15 resultados para Ca2 Channels
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Les canaux calciques dpendants du voltage CaV font partie de la famille structurale des canaux ioniques 6 segments transmembranaires. Tout comme les canaux potassiques Kv, les canaux CaV possdent une srie de rsidus chargs dans lhlice S4 de chaque domaine ou sous-unit qui confrerait la protine une sensibilit aux changements de voltage. De plus les hlices S6 tapissent la paroi du pore et forment la porte dactivation de la protine. Comment le mouvement des hlices S4 se traduit par louverture de la porte dactivation des hlices S6 demeure une question encore non rsolue. Suite la publication de la structure cristalline du canal Kv1.2 en 2005, le groupe de MacKinnon a propos que le mouvement des hlices S4 est mcaniquement coupl la porte dactivation S6 travers le glissement de lhlice amphiphile S4-S5 selon un mcanisme nomm couplage lectromcanique (Long et al. 2005b). Dans le but de dterminer si la rgion S4-S5 joue un rle dans lactivation du canal calcique CaV2.3, nous avons tudi, par la mthode danalyse cyclique de mutations doubles ( Double Mutant Cycle Analysis , (Horovitz 1996)), le couplage entre la boucle S4-S5 et lhlice S6 du domaine II de ce canal. Les mesures dnergies dactivation, Gact, obtenues en prsence des sous-units auxiliaires CaV2 et CaV3 ont affich un couplage significatif pour lactivation entre les paires de rsidus V593G/L699G, V593G/A700G, V593G/A702G, S595G/V703G L596G/L699G, L596G/A700G, L596G/I701G, L596G/A702G, L596G/V703G, L596G/D704G, M597G/I701G, et S602G/I701G. Aucune de ces paires de rsidus na affich de couplage lors de linactivation, suggrant que les effets observs sont spcifiques au mcanisme dactivation. Mis ensemble, ces rsultats suggrent que la boucle IIS4-S5 et lhlice IIS6 interagissent et jouent un rle dterminant dans lactivation de CaV2.3.
Resumo:
Les canaux Ca2+ activs par le voltage (CaV) sont des protines membranaires qui gnrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite une dpolarisation membranaire. Ces complexes oligomriques sont classifis selon les proprits structurelles de la sous-unit principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unit CaV1. La sous-unit auxiliaire CaV module lexpression membranaire et la dpendance au voltage du gating de la sous-unit CaV1 des canaux HVA ( high-voltage-activated ) CaV1 et CaV2. La sous-unit CaV est forme par un domaine SH3 ( Src homology-3 ) connect un domaine GK ( guanylate kinase-like ) par le biais dun domaine variable HOOK. Dans le but didentifier les rsidus dans la CaV3 qui sont responsables de la densit membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unit auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la dltion complte du domaine SH3 ainsi que la dltion du domaine HOOK nont pas modifi la densit membranaire de CaV2.3 ni ses proprits dactivation. Cependant, la dltion de cinq rsidus dans le domaine GK interrompt lexpression membranaire et lexpression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de rsidus identifis prcdemment comme soutenant une affinit de liaison de lordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaV na pas modifi de manire significative ladressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre rsidus leucine dans les rgions 3, 6, 10 et 9 du domaine GK ont grandement rduit ladressage membranaire du canal CaV2.3. Nos rsultats confirment que le domaine GK contient les dterminants molculaires responsables de la fonction chaperone de CaV. Cela dit, ladressage membranaire induit par CaV semble tre dtermin par des lments structuraux qui ne sont pas strictement dpendants dune liaison haute affinit de CaV sur CaV1.
Resumo:
Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en rponse un dsquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolonge ou une modification de l'quilibre hormonal. Le systme rnine-angiotensine (SRA) est un systme hormonal largement tudi et il est impliqu dans de nombreuses activits associes au remodelage cardiovasculaire. Lexistence d'un systme circulatoire coupl un systme de tissus locaux est une reprsentation classique, cependant de nouvelles donnes suggrent un SRA indpendant et fonctionnellement actif l'chelle cellulaire. La comprhension de l'activit intracellulaire du SRA pourrait mener de nouvelles pistes thrapeutiques qui pourraient prvenir un remodelage cardiovasculaire dfavorable. L'objectif de cette thse tait d'lucider le rle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Rcemment, les rcepteurs coupls aux protines G (RCPG), les protines G et leurs effecteurs ont t dtects sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nuclaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'tre accepts comme une ralit. Nous avons ds lors fait l'hypothse que la signalisation du SRA dlimitant le noyau tait implique dans le contrle de l'expression des gnes cardiaques. Nous avons dmontr la prsence de rcepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nuclaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nuclaire purifie de tissu cardiaque. Des quantits d'Ang II ont t dtectes dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donn lieu des liaisons prfrentielles aux sites nuclaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthse d'ARN de novo dans des noyaux isols stimuls l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-B taient beaucoup plus importants lorsque les noyaux taient exposs de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nuclaires a engendr une mobilisation de Ca2+ via les rcepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminu la rponse transcriptionnelle. Les mthodes disponibles actuellement pour l'tude de la signalisation intracrine sont limites aux mthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thse tait de synthtiser et caractriser des analogues d'Ang-II cellule-permants afin dtudier spcifiquement dans les cellules intactes l'activit intracellulaire du SRA. Nous avons synthtis et caractris pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsule en incorporant un groupement 4,5-dimthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifis du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsule synthtiss et purifis: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montr une rduction par un facteur deux ou trois de l'affinit de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison comptitive et une activit rduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augment la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isols elle gnrait une augmentation de Ca2+ nucloplasmique et initiait la synthse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-B. Les fibroblastes sont les principaux gnrateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus ractifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons mis l'hypothse que lAng-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nuclaires associs contrlaient les profils d'expression des gnes des fibroblastes via des systmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rle majeur dans le dveloppement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqu que les fibroblastes auriculaires expriment lAT1R et lAT2R nuclaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. Lexpression d'AT1R nuclaire a t rguls positivement dans les cas dinsuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nuclaire a t glycosyl post-traductionnellement. La machinerie protique des protines G, y compris Gq/11, Gi/3, et G, a t observe dans des noyaux isols de fibroblastes. AT1R et AT2R rgulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire dclenche la libration de Ca2+ nucloplasmique, la prolifration, et la synthse et scrtion de collagne qui ne sont pas inhibes par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.
Resumo:
Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de lentree des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel daction des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomerique qui est compose de la sous-unite principale CaV1 et des sous-unites auxiliaires CaV et CaV21. CaV joue un role determinant dans ladressage membranaire de la sous-unite CaV1. CaV21 stabilise letat ouvert du canal mais le mecanisme moleculaire responsable de cette modulation na pas ete encore identifie. Nous avons recemment montre que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaV21 (Bourdin et al. 2015). CaV21 est une glycoproteine qui possede 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc evalue le role de la glycosylation de type-N dans ladressage membranaire et la stabilite de CaV21. Nous avons dabord confirme que la proteine CaV21 recombinante, telle la proteine endogene, est significativement glycosylee puisque le traitement a la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moleculaire, ce qui est compatible avec la presence de 16 sites Asn. Il sest avere par ailleurs que la mutation simultanee de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) reduire significativement la densite de surface de! CaV21 telle que mesuree par cytometrie en flux et par imagerie confocale 2) accelerer les cinetiques de degradation telle questimee apres arret de la synthese proteique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants generes par CaV1.2 telle quevaluee par la methode du patch-clamp . Les effets les plus importants ont toutefois ete obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces resultats montrent que Asn663 et a un moindre degre Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent a la biogenese et la stabilite de CaV21 et confirment que la glycosylation de type N de CaV21 est necessaire a la fonction du canal calcique cardiaque de type L.
Resumo:
Differentes tudes ont montr que la sensibilit au Ca2+ du canal KCa3.1, un canal potassique indpendant du voltage, tait confre par la protine calmoduline (CaM) lie de faon constitutive au canal. Cette liaison impliquerait la rgion C-lobe de la CaM et un domaine de $\ikca$ directement reli au segment transmembranaire S6 du canal. La CaM pourrait galment se lier au canal de faon Ca2+ dpendante via une interaction entre un domaine de KCa3.1 du C-terminal (CaMBD2) et la rgion N-lobe de la CaM. Une tude fut entreprise afin de dterminer la nature des rsidus responsables de la liaison entre le domaine CaMBD2 de KCa3.1 et la rgion N-lobe de la CaM et leur rle dans le processus d'ouverture du canal par le Ca2+. Une structure 3D du complexe KCa3.1/CaM a d'abord t gnre par modlisation par homologie avec le logiciel MODELLER en utilisant comme rfrence la structure cristalline du complexe SK2.2/CaM (PDB: 1G4Y). Le modle ainsi obtenu de KCa3.1 plus CaM prvoit que le segment L361-S372 dans KCa3.1 devrait tre responsable de la liaison dpendante du Ca2+ du canal avec la rgion N-lobe de la CaM via les rsidus L361 et Q364 de KCa3.1 et E45, E47 et D50 de la CaM. Pour tester ce modle, les rsidus dans le segment L361-S372 ont t muts en Cys et l'action du MTSET+ (charg positivement) et MTSACE (neutre) a t mesure sur l'activit du canal. Des enregistrements en patch clamp en configuration ``inside-out`` ont montr que la liaison du ractif charg MTSET+ au le mutant Q364C entrane une forte augmentation du courant, un effet non observ avec le MTSACE. De plus les mutations E45A et E47A dans la CaM, ont empch l'augmentation du courant initi par MTSET+ sur le mutant Q364C. Une analyse en canal unitaire a confirm que la liaison MTSET+ Q364C cause une augmentation de la probabilit d'ouverture de KCa3.1 par une dstabilisation de l'tat ferm du canal. Nous concluons que nos rsultats sont compatibles avec la formation de liaisons ioniques entre les complexes chargs positivement Cys-MTSET+ la position 364 de KCa3.1 et les rsidus chargs ngativement E45 et E47 dans la CaM. Ces donnes confirment qu'une stabilisation lectrostatique des interactions CaM/KCa3.1 peut conduire une augmentation de la probabilit d'ouverture du canal en conditions de concentrations saturantes de Ca2+.
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Le rseau neuronal de lhippocampe joue un rle central dans la mmoire en modifiant de faon durable lefficacit de ses synapses. Dans les interneurones de la couche oriens/alveus (O/A), linduction de la potentialisation long terme (PLT) requiert les courants postsynaptiques excitateurs voqus par les rcepteurs mtabotropes du glutamate de sous-type 1a (CPSEmGluR1a) et lentre subsquente de Ca2+ via des canaux de la famille des transient receptor potential (TRP). Le but de ce projet tait didentifier les canaux TRP responsables des CPSEmGluR1a et dexplorer les mcanismes molculaires rgulant leur ouverture. Nous avons dtermin par des enregistrements lectrophysiologiques que les CPSEmGluR1a taient spcifiques aux interneurones O/A et quils taient indpendants de la phospholipase C. Nous avons ensuite examin lexpression des TRPC et leur interaction avec mGluR1a par les techniques de RT-PCR, dimmunofluorescence et de co-immunoprcipitation. Nos rsultats montrent que TRPC1 et mGluR1a sassocient dans lhippocampe et que ces deux protines sont prsentes dans les dendrites des interneurones O/A. En revanche, TRPC4 ne semble sassocier mGluR1a quen systme recombinant et leur colocalisation parat limite au corps cellulaire. Finalement, nous avons procd des enregistrements dinterneurones dans lesquels lexpression des TRPC a t slectivement supprime par la transfection dARN interfrant et avons ainsi dmontr que TRPC1, mais non TRPC4, est une sous-unit obligatoire du canal responsable des CPSEmGluR1a. Ces travaux ont permis de mieux comprendre les mcanismes molculaires la base de la transmission synaptique des interneurones O/A et de mettre en vidence un rle potentiel de TRPC1 dans la PLT.
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Le diabte est une maladie mtabolique qui se caractrise par une rsistance linsuline des tissus priphriques et par une incapacit des cellules pancratiques scrter les niveaux dinsuline appropris afin de compenser pour cette rsistance. Pour mieux comprendre les mcanismes dficients dans les cellules des patients diabtiques, il est ncessaire de comprendre et de dfinir les mcanismes impliqus dans le contrle de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Dans les cellules pancratiques, le mtabolisme du glucose conduit la production de facteurs de couplage mtabolique, comme lATP, ncessaires la rgulation de lexocytose des vsicules dinsuline. Le mcanisme par lequel la production de lATP par le mtabolisme oxydatif du glucose dclenche lexocytose des vsicules dinsuline est bien dcrit dans la littrature. Cependant, il ne peut lui seul rguler adquatement la scrtion dinsuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage mtaboliques qui ont t suggrs afin de relier le mtabolisme du glucose la rgulation de la scrtion dinsuline. Les mcanismes impliqus demeurent cependant tre caractriss. Le but de la prsente thse tait de dterminer limplication des navettes du pyruvate, dcoulant du mtabolisme mitochondrial du glucose, dans la rgulation de la scrtion dinsuline. Dans les cellules , les navettes du pyruvate dcoulent de la combinaison des processus danaplrose et de cataplrose et permettent la transduction des signaux mtaboliques provenant du mtabolisme du glucose. Dans une premire tude, nous nous sommes intresss au rle de la navette pyruvate/citrate dans la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose, puisque cette navette conduit la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage mtabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux mtabolique travers la glycolyse en roxydation le NADH. Une tude effectue prcdemment dans notre laboratoire avait suggr la prsence de cette navette dans les cellules pancratique. Afin de tester notre hypothse, nous avons cibl trois tapes de cette navette dans la ligne cellulaire pancratique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et lactivit de lATP-citrate lyase (ACL) et lenzyme malique (MEc), deux enzymes cls de la navette pyruvate/citrate. Linhibition de chacune de ces tapes par lutilisation dun inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interfrant a corrl avec une rduction significative de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Les rsultats obtenus suggrent que la navette pyruvate/citrate joue un rle critique dans la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Paralllement notre tude, deux autres groupes de recherche ont suggr que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate taient aussi importantes pour la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Ainsi, trois navettes dcoulant du mtabolisme mitochondrial du glucose pourraient tre impliques dans le contrle de la scrtion dinsuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage mtabolique possiblement trs important pour la scrtion dinsuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est form par MEc, alors que lisocitrate dshydrognase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate. Dans notre premire tude, nous avions dmontr limportance de lexpression de ME pour la scrtion adquate dinsuline en rponse au glucose. Dans notre deuxime tude, nous avons test limplication de IDHc dans les mcanismes de rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. La diminution de lexpression de IDHc dans les INS 832/13 a stimul la scrtion dinsuline en rponse au glucose par un mcanisme indpendant de la production de lATP par le mtabolisme oxydatif du glucose. Ce rsultat a ensuite t confirm dans les cellules disperses des lots pancratiques de rat. Nous avons aussi observ dans notre modle que lincorporation du glucose en acides gras tait augmente, suggrant que la diminution de lactivit de IDHc favorise la redirection du mtabolisme de lisocitrate travers la navette pyruvate/citrate. Un mcanisme de compensation travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la scrtion dinsuline observe en rponse la diminution de lexpression de IDHc. Les travaux effectus dans cette deuxime tude remettent en question limplication de lactivit de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate, dans la transduction des signaux mtaboliques reliant le mtabolisme du glucose la scrtion dinsuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate conduire la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules . Le malonyl-CoA rgule le mtabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transfrase 1, lenzyme limitante dans loxydation des acides gras. Ainsi, llvation des niveaux de malonyl-CoA en rponse au glucose entrane une redirection du mtabolisme des acides gras vers les processus destrification puis de lipolyse. Plus prcisment, les acides gras sont mtaboliss travers le cycle des triglycrides/acides gras libres (qui combinent les voies mtaboliques destrification et de lipolyse), afin de produire des molcules lipidiques signaltiques ncessaires la modulation de la scrtion dinsuline. Des tudes effectues prcdemment dans notre laboratoire ont dmontr que lactivit lipolytique de HSL (de langlais hormone-sensitive lipase) tait importante, mais non suffisante, pour la rgulation de la scrtion dinsuline. Dans une tude complmentaire, nous nous sommes intresss au rle dune autre lipase, soit ATGL (de langlais adipose triglyceride lipase), dans la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose et aux acides gras. Nous avons dmontr que ATGL est exprim dans les cellules pancratiques et que son activit contribue significativement la lipolyse. Une rduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interfrant ou son absence dans les lots pancratiques de souris dficientes en ATGL a conduit une rduction de la scrtion dinsuline en rponse au glucose en prsence ou en absence dacides gras. Ces rsultats appuient lhypothse que la lipolyse est une composante importante de la rgulation de la scrtion dinsuline dans les cellules pancratiques. En conclusion, les rsultats obtenus dans cette thse suggrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la rgulation de la scrtion dinsuline en rponse au glucose. Ce mcanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du mtabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question limplication de la navette pyruvate/isocitrate/-ctoglutarate dans la rgulation de la scrtion dinsuline. Le rle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant tre dtermin. Finalement, nos travaux ont aussi dmontr un rle pour ATGL et la lipolyse dans les mcanismes de couplage mtabolique rgulant la scrtion dinsuline.
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Les cellules pithliales des voies ariennes respiratoires scrtent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie gntique fatale cause par des mutations de ce canal. La mutation la plus frquente en Amrique du Nord, F508, met en pril la maturation de la protine et affecte les mcanismes dactivation du canal. Au cours des dernires annes, plusieurs molcules ont t identifies par criblage haut dbit qui peuvent rtablir lactivation de protines CFTR mutes. Ces molcules sont nommes potentiateurs. Les canaux K+ basolatraux, dont KCa3.1, jouent un rle bien document dans ltablissement dune force lectromotrice favorable la scrtion de Cl- par CFTR dans les cellules pithliales des voies ariennes respiratoires. Il a par exemple t dmontr que lapplication de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 rsulte en une augmentation soutenue de la scrtion de Cl- et que cette augmentation tait rversible suite lapplication de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre dune recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considrer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractrisation lectrophysiologique par la mthode du patch clamp et structurelle via lutilisation de canaux modifis par mutagense dirige de diffrents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de dterminer laction de ces molcules sur lactivit de KCa3.1 et den tablir les mcanismes. Nous prsentons ici des rsultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possdant diffrentes structures. Un criblage des effets de ces molcules sur KCa3.1 a rvl que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos rsultats suggrent que le SF-03 pourrait agir sur une protine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montr que laccessibilit au site daction de cette v molcule est indpendante de ltat douverture de KCa3.1. Labsence deffets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molcule pourrait agir via linteraction CaM-KCa3.1 et ncessiter la prsence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos rsultats en canal unitaire indiquent quil dstabilise un tat ferm du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilit douverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinit apparente pour le Ca2+. Des expriences o CBIQ est appliqu en prsence ou en absence de Ca2+ ont indiqu que laccessibilit son site daction est indpendante de ltat douverture de KCa3.1, mais que la prsence de Ca2+ est ncessaire son action. Ces rsultats sont compatibles avec une action de CBIQ dstabilisant un tat ferm du canal. Finalement, des expriences en Ba2+ nous ont permis dinvestiguer la rgion du filtre de slectivit de KCa3.1 lors de laction de CBIQ et nos rsultats pointent vers une action de CBIQ dans cette rgion. Sur la base de nos rsultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la dstabilisation dun tat ferm du canal travers une action sur sa gate au niveau du filtre de slectivit. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montr des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protine accessoire du canal ou sur linteraction CaM-KCa3.1. Dans loptique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos rsultats indiquent que le CBIQ pourrait tre un potentiateur efficace pusiquil est capable de trimuler la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces.
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Le diabte est une maladie chronique de lhomostasie du glucose caractrise par une hyperglycmie non contrle qui est le rsultat dune dfaillance de la scrtion dinsuline en combinaison ou non avec une altration de laction de linsuline. La surnutrition et le manque dactivit physique chez des individus qui ont des prdispositions gntiques donnent lieu la rsistance linsuline. Pendant cette priode dite de compensation o la concentration dacides gras plasmatiques est leve, lhyperinsulinmie compense pleinement pour la rsistance linsuline des tissus cibles et la glycmie est normale. Le mtabolisme du glucose par la cellule pancratique bta entrane la scrtion dinsuline. Selon le modle classique de la scrtion dinsuline induite par le glucose, laugmentation du ratio ATP/ADP rsultant de la glycolyse et de loxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dpendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi dun influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet lexocytose des granules de scrtion contenant linsuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la scrtion dinsuline. Cependant, le modle classique ne permet pas dexpliquer cette potentialisation de la scrtion dinsuline par les acides gras. Pour expliquer leffet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a propos un modle complmentaire o le malonyl-CoA driv du mtabolisme anaplrotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransfrase-1, lenzyme qui constitue ltape limitante de loxydation des acides gras favorisant ainsi leur estrification et donc la formation de drivs lipidiques signaltiques. Le modle anaplrotique/lipidique de la scrtion d'insuline induite par le glucose prdit que le malonyl-CoA driv du mtabolisme du glucose inhibe la bta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilit des acyl-CoA ou des acides gras non-estrifis. Les molcules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du mtabolisme des acides gras l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux raliss par notre laboratoire ont dmontr quen augmentant la rpartition des acides gras vers la bta-oxydation, la scrtion dinsuline induite par le glucose tait rduite suggrant quun des drivs de lestrification des acides gras est important pour la potentialisation sur la scrtion dinsuline. En effet, des concentrations leves de glucose, les acides gras peuvent tre estrifis dabord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycrol (DAG) et subsquemment en triglycrides (TG). La prsente tude a tabli limportance relative du processus destrification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la scrtion dinsuline. Nous avions mis lhypothse que des molcules drives des processus destrification des acides gras (ex : lacide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux mtaboliques et sont responsables de la modulation de la scrtion dinsuline en prsence dacides gras. Afin de vrifier celle-ci, nous avons modifi le niveau dexpression des enzymes cls contrlant le processus destrification par des approches de biologie molculaire afin de changer la rpartition des acides gras dans la cellule bta. Lexpression des diffrents isoformes de la glycrol-3-phosphate acyltransfrase (GPAT), qui catalyse la premire tape destrification des acides gras a t augment et inhib. Les effets de la modulation de lexpression des isoenzymes de GPAT sur les processus destrifications, sur la bta-oxydation et sur la scrtion dinsuline induite par le glucose ont t tudis. Les diffrentes approches que nous avons utilises ont chang les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altrer la scrtion dinsuline induite par le glucose. Ainsi, les rsultats de cette tude nont pas associ de rle pour lestrification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la scrtion dinsuline. Cependant, lestrification des acides gras fait partie intgrante dun cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. Dailleurs, des tudes parallles la mienne menes par des collgues du laboratoire ont dmontr un rle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la scrtion dinsuline par les acides gras. Paralllement nos tudes des mcanismes de la scrtion dinsuline impliquant les acides gras, notre laboratoire sintresse aussi aux effets ngatifs des acides gras sur la cellule bta. La glucolipotoxicit, rsultant dune exposition chronique aux acides gras saturs en prsence dune concentration leve de glucose, est dun intrt particulier vu la prpondrance de lobsit. Lisoforme microsomal de GPAT a aussi utilis comme outil molculaire dans le contexte de la glucolipotoxicit afin dtudier le rle de la synthse de novo de lipides complexes dans le contexte de dcompensation o la fonction des cellules bta diminue. La surexpression de lisoforme microsomal de la GPAT, menant laugmentation de lestrification des acides gras et une diminution de la bta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification mtabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicit.
Resumo:
Les cellules beta pancratiques scrtent linsuline lors dune augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrl par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. Dautres sources dnergie, comme les acides amins (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la scrtion dinsuline. Une scrtion dinsuline insuffisante au besoin du corps dclanche le diabte. Le rle que joue laugmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la scrtion dinsuline est bien connu. Bien que le mcanisme exact de la potentialisation de la scrtion dinsuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycrolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont t reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la scrtion dinsuline. Le diacylglycrol, provenant de la lipolyse, a t propos comme un signal lipidique important damplification. Cependant, lhydrolyse des triglycrides et des diacylglycrides a t dmontre essentielle pour la scrtion dinsuline stimule par le glucose, en suggrant un rle du monoacylglycrol (MAG) dans ce processus. Dans cette tude, on dmontre que la rduction de la scrtion dinsuline stimule par le glucose, lors dune inhibition de la lipolyse, est restaure par laddition de MAG. Dans les cellules beta pancratiques, le niveau de MAG augmente en prsence des concentrations leves du glucose, et galement lorsquon inhibe lenzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec linhibiteur spcifique WWL70. Lanalyse lipidomique a dmontr quaprs la stimulation des cellules beta pancratiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, lespce la plus accumule de MAG tait le 1-stearoylglycrol (1-SG). Laddition de 1-SG, de 1-palmitoylglycrol (1-PG) ou de WWL70 augmente la scrtion dinsuline stimule par le glucose, et cette augmentation est indpendante de la gnration de acides gras partir de MAG. Cela suggre que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la scrtion dinsuline stimule par le glucose. De plus, la surexpression du gne dABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une rduction de la scrtion dinsuline, due probablement la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mcanisme molculaire impliqu dans la potentialisation de la scrtion dinsuline par le MAG, on a bloqu laction du rcepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par lagent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancratique par AMG9810 entrane une diminution de la potentialisation de la scrtion de linsuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entranerai lentre du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de lexocytose des granules insuline. En soutien de cette hypothse, on a trouv une diminution du calcium intracellulaire lorsquon traite au AMG9810 des cellules beta pancratique de rat (provenant des lots disperss) stimules au glucose et au WWL70. Lensemble des rsultats suggre que le MAG est un mdiateur de la potentialisation lipidique de la scrtion dinsuline stimule par le glucose. Vu que linhibition pharmacologique dABHD6 augmente la scrtion dinsuline, on pourra conclure que cette enzyme reprsente une cible thrapeutique potentielle dans le dveloppement des mdicaments anti-diabtiques, visant une augmentation de la scrtion dinsuline.
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Linflammation: Une rponse adaptative du systme immunitaire face une insulte est aujourdhui reconnue comme une composante essentielle presque toutes les maladies infectieuses ou autres stimuli nfastes, tels les dommages tissulaires incluant linfarctus du myocarde et linsuffisance cardiaque. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, linflammation se caractrise principalement par une activation long terme du systme immunitaire, menant une faible, mais chronique scrtion de peptides modulateurs, appels cytokines pro-inflammatoires. En effet, la littrature a montr plusieurs reprises que les patients souffrant darythmies et de dfaillance cardiaque prsentent des taux levs de cytokines pro-inflammatoires tels le facteur de ncrose tissulaire alpha (TNF), linterleukine 1 (IL-1) et linterleukine 6. De plus, ces patients souffrent souvent dune baisse de la capacit contractile du myocarde. Le but de notre tude tait donc de dterminer si un lien de cause effet existe entre ces phnomnes et plus spcifiquement si le TNF, lIL-1 et lIL-6 peuvent affecter les proprits lectriques et contractiles du cur en modulant le courant Ca2+ de type L (ICaL) un courant ionique qui joue un rle primordial au niveau de la phase plateau du potentiel daction ainsi quau niveau du couplage excitation-contraction. Les possibles mchansimes par lesquels ces cytokines exercent leurs effets seront aussi explors. Pour ce faire, des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveau-nes ont t mis en culture et traits 24 heures avec des concentrations pathophysiologiques (30 pg/mL) de TNF, IL-1 ou IL-6. Des enregistrements de ICaL raliss par la technique du patch-clamp en configuration cellule entire ont t obtenus par la suite et les rsultats montrent que le TNF naffecte pas ICaL, mme des concentrations plus leves (1 ng/mL). En revanche, lIL-1 rduisait de prs de 40% la densit dICaL. Afin dexaminer si le TNF et lIL-1 pouvaient avoir un effet synergique, les cardiomyocytes ont t trait avec un combinaison des deux cytokines. Toutefois aucun effet synergique sur ICaL na t constat. En outre, lIL-6 rduisait ICaL significativement, cependant la rduction de 20% tait moindre que celle induite par IL-1. Afin dlucider les mcanismes sous-jacents la rduction de ICaL aprs un traitement avec IL-1, lexpression dARNm de CaV1.2, sous-unit codante pour ICaL, a t mesure par qPCR et les rsultats obtenus montrent aucun changement du niveau dexpression. Plusieurs tudes ont montr que linflammation et le stress oxydatif vont de pair. En effet, limagerie confocale nous a permis de constater une augmentation accrue du stress oxydatif induit par IL-1 et malgr un traitement aux antioxydants, la diminution de ICaL na pas t prvenue. Cette tude montre quIL-1 et IL-6 rduisent ICaL de faon importante et ce indpendamment dune rgulation transcriptionelle ou du stress oxydatif. De nouvelles donnes prliminaires suggrent que ICaL serait rduit suite lactivation des protines kinase C mais des tudes additionelles seront ncessaires afin dtudier cette avenue. Nos rsultats pourraient contribuer expliquer les troubles du rythme et de contractilit observs chez les patients souffrant de dfaillance cardiaque.
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La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus frquemment observ en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalit. Le traitement de la FA reste un dfi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associs aux approches thrapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure comprhension des mcanismes sous-jacents la FA est essentielle pour le dveloppement de nouvelles thrapies offrant un meilleur rapport bnfice/risque pour les patients. La FA est caractrise par i) un remodelage lectrique dltre associ le plus souvent ii) un remodelage structurel du myocarde favorisant la rcurrence et le maintien de larythmie. La diminution de la priode rfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un lment clef du remodelage lectrique. Le remodelage structurel, quant lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altre la propagation de linflux lectrique dans les oreillettes. Les mcanismes molculaires impliqus dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Rcemment, le rle des microARNs (miARNs) a t point du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont t i) d'acqurir une comprhension approfondie du rle des miARNs dans la rgulation de lexpression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rle de ces molcules dans linstallation dun substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectu une analyse bio-informatique combine des approches exprimentales spcifiques afin didentifier clairement les miARNs dmontrant un fort potentiel de rgulation des gnes codant pour lexpression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifi un nombre limit de miARNs cardiaques qui possdaient ces proprits. Sur la base de ces rsultats, nous avons dmontr que laltration de l'expression des canaux ioniques, observe dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, lischmie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut tre soumise ces miARNs suggrant leur implication dans larythmognse. La rgulation du courant potassique IK1 est un facteur dterminant du remodelage lectrique auriculaire associe la FA. Les mcanismes molculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons mis lhypothse que l'altration de lexpression des miARNs soit corrle laugmentation de lexpression dIK1 dans la FA. Nous avons constat que lexpression de miR-26 est rduite dans la FA et quelle rgule IK1 en modulant lexpression de sa sous-unit Kir2.1. Nous avons dmontr que miR-26 est sous la rpression transcriptionnelle du facteur nuclaire des lymphocytes T activs (NFAT) et que lactivit accrue de NFATc3/c4, aboutit une expression rduite de miR-26. En consquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin dmontr que linterfrence in vivo de miR-26 influence la susceptibilit la FA en rgulant IK1, confirmant le rle prpondrant de miR-26 dans le remodelage auriculaire lectrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associ la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et linflux cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherch dterminer i) si le canal permable au Ca2+, TRPC3, jouait un rle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) tudi le rle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons dmontr que les canaux TRPC3 favorisent linflux du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dpendante ERK et en consquence activent la prolifration des fibroblastes. Nous avons galement dmontr que lexpression du TRPC3 est augmente dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empche le dveloppement de substrats relis la FA. Nous avons par ailleurs valid que miR-26 rgule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montr que l'expression rduite du miR-26 est galement due lactivit augmente de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi laugmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel li la FA. En conclusion, nos rsultats mettent en vidence l'importance des miARNs dans la rgulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rle important dans le remodelage lectrique et structurel associ la FA et ce, en rgulant IK1 et lexpression du canal TRPC3. Notre tude dmasque ainsi un mcanisme molculaire de contrle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier reprsente apres ces travaux une nouvelle cible thrapeutique prometteuse pour traiter la FA.
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Le tamoxifne, un modulateur slectif des rcepteurs oestrogniques, est un mdicament largement utilis depuis plus de vingt ans pour le traitement et la prvention du cancer du sein. Plusieurs tudes ont rapport que ladministration aigu du tamoxifne pouvait rduire certains courants K+ cardiaques. Cette observation suggre que les femmes traites de faon chronique avec le tamoxifne risquent davoir une prolongation de leur intervalle QT, favorisant ainsi le dveloppement de torsades de pointes. Puisque in vivo, le tamoxifne est largement mtabolis et son effet est attribu celui du 4hydroxy-tamoxifne (4OH-tamoxifne), nous avons d'abord vrifi si les effets du tamoxifne sur la repolarisation pouvaient tre dus au 4OH-tamoxifne. l'aide de la mthode de patch-clamp, nous avons tudi leffet aigu du 4OH-tamoxifne sur les courants K+ prsents au niveau ventriculaire chez la souris femelle. En premier lieu, nous avons dmontr que les souris traites avec le 4OH-tamoxifne prsentaient une diminution des courants K+ comparativement aux souris intactes. Fait intressant, le prtraitement des myocytes avec lantagoniste des rcepteurs oestrogniques, le ICI 182,780, ou linhibiteur de la synthse protique, l'actinomycine D, na pas modifi les effets du 4OH-tamoxifne. Ces rsultats suggraient que les effets du 4OH-tamoxifne sur les courants potassiques ne soient pas lis la transcription gnomique et nimplique pas les rcepteurs aux strognes. Bien que ladministration aigu du 4OH-tamoxifne diminue les courants K+ cardiaques, labsence de troubles au niveau du rythme cardiaque chez les femmes traites long terme exclu la possibilit de conclure que le traitement chronique avec le tamoxifne augmente la dure de lintervalle QT. L'accs des souris femelles et des cobayes nous a permis de dmontrer que contrairement au traitement en aigu, les courants et les canaux K+ cardiaques sont augments en chronique. Les oestrognes associs une diminution des courants K+ dune part et nos rsultats obtenus avec le tamoxifne dautre part suggrent quen bloquant les rcepteurs oestrogniques, le tamoxifne puisse prvenir les effets inhibiteurs des oestrognes sur les courants K+. Cette association strognes- tamoxifne- rcepteurs oestrogniques et courants K+ nous a encourages approfondir encore nos tudes et vrifier linfluence des hormones sexuelles fminines sur la repolarisation ventriculaire. Une troisime tude a t ainsi ralise chez des souris femelles ovariectomises et des souris dficientes en rcepteurs oestrogniques ou afin de vrifier le rle des oestrognes et des rcepteurs oestrogniques sur la repolarisation ventriculaire. Nos rsultats ont rvl clairement que labsence des oestrognes entrane une augmentation de la densit du courant K+ transitoire indpendant du Ca2+ (Ito) et de lexpression du canal Kv4.3 et ces effets sont mdis par les RE. Ces donnes soutiennent davantage notre conclusion que linhibition des rcepteurs oestrogniques est responsable de laugmentation des courants/canaux K+ et suggrent fortement quils jouent un rle dans la rgulation de la repolarisation ventriculaire. Elles soulignent aussi l'importance de vrifier le statut hormonal des animaux utiliss pour des tudes touchant l'lectrophysiologie cardiaque. Dans la dernire partie de cette thse nous avons vrifi les effets de la grossesse et du systme nerveux autonome sur les diffrents paramtres lectrocardiographiques et plus particulirement sur le rythme cardiaque chez la souris. Nos donnes ont montr que, comme chez la femme enceinte, la grossesse est associe une augmentation du rythme cardiaque. De plus, l'augmentation des niveaux des hormones fminines pourrait affecter lautomatisme et lactivit lectrique cardiaque. Ces diffrentes tudes ont augment les connaissances sur la rgulation hormonale de l'lectrophysiologie cardiaque et aideront aux avancements des recherches chez les femmes.
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Le motif imidazole, un htrocycle 5 atomes contenant 2 atomes dazote et trois atomes de carbone, prsente des proprits physico-chimiques intressantes qui en font un compos de choix pour plusieurs applications. Parmi ces proprits, la fonctionnalisation simple des deux atomes dazote pour former un sel dimidazolium est trs intressante. Ces sels sont dexcellents prcurseurs de carbnes N-htrocycliques (NHC) et sont couramment utiliss pour synthtiser des ligands en vue dune utilisation en catalyse organomtallique. Dautre part, cette famille de composs possde des proprits anionophores permettant une utilisation en transport anionique. Le prsent travail contient les rsultats de travaux concernant ces deux domaines, soit la catalyse et le transport anionique. Dans un premier temps, les proprits de drivs de limidazole sont exploites pour former un catalyseur de type palladium-NHC qui est utilis pour catalyser la raction de Suzuki-Miyaura en milieu aqueux. Lefficacit de ce catalyseur a t dmontre en utilisant aussi peu que 0,001 mol% pour un rendement quantitatif. Il sagit de la premire occurrence dun processus htrogne et recyclable dans leau, utilisant un catalyseur de type Pd-NHC et qui ne ncessite aucun additif ou co-solvant. Le recyclage a t prouv jusqu 10 cycles sans diminution apparente de lactivit du catalyseur. Dans un second temps, plusieurs sels dimidazolium ont t tests en tant que transporteurs transmembranaires danions chlorures. Les proprits intrinsques des sels utiliss qui en font des transporteurs efficaces ont t lucides. Ainsi, les paramtres qui semblent affecter le plus le transport anionique sont le changement du contre-anion du sel dimidazolium de mme que la propension de ce dernier sauto-assembler via une succession dempilements-. De plus, les proprits du transport ont t lucides, montrant la formation de canaux transmembranaires qui permettent non-seulement la diffusion dions Cl-, mais aussi le transport de protons et dions Ca2+. Lintrt de cette recherche repose dabord dans le traitement de diverses pathologies voyant leur origine dans le dysfonctionnement du transport anionique. Cependant, les proprits bactricides des sels dimidazolium utiliss ont t identifies lors des dernires expriences.
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Lendothlium vasculaire joue un rle prpondrant dans la rgulation du tonus vasculaire en gnrant loxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et les facteurs hyperpolarisants drivs de lendothlium (EDHF) comme puissants vasodilatateurs. Ces mcanismes requirent le calcium (Ca2+) divers niveaux, dmontrant limportance des dynamiques calciques endothliales. Une perturbation de lhomostasie calcique est observe dans une dysfonction endothliale lie lhypertension artrielle. Il est impratif dapprofondir nos connaissances sur les signalisations calciques endothliales impliques dans le contrle du tonus vasculaire. Des tudes rcentes ont montr quune variation locale de la concentration en Ca2+ libre intracellulaire ([Ca2+]i) est suffisante pour gnrer une rponse physiologique importante. Les pulsars calciques sont caractriss par une augmentation de [Ca2+]i spontane et transitoire spcifiquement localise au niveau des projections myoendothliales (PMEs). Ces PMEs sont des sites de communication privilgis entre les cellules endothliales (CEs) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Les pulsars calciques sont impliqus dans le mcanisme de lEDHF via lactivation des canaux potassiques Ca2+-dpendant de moyenne conductance (KCa3.1 ou IKCa). Les travaux de cette thse visent amliorer nos connaissances sur les signalisations calciques locales en caractrisant une nouvelle voie de signalisation pouvant tre implique dans la rgulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Outre les canaux KCa3.1 peu dinformations sont disponibles sur les cibles sensibles aux pulsars calciques. Une premire tude a permis didentifier la protine kinase II dpendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMKII) sous ses isoformes , et dans les CEs dartres natives de souris comme une cible pouvant tre module par les pulsars calciques. Des tudes en immunofluorescence ont permis dobserver la localisation particulire de CaMKII endothliale dans les PMEs, les sites des pulsars calciques. Une stimulation spcifique des pulsars calciques par la phnylphrine (PE) engendre un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Sachant que CaMKII active loxyde nitrique synthase endothliale (NOS3), nous avons valu limpact dune stimulation des pulsars calciques sur la production de NO en prsence dun inhibiteur de CaMKII, le KN-93. Nous avons dmontr que la production de NO est en partie dpendante de lactivation de CaMKII par les pulsars calciques. En utilisant un modle dhypertension induite par linfusion chronique de PE, nous avons permis de mettre en vidence une perturbation dans la relation entre les pulsars calciques et CaMKII. Dans une seconde tude nous avons tabli deux modles (normo- et hypertendus) dinfusion chronique langiotensine II (AngII) afin valuer limpact des ROS et de lhypertension sur la voie de signalisation pulsars/CaMKII/NO. Nos rsultats ont montr une augmentation des pulsars calciques accompagne dun recrutement de CaMKII dans les PMEs. Une stimulation aigue lAngII suggre que les ROS modulent les dynamiques calciques et que lAngII stimule la production de NO. Cette tude propose que ces voies de signalisations impliquent les rcepteurs de type 1 et 2 lAngII (AT1 et AT2). Ltude des pulsars calciques dpend fortement de la structure native des artres qui permet de conserver la formation des PMEs. La dernire tude prsente dans cette thse a permis dtablir une relation entre les PMEs et les pulsars calciques dans trois lits vasculaires distincts (artres msentriques, pulmonaires et coronariennes). Nos rsultats ont montr que les paramtres cintiques des pulsars calciques sont fortement conservs entre les diffrents lits vasculaires. Toutefois, la frquence globale ainsi que le nombre de sites actifs des pulsars calciques diffrent avec une proportion plus leve dans les artres msentriques et coronariennes comparativement aux artres pulmonaires. Ces rsultats corrlent avec le nombre plus lev de PMEs retrouv dans les artres msentriques et coronariennes. Ces travaux suggrent que les pulsars calciques sont fondamentaux pour les artres de rsistance. Les tudes de cette thse ont men lidentification dune nouvelle voie de signalisation impliquant les pulsars calciques et CaMKII endothliale dans la stimulation de la production de NO. Cette nouvelle voie de signalisation pourrait tre implique dans la rgulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Les pulsars calciques semblent tre fortement conservs entre les diffrentes artres de rsistances et ce malgr la disparit dans les PMEs, suggrant un rle prpondrant dans la fonction vasculaire. Ces travaux ouvrent une avenue pour le dveloppement de potentielles cibles thrapeutiques pouvant contrer la dysfonction endothliale associe lhypertension artrielle.
