes (-/-) diminue lexpression des protines de jonctions serres, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation sest aussi montre comme tant immunomodulatoire, puisque lactivation de la voie dans les cellules endothliales de la BHE diminue lexpression de surface des molcules dadhsion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la scrtion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, crant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ travers une monocouche de cellules endothliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF- and IFN- in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que lexpression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lsions actives de la sclrose en plaques (SEP), o la BHE est plus permable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothliales de la BHE naugmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggrant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces rsultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les proprits de la BHE, et quun environnement dinflammation pourrait potentiellement drgler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothliales.
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La Sclrose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire dmylinisante du systme nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang priphrique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces ractions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le systme vasculaire du SNC, la barrire hmo-encphalique (BHE), pour avoir accs au SNC et sy accumuler. La BHE est donc la premire entit que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confre un potentiel thrapeutique important pour influencer linfiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les ractions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Diffrents mcanismes pouvant influencer la permabilit de la BHE aux cellules immunitaires ont t dcrits, et reprsentent aujourdhui des cibles potentielles pour le contrle des ractions neuro-immunes. Cette thse a pour objectif de dcrire de nouveaux mcanismes molculaires oprant au niveau de la BHE qui interviennent dans les ractions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thrapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est spar en trois sections. La premire section dcrit la caractrisation du rle de langiotensine II dans la rgulation de la permabilit de la BHE. La seconde section identifie et caractrise la fonction dune nouvelle molcule dadhrence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisime section traite des proprits scrtoires de la BHE et du rle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous dmontrons limportance de langiotensinogne (AGT) dans la rgulation de la permabilit de la BHE. LAGT est scrt par les astrocytes et mtabolis en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE travers le rcepteur langiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, langiotensine II entrane la phosphorylation et lenrichissement de loccludine au sein de radeaux lipidiques, un phnomne associ laugmentation de ltanchit de la BHE. De plus, dans les lsions de SEP, on retrouve une diminution de lexpression de lAGT et de loccludine. Ceci est reli nos observations in vitro, qui dmontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la scrtion de lAGT. Cette tude lucide un nouveau mcanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent ltanchit de la BHE, et implique une dysfonction de ce mcanisme dans les lsions de la SEP o saccumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxime temps, les techniques tablies dans la premire section ont t utilises afin didentifier les protines de la BHE qui saccumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protomique nous avons identifi ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protine membranaire exprime par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molcule dadhrence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou htrotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau dexpression dALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, linhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) travers la BHE in vitro et in vivo dans un modle murin de la SEP. Cette deuxime partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisime temps, nous avons pu dmontrer limportance des proprits scrtoires spcifiques la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN reprsentent un potentiel thrapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la rgnration cellulaire est limite, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent lutilisation thrapeutique des CSN sont le mode dadministration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route dadministration prfre pour les CSN soit la voie intrathcale, linjection intraveineuse reprsente la voie dadministration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme crbral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spcialiss en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent travers les CE humaines de la BHE avant dentamer leur diffrenciation en cellules du SNC. Suite la migration travers les cellules de la BHE les CSN se diffrencient spontanment en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont nots prfrentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non crbrales. Ces proprits spcifiques aux cellules de la BHE dpendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 scrte par ces dernires. Ainsi, cette dernire partie suggre que la BHE nest pas un obstacle la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifie comme un facteur scrt par la BHE qui permet laccumulation et la diffrentiation prfrentielle de cellules souches neurales dans lespace sous-endothlial. Ces trois tudes dmontrent limportance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mcanismes molculaires contribuent au drglement de lhomostasie du SNC dans les ractions neuro-immunes. En utilisant des modles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifi trois nouveaux mcanismes qui permettent dinfluencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. Lidentification de ces mcanismes permet non seulement une meilleure comprhension de la pathophysiologie des ractions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associes, mais suggre galement des cibles thrapeutiques potentielles pour influencer linfiltration des cellules du sang vers le cerveau
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Les cellules mylodes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent la pathognse de linfection VIH-1 en participant la dissmination du virus, mais galement en reprsentant des rservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploites par le VIH-1 afin dassurer sa propagation travers lorganisme. Notamment, une infection VIH-1 est associe une altration de la prsentation antignique et la perte de lymphocytes T CD4+ spcifiques des antignes. Lautophagie est un processus catabolique universel impliqu dans la rgulation de la prsentation antignique subsquente la neutralisation/destruction du pathogne. Des tudes rcentes suggrent que le VIH-1 altre le mcanisme dautophagie afin dassurer sa survie. Le premier volet de ce projet de matrise a vis la caractrisation des effets du VIH-1 sur lautophagie dans les DCs drives de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et lidentification des stratgies thrapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spcifiques ont t de : (i) caractriser lexpression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposes au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier lexpression des protines lies la rgulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et ngative (i.e., mTOR) de lautophagie dans les MDDC exposes au VIH, (iii) dterminer le rle de lautophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer limpact de lautophagie sur la prsentation antignique par les MDDC infectes VIH-1 in vitro. Nos rsultats dmontrent quune exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altre dramatiquement leur maturation et leur habilet induire la prolifration des cellules T autologues en rponse Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la rponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous dmontrons que lexposition des MDDC au VIH sassocie une augmentation de lexpression de la protine mTOR totale et de sa forme phosphoryle (phospho-mTOR) et de la protine p62. Le traitement des MDDC la rapamycine diminue lexpression de mTOR et rduit la capacit de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogne. En effet, nous observons que la rapamycine rduit lexpression de CD83 par les MDDC et augmente lexpression de CCR7, indiquant ainsi que leffet immunosuppresseur document de la rapamycine est associ une dfaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche sest intress la contribution des cellules mylodes la persistance virale chez les sujets infects par le VIH-1 sous thrapie antirtrovirale. Les objectifs spcifiques ont t : (i) dvaluer la prsence de diffrentes formes dADN viral dans les monocytes circulants de patients infects par le VIH-1 et (ii) de mesurer lintgration et la rplication virale dans des macrophages drivs de monocytes (MDM) de patients infects sous ART. Nos rsultats indiquent que les monocytes portent des formes prcoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgr une charge virale plasmatique indtectable sous ART, les MDM supportent la rplication virale. Ces donnes trs prliminaires apportent des vidences en faveur de la contribution des cellules mylodes la persistance virale sous ART et reprsentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos rsultats dmontrent que le VIH-1 altre le potentiel immunogne des MDDC et que la rapamycine peut tre employe pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Nanmoins, lincapacit de la rapamycine rtablir le potentiel immunogne des MDDC incite identifier de nouvelles stratgies manipulant lautophagie pour une restauration optimale de la comptence immunitaire chez les sujets infects VIH-1. Les cellules mylodes jouent un rle primordial dans la dissmination et la persistance virale et doivent donc tre cibles par les stratgies actuelles dradication des rservoirs du VIH sous ART.
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La thrapie antirtrovirale prvient la transmission mre-enfant du VIH dans plus de 98% des cas lorsquadministre pendant la grossesse, le travail et au nouveau-n. Laccessibilit la thrapie antirtrovirale dans prs de 70% des 1,5 millions cas de grossesses VIH+ dans le monde mne la naissance de plus dun million denfants exposs non infects chaque anne. Le nombre denfants exposs non infects est la hausse ainsi que les proccupations concernant leur sant. En effet, plusieurs groupes ont signal une augmentation de la morbidit et de la mortalit chez les enfants exposs non infects. Lanalyse des donnes rtrospectives de 705 enfants exposs non infects de la cohorte mre-enfant du CMIS a rvl qu 2 mois dge, les enfants ns de mres ayant une charge virale suprieure 1,000 copies dARN / ml avaient une frquence de lymphocytes B significativement plus levs par rapport aux enfants exposs non infects ns de mres ayant une charge virale indtectable. Lobjectif de cette tude est de caractriser ces anomalies. Les lymphocytes, provenant du sang de cordon ombilical et de sang veineux obtenu 6 et 12 mois dge, ont t phnotyps par cytomtrie en flux laide des marqueurs CD3 / CD10 / CD14 / CD16 / CD19 / CD20 / CD21 / CD27 / IgM pour les lymphocytes B et CD4 / CD8 / CD3 / CCR7 / CD45RA pour les lymphocytes T. De plus, afin dtudier les capacits fonctionnelles des lymphocytes B CD19+, la rponse antigne-spcifique au vaccin antittanique a t mesure par marquage avec des ttramres fluorescents de fragment C du toxode ttanique. Nos travaux ont mis en vidence des diffrences statistiquement significatives entre les enfants exposs non-infects (ENI) ns de mres avec une charge virale dtectable comparativement ceux ns de mres avec une charge virale indtectable. la naissance, les enfants ENI ns de mres avec une charge virale dtectable avaient significativement moins de lymphocytes B totaux, plus de lymphocytes B mmoires classiques, activs, plasmablastes et lymphocytes T CD8+ mmoires centrales. 6 mois, ils avaient significativement plus de lymphocytes B nafs et significativement moins de lymphocytes T CD8+ effecteurs mmoires. 12 mois dge, ils avaient significativement plus de lymphocytes B et T CD8+ totaux; significativement moins de lymphocytes T CD4+ totaux et leurs lymphocytes T affichaient un profil significativement plus activ (plus de cellules mmoires). Lanalyse de la rponse antigne-spcifique a rvl une frquence plus lev de lymphocytes B mmoires IgM+ suggrant que les enfants ns de mres avec une virmie dtectable ont plus de mal tablir une mmoire immunitaire efficace face au vaccin antittanique. Nos donnes suggrent quil y a exposition durant le premier trimestre de grossesse la virmie maternelle et que cette exposition impacte le systme immunitaire en dveloppement du ftus. Les mcanismes sous-jacents causant ces anomalies doivent encore tre lucids et lpuisement du compartiment T la naissance et 6 mois reste tre investigu. Dans un pays industrialis o laccs aux soins est facilit, ces anomalies ont des consquences modres mais dans des pays faible et moyen revenu, les consquences peuvent tre beaucoup plus tragiques voir fatales.
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Le diabte auto-immun rsulte de la destruction des cellules bta pancratiques scrtrices dinsuline par les lymphocytes T du systme immunitaire. Il sensuit une dficience hormonale qui peut tre comble par des injections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, toutefois il demeure ce jour impossible de gurir les patients atteints de la maladie. De faon gnrale, un systme immunitaire sain reconnat une multitude dantignes diffrents et assure ainsi notre dfense lgard de diffrents pathognes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons gntiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent sactiver de faon aberrante suite la reconnaissance dantignes provenant du soi. Cest ce bris de tolrance qui mne au dveloppement de pathologies auto-immunes telles que le diabte auto-immun. Afin de limiter lauto-immunit, des mcanismes de slection stricts permettent dliminer la majorit des lymphocytes T prsentant une forte affinit envers des antignes du soi lors de leur dveloppement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes russissent toutefois chapper lapoptose et migrent en priphrie afin dy circuler en qute dun antigne spcifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mcanismes priphriques assurent le maintien de la tolrance immunitaire en faisant obstacle lactivation et la prolifration des lymphocytes T auto-ractifs. Lune des avenues afin dinhiber le dveloppement de rponses immunitaires aberrantes est la gnration de lymphocytes T rgulateurs. Ces cellules, dorigine thymique ou priphrique, peuvent arborer diffrents phnotypes et agissent via de multiples mcanismes afin dinactiver et/ou liminer les cellules impliques dans lapparition de pathologies auto-immunes. Lutilisation de modles murins transgniques a permis la mise en vidence dune population peu caractrise de lymphocytes T au potentiel rgulateur. En effet, la proportion de ces cellules T nexprimant pas les corcepteurs CD4 et CD8 (double ngatives, DN) a t inversement corrle la prdisposition lauto-immunit chez ces ii souris. Lobjectif principal de cette thse est de dmontrer la fonction immuno-rgulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs gntiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observ que les lymphocytes T DN exercent une activit cytotoxique lgard des lymphocytes B de faon spcifique lantigne, via la libration de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons tabli quun unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin dinhiber le dveloppement du diabte auto-immun chez des htes transgniques prdisposs la maladie. Le recours des souris dficientes pour lexpression du gne CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prdisposition au diabte auto-immun Idd13, qui contient le gne Sirp, a t identifi pour son rle dans la rgulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse gntique a rvl que dautres intervalles gntiques sont impliqus dans le contrle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situ en rgion proximale du chromosome 12 a t valid grce la cration de souris congniques. Grce aux rsultats prsents dans cette thse, notre comprhension de la biologie ainsi que de la rgulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la cration de thrapies cellulaires novatrices permettant de prvenir et de gurir diverses pathologies auto-immunes.
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Dans les cas de lymphopnie, les lymphocytes T rsiduels prolifrent exagrment dans un phnomne appel expansion homostatique priphrique (HPE), qui est efficace pour la rgnration des T CD8+, mais inefficace pour les T CD4+. Linterleukine-7 (IL7) est une cytokine homostatique utilise afin daugmenter les comptes lymphocytaires T des patients lymphopniques. Toutefois, la raison de lexpansion prfrentielle des lymphocytes T CD8+ par lIL7 demeure toujours inconnue. Nous montrons que cette expansion est due au fait que lIL7 induit une prolifration efficace des T CD8+ priphriques (CD8+PERI) ainsi que des migrants thymiques CD8+ (CD8+RTEs). Par contre, leffet prolifratif de lIL7 est restreint presquuniquement aux CD4+RTEs mme si les CD4+PERI survivent mieux que les CD4+RTEs. De plus faibles doses dIL7 sont ncessaires aux CD4+RTEs afin de phosphoryler STAT5 ou de prolifrer comparativement aux CD4+PERI et nous dmontrons que les contacts TCR/CMHII sont ncessaires la prolifration induite par lIL7 des CD4+RTEs en priphrie. De fait, augmenter au Flt3 ligand le nombre de cellules dendritiques priphriques dune souris donneuse, avant de transfrer ses TPERI dans des souris receveuses traites lIL7 induit une prolifration significative des CD4+PERI. Nos rsultats indiquent donc que labondance des contacts TCR/CMHII reus dans le thymus semble contrler la sensibilit lIL7 des CD4+RTEs. Finalement, lobservation que les CD8+PERI et CD8+RTEs prolifrent pareillement pendant la thrapie lIL7, alors que la prolifration des T CD4+ est largement restreinte aux RTEs expliquerait pourquoi, dans les cas de lymphopnie, la rgnration des T CD4+ est aussi dpendante de la thymopose.
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Une petite population de lymphocytes T exprimant les deux corcepteurs CD4 et CD8 et appele double positive (DP), a t dtecte dans le sang priphrique de donneurs sains et de patients atteints de diverses pathologies dont la sclrose en plaques (SEP). Nous avons mis lhypothse quil sagissait de lymphocytes T hautement activs pouvant contribuer linflammation chronique prsente dans la SEP. Nous avons compar les cellules T DP obtenues du sang de donneurs sains et de patients atteints de la SEP et non traits. La frquence des cellules DP tait similaire chez les patients et les donneurs sains. La proportion de lymphocytes T DP qui exprimaient les chaines du rcepteur de linterleukine-15 (IL-15) tait plus leve que pour les autres populations lymphocytaires. Des mesures dinduction de la phosphorylation du STAT5 (signal transducer and activator of transcription) ont dmontr que les cellules DP ont rpondu des doses plus faibles et pour de plus longues priodes lIL-15 comparativement aux autres lymphocytes T. Le pourcentage de lymphocytes T DP ayant la capacit de produire linterfron-gamma et des enzymes lytiques tait lev chez les tmoins sains mais ces niveaux taient significativement rduits chez les patients atteints de la SEP. La caractrisation phnotypique de cellules DP a suggr que ces cellules ont des proprits similaires aux lymphocytes T activs. Bien quil ne sagisse que dune caractrisation partielle, il semble que les lymphocytes T DP perdent une partie de leurs proprits chez les patients atteints de la SEP.
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Mmoire numris par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Although they are considered as antigen presenting cells (APC), the role of antigen-unspecific B-lymphocytes in antigen presentation and T lymphocyte stimulation remains controversial. In this paper, we tested the capacity of normal human peripheral activated B cells to stimulate T cells using melanoma antigens or melanoma cell lysates. B lymphocytes activated through CD40 ligation and then pulsed with tumor antigens efficiently processed and presented MHC class II restricted peptides to specific CD4+ T cell clones. This suggests that CD40-activated B cells have the functional and molecular competence to present MHC class II epitopes when pulsed with exogenous antigens, thereby making them a relevant source of APC to generate T cells. To test this hypothesis, CD40-activated B cells were pulsed with a lysate prepared from melanoma cells and used to stimulate peripheral autologous T cells. Interestingly, T cells specific to melanoma antigens were generated. Further analysis of these T cell clones revealed that they recognized MHC class II restricted epitopes from tyrosinase, a known melanoma tumor antigen. The efficient antigen presentation by antigen-unspecific activated B cells was correlated with a down-regulation in the expression of HLA-DO, a B cell specific protein known to interfere with HLA-DM function. Because HLA-DM is important in MHC class II peptide loading, the observed decrease in HLA-DO may partially explain the enhanced antigen presentation following B-cell activation. Results globally suggest that when they are properly activated, antigen-unspecific B-lymphocytes can present exogenous antigens by MHC class II molecules and stimulate peripheral antigen-specific T cells. Antigen presentation by activated B cells could be exploited for immunotherapy by allowing the in vitro generation of T cells specific against antigens expressed by tumors or viruses.
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Affiliation: Dpartement de microbiologie et immunologie, Facult de mdecine, Universit de Montral & Institut de Recherches Cliniques de Montral
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Les voies de signalisation des MAP kinases (MAPK) conventionnelles jouent des rles essentiels pendant le dveloppement des lymphocytes T (LT) ainsi que lors de leur activation suite la reconnaissance antignique. En raison de ses diffrences structurelles ainsi que de son mode de rgulation, ERK3 fait partie des MAPK dites non-conventionnelles. Encore aujourdhui, les vnements menant lactivation de ERK3, ses substrats ou partenaires ainsi que sa fonction physiologique demeurent peu caractriss. Nous avons entrepris dans cette thse dtudier le rle de ERK3 lors du dveloppement et de lactivation des LT en utilisant un modle de souris dficient pour lexpression de ERK3. Nous avons premirement tabli que ERK3 est exprime chez les thymocytes. Ensuite, nous avons valu le dveloppement thymique chez la souris ERK3-dficiente et nous avons observ une diminution significative de la cellularit aux tapes DN1, DP et SP CD4+ du dveloppement des LT. La cration de chimres hmatopotiques ERK3-dficientes nous a permis de dmontrer que la diminution du nombre de cellules observe aux tapes DN1 et DP est autonome aux thymocytes alors que le phnotype observ ltape SP CD4+ est dpendant de labolition simultane de ERK3 dans lpithlium thymique et dans les thymocytes. Une tude plus approfondie de ltape DP nous a permis de dmontrer quen absence de ERK3, les cellules DP meurent plus abondamment et accumulent des cassures doubles brins (DSB) dans leur ADN. De plus, nous avons dmontr que ces cassures dans lADN sont ralises par les enzymes RAG et quen absence de ces dernires, la cellularit thymique est presque rtablie chez la souris ERK3-dficiente. Ces rsultats suggrent que ERK3 est implique dans un mcanisme essentiel la rgulation des DSB pendant le rarrangement V(D)J de la chane du rcepteur des cellules T (RCT). Dans le deuxime article prsent dans cette thse, nous avons montr que ERK3 est exprim chez les LT priphriques, mais seulement suite leur activation via le RCT. Une fois activs in vitro les LT ERK3-dficients prsentent une diminution marque de leur prolifration et dans la production de cytokines. De plus, les LT ERK3-dficients survivent de faon quivalente aux LT normaux, mais tonnamment, ils expriment des niveaux plus faibles de la molcule anti-apoptotique Bcl-2. Ces rsultats suggrent que la prolifration rduite des LT ERK3-dficients est la consquence dune altration majeure de leur activation. Ainsi, nos rsultats tablissent que ERK3 est une MAPK qui joue des rles essentiels et uniques dans le dveloppement thymique et dans lactivation des lymphocytes T priphriques. Grce ces travaux, nous attribuons pour la toute premire fois une fonction in vivo pour ERK3 au cours de deux diffrentes tapes de la vie dun LT.
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Les cytokines jouent un rle fondamental dans la rgulation des processus biologiques via la cascade de signalisation JAK-STAT. Les Suppressors of Cytokine Signalling (SOCS), protines intracellulaires, inhibent la voie JAK-STAT. Plusieurs tudes supportent leur implication dans des maladies immunitaires, mais peu dinformations sont disponibles sur leur expression par les lymphocytes T humains. Nous postulons que les cytokines Interfron-(IFN-) et Interleukine-27 (IL-27), dotes dun potentiel immuno-rgulateur, ont des rles bnfiques via linduction des SOCS. Limpact de lIFN- et lIL-27 sur lexpression des SOCS-1 et SOCS-3 par des cellules T CD8 et CD4 humaines a t tudi en utilisant des cellules sanguines de donneurs sains. Lexpression de ces rgulateurs a t value aux niveaux de lARNm par qRT-PCR et protique par immunocytochimie. Les SOCS-1 et SOCS-3 ont t rapidement induits en ARNm dans les deux types cellulaires en rponse lIFN- ou lIL-27 et une augmentation de lexpression a t confirme au niveau protique. Afin de mimer les thrapies base dIFN-, les cellules T ont t exposes chroniquement lIFN-. Aprs chaque ajout de cytokine les cellules T ont augment lexpression du SOCS-1, sans moduler le SOCS-3. LIL-27 a induit les SOCS-1 et SOCS-3 prfrentiellement dans les cellules T CD8 ; ceci corrle avec des rsultats du laboratoire dmontrant une plus petite expression des rcepteurs lIL-27 par les lymphocytes T CD4 que les CD8. Notre projet a permis dlucider lexpression des SOCS dans deux populations de cellules T et de clarifier les mcanismes dactions de lIFN- et lIL-27.
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Suite la rencontre dun antigne (Ag) prsent la surface des cellules prsentatrice de lAg (CPA), les lymphocytes T nafs, ayant un rcepteur des cellules T (RCT) spcifique de lAg, vont prolifrer et se diffrencier en LT effecteurs (1). Suite llimination de lAg la majorit des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se diffrencier en LT mmoire (LTm) protgeant lorganisme long terme. Les mcanismes qui permettent la diffrenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont gnrs partir des LTe, nous avons mis lhypothse que la densit de lAg prsent par les CPA peut avoir un impact sur la slection des LT CD8+ rpondant lAg se diffrencier en LTm. De manire intressante, nos rsultats montrent quune immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide sa surface permet le dveloppement de LTm. linverse, le dveloppement des LTm est fortement rduit (10-20X) lorsque les souris sont immunises avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide leur surface. De plus, la quantit dAg na aucune influence ni sur lexpansion des LT CD8+ ni sur lacquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manire critique la gnration des LTm. Nos rsultats suggrent que le nombre de RCT engag lors de la reconnaissance de lAg est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observ par vido-microscopie le temps dinteraction entre des LTn et des DCs. Nos rsultats montrent que le temps et la qualit de linteraction sont dpendants de la densit dAg prsent par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolonge avec les DCs quand le niveau dAg est faible. De plus, nous observons des variations de lexpression des facteurs de transcription clefs impliqus dans la diffrenciation des LTm tels quEomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densit dAg fait varier lexpression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqu dans la conversion de Bcl-2 en molcule pro-apoptotique et contribue la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modle propose que la densit de lpitope contrle la gnration des CD8+ LTm. Une meilleure comprhension des mcanismes impliqus dans la gnration des LTm permettra le dveloppement de meilleures stratgies pour la gnration de vaccin. Dans un second temps, nous avons valu le rle du signal RCT dans lhomostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilis un modle de souris transgnique pour le RCT dont son expression peut tre module par un traitement la ttracycline. Ce systme nous a permis dabolir lexpression du RCT la surface des LTm. De manire intressante, en absence de RCT exprim, les LTm CD8+ peuvent survivre long terme dans lorganisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacit de survivre sans RCT exprim dans un hte lymphopnique alors que lautre sous population ncessite lexpression du RCT.
Resumo:
Les chimiokines et leurs rcepteurs respectifs jouent un rle important dans limmunit inne et adaptative. Les rcepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spcifiques et fonctionnalit distincte du point de vue de la spcificit antignique et de la production de cytokines. Lidentit de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus rsistantes linfection par le virus de limmunodficience humaine (VIH) reste mal dfinie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales dun excs de cellules T effectrices (CD8+) compar aux cellules cibles (CD4+) reprsente un bon pronostic de linfection par le virus de limmunodficience simienne (VIS), tandis que la dpltion des cellules Th17 dans les tissus lymphodes associs au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de linfection VIH. Leffet rgulateur des chimiokines sur lactivation de la rplication virale dans diffrentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu tudi. Ce projet de matrise est divis en 3 parties: (1) lidentification des rcepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilit distincte linfection par le VIH; (2) la caractrisation phnotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spcifiques au VIH de sujets progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur lactivation cellulaire et la rplication virale in vitro. Nos rsultats dmontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives linfection par le VIH. Nous proposons galement de nouveaux corrlats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spcifiques au VIH via lintgrine 7, (ii) le ratio lev entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spcifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacit des cellules T CD4+ et CD8+ spcifiques au VIH produire des ligands de CCR5 bloquant lentre virale. Finalement, nos rsultats sur leffet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposs sur la rplication virale dmontrent limplication du rseau des chimiokines dans la rgulation de la pathogense de linfection VIH.
Resumo:
La raction du greffon contre lhte (GvH) est responsable dun grand taux de morbidit et de mortalit chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogniques. Dans ce contexte, les cellules T rgulatrices sont largement tudies et semblent avoir un grand potentiel dutilisation dans le domaine de la thrapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T rgulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCR+ Doubles-Ngatifs (DN), qui ne reprsentent que 1-3% des lymphocytes T, ont t dcrits. Ces cellules ont des proprits inhibitrices de la rponse immunitaire qui savrent spcifiques aux antignes auxquels elles ont pralablement t exposes. La rpression de la rponse immunitaire par les cellules T DN rgulatrices semble tre un mcanisme important impliqu dans linduction de la tolrance aux allo-antignes. De plus, ces cellules confrent une tolrance immunitaire dans des modles de greffes allogniques et xnogniques. En effet, ces cellules ont la capacit dinhiber la raction contre un allo-antigne auquel elles ont t exposes, sans inhiber la raction contre un allo-antigne inconnu. Les cellules T DN ont t isoles et caractrises chez lhomme o elles ont la capacit dinteragir avec des cellules prsentatrices dantignes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacit immunomodulatrice reste inconnue chez lhumain. Notre objectif consistait donc principalement tudier le rle et le mcanisme daction des cellules T DN rgulatrices humaines in vitro, en tudiant leur capacit inhiber une raction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montr que les cellules T DN stimules par un allo-antigne donn inhibent des cellules syngniques effectrices diriges contre ce mme alloantigne mais ninhibent pas des cellules syngniques effectrices diriges contre un autre alloantigne, dmontrant ainsi la spcificit aux antignes de ces cellules. De plus, les T DN non stimules par un allo-antigne nont pas de rle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous nobservons pas de modulation de lexpression des marqueurs dactivation et dinduction de lapoptose. Afin dtudier le mcanisme daction des cellules T DN, nous avons mesur lexpression intracellulaire de la granzyme B. Les rsultats dmontrent que les cellules T DN stimules expriment un niveau significativement plus lev de granzyme B que les cellules T DN non-stimules par lallo-antigne. Ceci suggre que limmunosuppression induite par les cellules T DN stimules pourrait passer par la voie granzyme B. Le mcanisme utilis par ces cellules reste tre confirm par nos futures expriences.
