8 resultados para Ca2 Transient
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Le rseau neuronal de lhippocampe joue un rle central dans la mmoire en modifiant de faon durable lefficacit de ses synapses. Dans les interneurones de la couche oriens/alveus (O/A), linduction de la potentialisation long terme (PLT) requiert les courants postsynaptiques excitateurs voqus par les rcepteurs mtabotropes du glutamate de sous-type 1a (CPSEmGluR1a) et lentre subsquente de Ca2+ via des canaux de la famille des transient receptor potential (TRP). Le but de ce projet tait didentifier les canaux TRP responsables des CPSEmGluR1a et dexplorer les mcanismes molculaires rgulant leur ouverture. Nous avons dtermin par des enregistrements lectrophysiologiques que les CPSEmGluR1a taient spcifiques aux interneurones O/A et quils taient indpendants de la phospholipase C. Nous avons ensuite examin lexpression des TRPC et leur interaction avec mGluR1a par les techniques de RT-PCR, dimmunofluorescence et de co-immunoprcipitation. Nos rsultats montrent que TRPC1 et mGluR1a sassocient dans lhippocampe et que ces deux protines sont prsentes dans les dendrites des interneurones O/A. En revanche, TRPC4 ne semble sassocier mGluR1a quen systme recombinant et leur colocalisation parat limite au corps cellulaire. Finalement, nous avons procd des enregistrements dinterneurones dans lesquels lexpression des TRPC a t slectivement supprime par la transfection dARN interfrant et avons ainsi dmontr que TRPC1, mais non TRPC4, est une sous-unit obligatoire du canal responsable des CPSEmGluR1a. Ces travaux ont permis de mieux comprendre les mcanismes molculaires la base de la transmission synaptique des interneurones O/A et de mettre en vidence un rle potentiel de TRPC1 dans la PLT.
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Differentes tudes ont montr que la sensibilit au Ca2+ du canal KCa3.1, un canal potassique indpendant du voltage, tait confre par la protine calmoduline (CaM) lie de faon constitutive au canal. Cette liaison impliquerait la rgion C-lobe de la CaM et un domaine de $\ikca$ directement reli au segment transmembranaire S6 du canal. La CaM pourrait galment se lier au canal de faon Ca2+ dpendante via une interaction entre un domaine de KCa3.1 du C-terminal (CaMBD2) et la rgion N-lobe de la CaM. Une tude fut entreprise afin de dterminer la nature des rsidus responsables de la liaison entre le domaine CaMBD2 de KCa3.1 et la rgion N-lobe de la CaM et leur rle dans le processus d'ouverture du canal par le Ca2+. Une structure 3D du complexe KCa3.1/CaM a d'abord t gnre par modlisation par homologie avec le logiciel MODELLER en utilisant comme rfrence la structure cristalline du complexe SK2.2/CaM (PDB: 1G4Y). Le modle ainsi obtenu de KCa3.1 plus CaM prvoit que le segment L361-S372 dans KCa3.1 devrait tre responsable de la liaison dpendante du Ca2+ du canal avec la rgion N-lobe de la CaM via les rsidus L361 et Q364 de KCa3.1 et E45, E47 et D50 de la CaM. Pour tester ce modle, les rsidus dans le segment L361-S372 ont t muts en Cys et l'action du MTSET+ (charg positivement) et MTSACE (neutre) a t mesure sur l'activit du canal. Des enregistrements en patch clamp en configuration ``inside-out`` ont montr que la liaison du ractif charg MTSET+ au le mutant Q364C entrane une forte augmentation du courant, un effet non observ avec le MTSACE. De plus les mutations E45A et E47A dans la CaM, ont empch l'augmentation du courant initi par MTSET+ sur le mutant Q364C. Une analyse en canal unitaire a confirm que la liaison MTSET+ Q364C cause une augmentation de la probabilit d'ouverture de KCa3.1 par une dstabilisation de l'tat ferm du canal. Nous concluons que nos rsultats sont compatibles avec la formation de liaisons ioniques entre les complexes chargs positivement Cys-MTSET+ la position 364 de KCa3.1 et les rsidus chargs ngativement E45 et E47 dans la CaM. Ces donnes confirment qu'une stabilisation lectrostatique des interactions CaM/KCa3.1 peut conduire une augmentation de la probabilit d'ouverture du canal en conditions de concentrations saturantes de Ca2+.
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Les cellules beta pancratiques scrtent linsuline lors dune augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrl par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. Dautres sources dnergie, comme les acides amins (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la scrtion dinsuline. Une scrtion dinsuline insuffisante au besoin du corps dclanche le diabte. Le rle que joue laugmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la scrtion dinsuline est bien connu. Bien que le mcanisme exact de la potentialisation de la scrtion dinsuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycrolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont t reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la scrtion dinsuline. Le diacylglycrol, provenant de la lipolyse, a t propos comme un signal lipidique important damplification. Cependant, lhydrolyse des triglycrides et des diacylglycrides a t dmontre essentielle pour la scrtion dinsuline stimule par le glucose, en suggrant un rle du monoacylglycrol (MAG) dans ce processus. Dans cette tude, on dmontre que la rduction de la scrtion dinsuline stimule par le glucose, lors dune inhibition de la lipolyse, est restaure par laddition de MAG. Dans les cellules beta pancratiques, le niveau de MAG augmente en prsence des concentrations leves du glucose, et galement lorsquon inhibe lenzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec linhibiteur spcifique WWL70. Lanalyse lipidomique a dmontr quaprs la stimulation des cellules beta pancratiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, lespce la plus accumule de MAG tait le 1-stearoylglycrol (1-SG). Laddition de 1-SG, de 1-palmitoylglycrol (1-PG) ou de WWL70 augmente la scrtion dinsuline stimule par le glucose, et cette augmentation est indpendante de la gnration de acides gras partir de MAG. Cela suggre que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la scrtion dinsuline stimule par le glucose. De plus, la surexpression du gne dABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une rduction de la scrtion dinsuline, due probablement la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mcanisme molculaire impliqu dans la potentialisation de la scrtion dinsuline par le MAG, on a bloqu laction du rcepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par lagent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancratique par AMG9810 entrane une diminution de la potentialisation de la scrtion de linsuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entranerai lentre du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de lexocytose des granules insuline. En soutien de cette hypothse, on a trouv une diminution du calcium intracellulaire lorsquon traite au AMG9810 des cellules beta pancratique de rat (provenant des lots disperss) stimules au glucose et au WWL70. Lensemble des rsultats suggre que le MAG est un mdiateur de la potentialisation lipidique de la scrtion dinsuline stimule par le glucose. Vu que linhibition pharmacologique dABHD6 augmente la scrtion dinsuline, on pourra conclure que cette enzyme reprsente une cible thrapeutique potentielle dans le dveloppement des mdicaments anti-diabtiques, visant une augmentation de la scrtion dinsuline.
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UNE EXPOSITION NONATALE LOXYGNE MNE DES MODIFICATIONS DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ LE RAT ADULTE Introduction: Lexposition loxygne (O2) des ratons nouveau-ns a des consquences lge adulte dont une hypertension artrielle (HTA), une dysfonction vasculaire, une nphropnie et des indices de stress oxydant. En considrant que les reins sont encore en dveloppement actif lors des premiers jours aprs la naissance chez les rats, jouent un rle cl dans le dveloppement de lhypertension et quune dysfonction mitochondriale est associ une augmentation du stress oxydant, nous postulons que les conditions dltres nonatales peuvent avoir un impact significatif au niveau rnal sur la modulation de lexpression de protines cls du fonctionnement mitochondrial et une production mitochondriale excessive despces ractives de l O2. Mthodes: Des ratons Sprague-Dawley sont exposs 80% dO2 (H) ou 21% O2 (Ctrl) du 3e au 10e jr de vie. En considrant que plusieurs organes des rats sont encore en dveloppement actif la naissance, ces rongeurs sont un modle reconnu pour tudier les complications dune hyperoxie nonatale, comme celles lies une naissance prmature chez lhomme. 4 et 16 semaines, les reins sont prlevs et les mitochondries sont extraites suivant une mthode dextraction standard, avec un tampon contenant du sucrose 0.32 M et diffrentes centrifugations. Lexpression des protines mitochondriales a t mesure par Western blot, tandis que la production d H202 et les activits des enzymes cls du cycle de Krebs ont t values par spectrophotomtrie. Les rsultats sont exprims par la moyenne SD. Rsultats: Les rats mles H de 16 semaines (n=6) prsentent une activit de citrate synthase (considr standard interne de lexpression protique et de labondance mitochondriales) augmente (12.4 8.4 vs 4.1 0.5 mole/mL/min), une diminution de lactivit daconitase (enzyme sensible au redox mitochondrial) (0.11 0.05 vs 0.20 0.04 moles/min/mg mitochondrie), ainsi quune augmentation dans la production de H202 (7.0 1.3 vs 5.4 0.8 moles/mg protines mitochondriales) comparativement au groupe Ctrl (n=6 mles et 4 femelles). Le groupe H (vs Ctrl) prsente galement une diminution dans lexpression de peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.610.06 vs. Ctrl 0.780.02 unit relative, -23%; p<0.05), une protine implique dans llimination d H202, de lexpression du cytochrome C oxidase (Complexe IV) (H 1.020.04 vs. Ctrl 1.200.02 unit relative, -15%; p<0.05), une protine de la chaine de respiration mitochondriale, tandis que lexpression de la protine de dcouplage (uncoupling protein)-2 (UCP2), implique dans la dispersion du gradient proton, est significativement augmente (H 1.050.02 vs. Ctrl 0.900.03 unit relative, +17%; p<0.05). Les femelles H (n=6) (vs Ctrl, n=6) de 16 semaines dmontrent une augmentation significative de lactivit de laconitase (0.330.03 vs 0.170.02 moles/min/mg mitochondrie), de lexpression de lATP synthase sous unit (H 0.730.02 vs. Ctrl 0.590.02 unit relative, +25%; p<0.05) et de lexpression de MnSOD (H 0.890.02 vs. Ctrl 0.740.03 unit relative, +20%; p<0.05) (superoxide dismutase mitochondriale, important antioxidant), tandis que lexpression de Prx3 est significativement rduite (H 1.10.07 vs. Ctrl 0.850.01 unit relative, -24%; p<0.05). 4 semaines, les mles H (vs Ctrl) prsentent une augmentation significative de lexpression de Prx3 (H 0.720.03 vs. Ctrl 0.560.04 unit relative, +31%; p<0.05) et les femelles prsentent une augmentation significative de lexpression dUCP2 (H 1.220.05 vs. Ctrl 1.030.04 unit relative, +18%; p<0.05) et de lexpression de MnSOD (H 1.360.01 vs. 1.190.06 unit relative, +14%; p<0.05). Conclusions: Une exposition nonatale lO2 chez le rat adulte mne des indices de dysfonction mitochondriale dans les reins adultes, associe une augmentation dans la production despces ractives de loxygne, suggrant que ces modifications mitochondriales pourraient jouer un rle dans lhypertension artrielle et dun stress oxydant, et par consquent, tre un facteur possible dans la progression vers des maladies cardiovasculaires. Mots-cls: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygne, Stress Oxydant, Programmation
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Hyperammonemia is a key factor in the pathogenesis of hepatic encephalopathy (HE) as well as other metabolic encephalopathies, such as those associated with inherited disorders of urea cycle enzymes and in Reye's syndrome. Acute HE results in increased brain ammonia (up to 5 mM), astrocytic swelling, and altered glutamatergic function. In the present study, using fluorescence imaging techniques, acute exposure (10 min) of ammonia (NH4+/NH3) to cultured astrocytes resulted in a concentration-dependent, transient increase in [Ca2+]i. This calcium transient was due to release from intracellular calcium stores, since the response was thapsigargin-sensitive and was still observed in calcium-free buffer. Using an enzyme-linked fluorescence assay, glutamate release was measured indirectly via the production of NADH (a naturally fluorescent product when excited with UV light). NH4+/NH3 (5 mM) stimulated a calcium-dependent glutamate release from cultured astrocytes, which was inhibited after preincubation with 1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid acetoxymethyl ester but unaffected after preincubation with glutamate transport inhibitors dihydrokainate and DL-threo-beta-benzyloxyaspartate. NH4+/NH3 (5 mM) also induced a transient intracellular alkaline shift. To investigate whether the effects of NH4+/NH3 were mediated by an increase in pH(i), we applied trimethylamine (TMA+/TMA) as another weak base. TMA+/TMA (5 mM) induced a similar transient increase in both pH(i) and [Ca2+]i (mobilization from intracellular calcium stores) and resulted in calcium-dependent release of glutamate. These results indicate that an acute exposure to ammonia, resulting in cytosolic alkalinization, leads to calcium-dependent glutamate release from astrocytes. A deregulation of glutamate release from astrocytes by ammonia could contribute to glutamate dysfunction consistently observed in acute HE.
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Le tamoxifne, un modulateur slectif des rcepteurs oestrogniques, est un mdicament largement utilis depuis plus de vingt ans pour le traitement et la prvention du cancer du sein. Plusieurs tudes ont rapport que ladministration aigu du tamoxifne pouvait rduire certains courants K+ cardiaques. Cette observation suggre que les femmes traites de faon chronique avec le tamoxifne risquent davoir une prolongation de leur intervalle QT, favorisant ainsi le dveloppement de torsades de pointes. Puisque in vivo, le tamoxifne est largement mtabolis et son effet est attribu celui du 4hydroxy-tamoxifne (4OH-tamoxifne), nous avons d'abord vrifi si les effets du tamoxifne sur la repolarisation pouvaient tre dus au 4OH-tamoxifne. l'aide de la mthode de patch-clamp, nous avons tudi leffet aigu du 4OH-tamoxifne sur les courants K+ prsents au niveau ventriculaire chez la souris femelle. En premier lieu, nous avons dmontr que les souris traites avec le 4OH-tamoxifne prsentaient une diminution des courants K+ comparativement aux souris intactes. Fait intressant, le prtraitement des myocytes avec lantagoniste des rcepteurs oestrogniques, le ICI 182,780, ou linhibiteur de la synthse protique, l'actinomycine D, na pas modifi les effets du 4OH-tamoxifne. Ces rsultats suggraient que les effets du 4OH-tamoxifne sur les courants potassiques ne soient pas lis la transcription gnomique et nimplique pas les rcepteurs aux strognes. Bien que ladministration aigu du 4OH-tamoxifne diminue les courants K+ cardiaques, labsence de troubles au niveau du rythme cardiaque chez les femmes traites long terme exclu la possibilit de conclure que le traitement chronique avec le tamoxifne augmente la dure de lintervalle QT. L'accs des souris femelles et des cobayes nous a permis de dmontrer que contrairement au traitement en aigu, les courants et les canaux K+ cardiaques sont augments en chronique. Les oestrognes associs une diminution des courants K+ dune part et nos rsultats obtenus avec le tamoxifne dautre part suggrent quen bloquant les rcepteurs oestrogniques, le tamoxifne puisse prvenir les effets inhibiteurs des oestrognes sur les courants K+. Cette association strognes- tamoxifne- rcepteurs oestrogniques et courants K+ nous a encourages approfondir encore nos tudes et vrifier linfluence des hormones sexuelles fminines sur la repolarisation ventriculaire. Une troisime tude a t ainsi ralise chez des souris femelles ovariectomises et des souris dficientes en rcepteurs oestrogniques ou afin de vrifier le rle des oestrognes et des rcepteurs oestrogniques sur la repolarisation ventriculaire. Nos rsultats ont rvl clairement que labsence des oestrognes entrane une augmentation de la densit du courant K+ transitoire indpendant du Ca2+ (Ito) et de lexpression du canal Kv4.3 et ces effets sont mdis par les RE. Ces donnes soutiennent davantage notre conclusion que linhibition des rcepteurs oestrogniques est responsable de laugmentation des courants/canaux K+ et suggrent fortement quils jouent un rle dans la rgulation de la repolarisation ventriculaire. Elles soulignent aussi l'importance de vrifier le statut hormonal des animaux utiliss pour des tudes touchant l'lectrophysiologie cardiaque. Dans la dernire partie de cette thse nous avons vrifi les effets de la grossesse et du systme nerveux autonome sur les diffrents paramtres lectrocardiographiques et plus particulirement sur le rythme cardiaque chez la souris. Nos donnes ont montr que, comme chez la femme enceinte, la grossesse est associe une augmentation du rythme cardiaque. De plus, l'augmentation des niveaux des hormones fminines pourrait affecter lautomatisme et lactivit lectrique cardiaque. Ces diffrentes tudes ont augment les connaissances sur la rgulation hormonale de l'lectrophysiologie cardiaque et aideront aux avancements des recherches chez les femmes.
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Mammalian reoviruses exhibit a large host range and infected cells are generally killed; however, most studies examined only a few cell types and host species, and are probably not representative of all possible interactions between virus and host cell. Many questions thus remain concerning the nature of cellular factors that affect viral replication and cell death. In the present work, it was observed that replication of the classical mammalian reovirus serotype 3 Dearing in a bat epithelial cell line, Tb1.Lu, does not result in cell lysis and is rapidly reduced to very low levels. Prior uncoating of virions by chymotrypsin treatment, to generate infectious subviral particles, increased the initial level of infection but without any significant effect on further viral replication or cell survival. Infected cells remain resistant to virus reinfection and secrete an antiviral factor, most likely interferon, that is protective against the unrelated encephalomyocarditis virus. Although, the transformed status of a cell is believed to promote reovirus replication and viral oncolysis, resistant Tb1.Lu cells exhibit a classical phenotype of transformed cells by forming colonies in semisolid soft agar medium. Further transduction of Tb.Lu cells with a constitutively-active Ras oncogene does not seem cell growth or reovirus effect on these cells. Infected Tb1.Lu cells can produce low-level of infectious virus for a long time without any apparent effect, although these cells are resistant to reinfection. The results suggest that Tb1.Lu cells can mount an unusual antiviral response. Specific properties of bat cells may thus be in part responsible for the ability of the animals to act as reservoirs for viruses in general and for novel reoviruses in particular. Their peculiar resistance to cell lysis also makes Tb1.Lu cells an attractive model to study the cellular and viral factors that determine the ability of reovirus to replicate and destroy infected cells.
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Lendothlium vasculaire joue un rle prpondrant dans la rgulation du tonus vasculaire en gnrant loxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et les facteurs hyperpolarisants drivs de lendothlium (EDHF) comme puissants vasodilatateurs. Ces mcanismes requirent le calcium (Ca2+) divers niveaux, dmontrant limportance des dynamiques calciques endothliales. Une perturbation de lhomostasie calcique est observe dans une dysfonction endothliale lie lhypertension artrielle. Il est impratif dapprofondir nos connaissances sur les signalisations calciques endothliales impliques dans le contrle du tonus vasculaire. Des tudes rcentes ont montr quune variation locale de la concentration en Ca2+ libre intracellulaire ([Ca2+]i) est suffisante pour gnrer une rponse physiologique importante. Les pulsars calciques sont caractriss par une augmentation de [Ca2+]i spontane et transitoire spcifiquement localise au niveau des projections myoendothliales (PMEs). Ces PMEs sont des sites de communication privilgis entre les cellules endothliales (CEs) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Les pulsars calciques sont impliqus dans le mcanisme de lEDHF via lactivation des canaux potassiques Ca2+-dpendant de moyenne conductance (KCa3.1 ou IKCa). Les travaux de cette thse visent amliorer nos connaissances sur les signalisations calciques locales en caractrisant une nouvelle voie de signalisation pouvant tre implique dans la rgulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Outre les canaux KCa3.1 peu dinformations sont disponibles sur les cibles sensibles aux pulsars calciques. Une premire tude a permis didentifier la protine kinase II dpendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMKII) sous ses isoformes , et dans les CEs dartres natives de souris comme une cible pouvant tre module par les pulsars calciques. Des tudes en immunofluorescence ont permis dobserver la localisation particulire de CaMKII endothliale dans les PMEs, les sites des pulsars calciques. Une stimulation spcifique des pulsars calciques par la phnylphrine (PE) engendre un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Sachant que CaMKII active loxyde nitrique synthase endothliale (NOS3), nous avons valu limpact dune stimulation des pulsars calciques sur la production de NO en prsence dun inhibiteur de CaMKII, le KN-93. Nous avons dmontr que la production de NO est en partie dpendante de lactivation de CaMKII par les pulsars calciques. En utilisant un modle dhypertension induite par linfusion chronique de PE, nous avons permis de mettre en vidence une perturbation dans la relation entre les pulsars calciques et CaMKII. Dans une seconde tude nous avons tabli deux modles (normo- et hypertendus) dinfusion chronique langiotensine II (AngII) afin valuer limpact des ROS et de lhypertension sur la voie de signalisation pulsars/CaMKII/NO. Nos rsultats ont montr une augmentation des pulsars calciques accompagne dun recrutement de CaMKII dans les PMEs. Une stimulation aigue lAngII suggre que les ROS modulent les dynamiques calciques et que lAngII stimule la production de NO. Cette tude propose que ces voies de signalisations impliquent les rcepteurs de type 1 et 2 lAngII (AT1 et AT2). Ltude des pulsars calciques dpend fortement de la structure native des artres qui permet de conserver la formation des PMEs. La dernire tude prsente dans cette thse a permis dtablir une relation entre les PMEs et les pulsars calciques dans trois lits vasculaires distincts (artres msentriques, pulmonaires et coronariennes). Nos rsultats ont montr que les paramtres cintiques des pulsars calciques sont fortement conservs entre les diffrents lits vasculaires. Toutefois, la frquence globale ainsi que le nombre de sites actifs des pulsars calciques diffrent avec une proportion plus leve dans les artres msentriques et coronariennes comparativement aux artres pulmonaires. Ces rsultats corrlent avec le nombre plus lev de PMEs retrouv dans les artres msentriques et coronariennes. Ces travaux suggrent que les pulsars calciques sont fondamentaux pour les artres de rsistance. Les tudes de cette thse ont men lidentification dune nouvelle voie de signalisation impliquant les pulsars calciques et CaMKII endothliale dans la stimulation de la production de NO. Cette nouvelle voie de signalisation pourrait tre implique dans la rgulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Les pulsars calciques semblent tre fortement conservs entre les diffrentes artres de rsistances et ce malgr la disparit dans les PMEs, suggrant un rle prpondrant dans la fonction vasculaire. Ces travaux ouvrent une avenue pour le dveloppement de potentielles cibles thrapeutiques pouvant contrer la dysfonction endothliale associe lhypertension artrielle.
