75 resultados para CD8 T lymphocytes
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Limmunothrapie tumorale mdiation cellulaire est un traitement qui utilise le systme immunitaire des patients afin dinduire une rponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette rponse est produite suite la reconnaissance des antignes par les T CD8+. Ces cibles sont appeles antignes tumoraux (TAA) et dfinies comme des protines exprimes par les cellules cancreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifi Dickkopf-1 (DKK1), une protine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothrapie mdiation cellulaire efficace requiert lidentification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothrapie pourrait galement tre amliores par laugmentation de la puissance daction anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spcifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractrisation de lexpression de DKK1 dans les cancers communs et la dtermination de son immunognicit afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints dun cancer commun, vers un phnotype moins diffrenti afin daugmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractris lexpression de DKK1 dans le cancer du sein et dans dautres cancers communs. Le profil dexpression de DKK1 a t tudi par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignes cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. Lexpression de DKK1 a aussi t tudie dans des chantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant dun cancer du sein exprimaient DKK1. La moiti des tumeurs DKK1(+) tait triple ngative, donc pas de rcepteurs dstrogne et de progestrone et tait Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilits de traitements trs restreintes). De plus, 50% des chantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectues dans le cancer du poumon ont t, par la suite, corrobores par d'autres groupes qui ont montr une corrlation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Aprs avoir confirme lexpression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons valu limmunognicit de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectu des stimulations in vitro de cellules mononucles du sang priphrique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s dun cancer du sein ou du poumon avec des peptides drivs de DKK1 pouvant tre prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont t identifis et isols. Par essai multiplex et cytomtrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalit dun ces clones T CD8+ spcifiques DKK1 a t tudie et a rvle un profil effecteur, renforant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans lensemble, les rsultats obtenus dans cette premire partie de thse suggrent une possible utilisation de DKK1 en immunothrapie contre les cancers communs, attribuable son expression dans ces cancers et la possibilit de faire prolifrer des T CD8+ effecteurs spcifiques DKK1 partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thse, je dcrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints dun cancer commun, afin daugmenter la force et la dure de leurs fonctions anti-tumorales. Il a t dmontr que des lymphocytes moins diffrentis sont capables dune rponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons bas ce projet sur lutilisation dun inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur confrer un phnotype moins diffrenti, partageant des caractristiques de la cellule nave et de la cellule mmoire. Des cultures de T CD8+, spcifiques des antignes viraux, en prsence de linhibiteur ont permis daugmenter la scrtion dinterfron (IFN)- et leur activit cytotoxique. Ces rsultats indiquent un effet de lactivation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportes pour la premire fois chez les T CD8+ humains et suggrent une nouvelle stratgie, applicables limmunothrapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activit anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont men la ralisation dune tape trs importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la dmonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux drivs dorganes importants. Ces travaux ont galement men la dmonstration de limmunognicit de DKK1, par lidentification dun peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, ltude de la polyfonctionnalit des T CD8+ spcifiques DKK1 a rvle un profil effecteur favorable pour lobtention dune rponse anti-tumorale efficace. Ces dcouvertes pourraient servir llaboration dune stratgie dimmunothrapie mdiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, ltude phnotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donn lieu lobservation dun phnotype encore jamais rapport chez lhumain, confrant aux T CD8+ un aspect moins diffrenti avec des caractristiques propre un phnotype mmoire. Ces rsultats sont pertinents dans lamlioration de limmunothrapie du cancer, passant par laugmentation de la persistance des lymphocytes. En rsum, les rsultats prsents dans cette thse de doctorat fournissent des vidences indniables quant la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothrapie mdiation cellulaire des cancers communs. Ces rsultats fournissent galement des preuves quant la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par lactivation de la voie de la voie de Wnt, afin de gnrer des lymphocytes mdiateurs plus efficaces pour ce type de thrapie.
Resumo:
Lors dune infection par un pathogne, des lymphocytes T CD8+ nafs (LTn) spcifiques de lantigne sont activs, prolifrent et se diffrencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent diffrentes cytokines et acquirent une activit cytotoxique menant llimination du pathogne. Seulement 5 10 % des LTe survivront et se diffrencieront en LT mmoires (LTm), qui sont capables de rpondre plus rapidement lors dune seconde infection par le mme pathogne, contribuant au succs de la vaccination. Toutefois, la comprhension de lensemble des mcanismes rgulant le dveloppement des LTe et des LTm demeure incomplte. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la diffrenciation des LT CD8+ lors de la rponse immune, nous avons pos deux hypothses. Nous avons dabord propos que diffrentes cellules prsentatrices dantigne (CPA) fournissent diffrents signaux au moment de la reconnaissance antignique influenant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel dutilisation en immunothrapie, nous avons compar la capacit dactivation des LT CD8+ par les lymphocytes B activs via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montr que limmunisation avec des CD40-B induit une rponse effectrice mais, contrairement limmunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm nest gnr. Les LTe gnrs sont fonctionnels puisquils scrtent des cytokines, ont une activit cytotoxique et contrlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons quune scrtion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi quune interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au dfaut de diffrenciation des LTm observ lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous pos lhypothse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antignique, la voie de signalisation Notch influence le dveloppement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme gntique particulier. Dabord, grce un systme in vitro, le rle de la signalisation Notch dans les moments prcoces suivant lactivation du LT CD8+ a t tudi. Ce systme nous a permis de dmontrer que la voie de signalisation Notch rgule directement lexpression de la molcule PD-1. Ensuite, grce des souris o il y a dltion des rcepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rle de la voie de signalisation Notch dans la rponse immune des LT CD8+ a t dmontr. Nos rsultats dmontrent que suite une infection avec Lm ou une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le dveloppement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destins mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch na pas influenc la gnration de LTm. De faon trs intressante, lexpression des rcepteurs Notch influence la production dIFN- en fonction du contexte dactivation. En effet, suite une infection avec Lm, labsence des rcepteurs Notch naffecte pas la production dIFN- par les LTe, alors quelle est diminue suite une immunisation avec des CD suggrant un rle dpendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos rsultats permettent une meilleure comprhension des signaux fournis par les diffrentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mcanismes molculaires rgulant la diffrenciation des LT CD8+ lors de la rponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre damliorer les stratgies de vaccination.
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Une petite population de lymphocytes T exprimant les deux corcepteurs CD4 et CD8 et appele double positive (DP), a t dtecte dans le sang priphrique de donneurs sains et de patients atteints de diverses pathologies dont la sclrose en plaques (SEP). Nous avons mis lhypothse quil sagissait de lymphocytes T hautement activs pouvant contribuer linflammation chronique prsente dans la SEP. Nous avons compar les cellules T DP obtenues du sang de donneurs sains et de patients atteints de la SEP et non traits. La frquence des cellules DP tait similaire chez les patients et les donneurs sains. La proportion de lymphocytes T DP qui exprimaient les chaines du rcepteur de linterleukine-15 (IL-15) tait plus leve que pour les autres populations lymphocytaires. Des mesures dinduction de la phosphorylation du STAT5 (signal transducer and activator of transcription) ont dmontr que les cellules DP ont rpondu des doses plus faibles et pour de plus longues priodes lIL-15 comparativement aux autres lymphocytes T. Le pourcentage de lymphocytes T DP ayant la capacit de produire linterfron-gamma et des enzymes lytiques tait lev chez les tmoins sains mais ces niveaux taient significativement rduits chez les patients atteints de la SEP. La caractrisation phnotypique de cellules DP a suggr que ces cellules ont des proprits similaires aux lymphocytes T activs. Bien quil ne sagisse que dune caractrisation partielle, il semble que les lymphocytes T DP perdent une partie de leurs proprits chez les patients atteints de la SEP.
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La transmission mre-enfant (TME) du VIH-1 est un des enjeux majeurs de la pandmie. Une meilleure comprhension de la rponse des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (LTC) VIH-spcifiques lors de la grossesse facilitera le design de stratgies optimales pour diminuer la TME. Notre objectif est donc de caractriser lamplitude et la diversit de la reconnaissance antignique des LTC VIH-spcifiques avant, pendant et aprs la grossesse chez des femmes infectes par le VIH-1. Nos rsultats montrent pour la premire fois que linitiation et la progression de la grossesse, elles seules, n'ont que peu dinfluence sur lamplitude et la diversit de la reconnaissance antignique des rponses LTC en termes de production dIFN. Ces rsultats indiquent que les femmes infectes par le VIH conservent une immunocomptence durant leur grossesse, du moins dans le contexte dun traitement antirtroviral efficace. Ceci pourrait ventuellement aider promouvoir limmunisation comme stratgie pour prvenir la TME du VIH1.
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Les cytokines jouent un rle fondamental dans la rgulation des processus biologiques via la cascade de signalisation JAK-STAT. Les Suppressors of Cytokine Signalling (SOCS), protines intracellulaires, inhibent la voie JAK-STAT. Plusieurs tudes supportent leur implication dans des maladies immunitaires, mais peu dinformations sont disponibles sur leur expression par les lymphocytes T humains. Nous postulons que les cytokines Interfron-(IFN-) et Interleukine-27 (IL-27), dotes dun potentiel immuno-rgulateur, ont des rles bnfiques via linduction des SOCS. Limpact de lIFN- et lIL-27 sur lexpression des SOCS-1 et SOCS-3 par des cellules T CD8 et CD4 humaines a t tudi en utilisant des cellules sanguines de donneurs sains. Lexpression de ces rgulateurs a t value aux niveaux de lARNm par qRT-PCR et protique par immunocytochimie. Les SOCS-1 et SOCS-3 ont t rapidement induits en ARNm dans les deux types cellulaires en rponse lIFN- ou lIL-27 et une augmentation de lexpression a t confirme au niveau protique. Afin de mimer les thrapies base dIFN-, les cellules T ont t exposes chroniquement lIFN-. Aprs chaque ajout de cytokine les cellules T ont augment lexpression du SOCS-1, sans moduler le SOCS-3. LIL-27 a induit les SOCS-1 et SOCS-3 prfrentiellement dans les cellules T CD8 ; ceci corrle avec des rsultats du laboratoire dmontrant une plus petite expression des rcepteurs lIL-27 par les lymphocytes T CD4 que les CD8. Notre projet a permis dlucider lexpression des SOCS dans deux populations de cellules T et de clarifier les mcanismes dactions de lIFN- et lIL-27.
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La prsentation antignique par le complexe majeur dhistocompatibilit (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la prsentation de protines endognes qui refltent l'tat de la cellule la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la rponse immunitaires. Ainsi, l'expression des molcules du MHC I classiques est induite en rponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'limination des pathognes. HFE est une molcule du MHC Ib non-classique qui sert de rgulateur ngatif de l'absorption du fer. HFE est associ au dveloppement de l'hmochromatose hrditaire (HH), maladie associe au mtabolisme du fer mais souvent accompagne de dfauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu tudi l'impact de HFE sur la prsentation antignique par MHC I, afin d'expliquer en partie les dfauts immunitaires lis l'HH associe HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des molcules du MHC I classiques, nous avons tudi la rgulation de l'expression de HFE en rponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang priphrique mononucles (PBMC). Nous avons mis au point un systme dexpression antignique dans lequel nous contrlons lexpression de MHC I, de HFE et dun antigne pour lequel nous avons gnr des lymphocytes T CD8+ spcifiques. Nos rsultats dmontrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement sa forme mute (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons galement dmontr que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, indpendamment des niveaux d'expression de MHC I la surface, d'une comptition pour la 2-microglobuline, de la capacit de HFE d'interagir avec le rcepteur de la transferrine, de l'origine de l'antigne ou de l'affinit de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifi les domaines 1-2 de HFEWT comme tant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antignique. Par contre, la reconnaissance de peptides chargs de manire externe sur les molcules du MHC I prsentes la surface n'a dmontr aucune inhibition en prsence de HFEWT, suggrant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interfrant avec le processus d'apprtement antignique intracellulaire. linverse, nous avons souhait dterminer si les lymphocytes T activs pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de rgulation de l'expression de HFE, nous avons tabli que HFE est exprim dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lignes de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du mlanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activs avec ces lignes tumorales, nous avons dmontr que l'expression de HFE est fortement inhibe dans toutes ces lignes tumorales lorsqu'exposes des lymphocytes T activs. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est indpendante du contact cellulaire et semble mdie en partie par le GM-CSF, l'IFN- et le TNF. En somme, ces rsultats suggrent que les lymphocytes T de l'hte modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antignes prsents sur les molcules du MHC I prsentes aux lymphocytes T CD8+ antigne-spcifiques. De plus, ces tudes soulvent la possibilit d'un nouveau rle physiologique de HFEWT dans la voie de prsentation antignique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunognicit des antignes et la rponse immunitaire cellulaire chez l'hte.
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Les tumeurs solides sont infiltres par des cellules immunes (TIIC) dont la nature, la fonction et la composition varient dun patient l'autre. Ces cellules inflammatoires influencent l'invasion tumorale en contrlant la croissance et le potentiel mtastatique dune tumeur. Ainsi, il est propos dutiliser cette infiltration comme outil diagnostic et pronostic de routine. Certaines cellules sont bien connues pour jouer un rle important dans le contrle de la progression tumorale, comme cest le cas des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ alors que dautres possdent un rle contradictoire. tant donn la dpendance des tumeurs sur lquilibre entre ces diffrentes cellules, il est important didentifier les fonctions prcises des cellules immunes au sein de la tumeur. De nombreuses tudes sont ralises afin didentifier des marqueurs descriptifs du phnotype et la fonction des cellules immunes dans la tumeur. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- Identifier la mthode de dsagrgation des tissus tumoraux altrant le moins la biologie des TIIC pour leur caractrisation. 2- Caractriser lexpression de la molcule dadhrence CD146 dans les TIIC et en identifier lorigine. Lidentification de marqueurs pour la caractrisation phnotypique et fonctionnelle des TIIC a t ralise, entre autres, par la dtection de protines exprimes par la cellule. Dans la premire partie de ce projet, nous avons dmontr que les mthodes utilises pour dsagrger les tissus tumoraux dans le but disoler les TIIC induisent des changements dans la biologie de ces cellules ce qui peut fausser les conclusions qui en drivent. Nous avons donc compar l'impact de trois mthodes de dsagrgation : une dissociation mcanique utilisant la MdimachineTM et deux digestions enzymatiques utilisant une collagnase de type I seule ou combine de la collagnase de type IV et de la DNase I de type II. Nous nous sommes intresss l'effet de ces mthodes sur des paramtres tels que la viabilit cellulaire, laltration des protines de surface et la capacit des cellules prolifrer. Nous avons dmontr que ces mthodes affectent la viabilit des cellules de manire comparable, alors que la dtection de certaines protines de surface et la capacit de prolifrer est rduite/inhibe par les traitements enzymatiques. Nous concluons quune mthode mcanique utilisant la MdimachineTM est mieux adapte la caractrisation des TIIC afin de conserver leurs proprits. Dans la deuxime partie de notre projet, nous avons adapt cette mthode la caractrisation des TIIC. Nous avons port une attention particulire la molcule dadhrence CD146 dont limplication dans la migration des cellules immunes travers lendothlium vers les sites dinflammation est de plus en plus tudie dans les maladies autoimmunes. Nous avons mis en vidence une augmentation des proportions de cellules immunes exprimant CD146 dans les tumeurs comparativement au sang de patients de cancers. Cette expression est induite par les cellules tumorales tout en tant accrue par la ncrose de celles-ci. Nous dmontrons que ces cellules sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ prsentant un profil immunosuppressif. En conclusion, nos rsultats suggrent que CD146 participe la mise en place du contexte immunitaire dans la tumeur et augmente la capacit de migration des lymphocytes T CD4+. Linduction par les cellules tumorales de cette molcule dadhrence dans les cellules suppressives pourrait contribuer aux mcanismes immunorgulateurs mis en place par la tumeur. CD146 pourrait tre un marqueur dintrt pour lidentification des cellules immunosuppressives et pour le dveloppement de nouvelles thrapies.
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Le contrle immunitaire des infections virales est effectu, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent tre en mesure de reconnatre les cellules infectes et de les liminer. Cette reconnaissance des cellules infectes seffectue par linteraction du rcepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associs au complexe majeur dhistocompatibilit (CMH) de classe I la surface des cellules htes. Cette interaction constitue llment dclencheur permettant llimination de la cellule infecte. On comprend donc toute limportance des mcanismes cellulaires menant la gnration des peptides antigniques partir des protines virales produites au cours dune infection. La vision traditionnelle de cet apprtement protique menant la prsentation dantignes par les molcules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antignes endognes sont apprts par la voie dite classique de prsentation antignique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dgradation des antignes intracellulaires par le protasome dans le cytoplasme, le transport des peptides rsultant de cette dgradation lintrieur du rticulum endoplasmique, leur chargement sur les molcules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH la surface de la cellule o ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antignes exognes, le dogme veut que ceux-ci soient apprts par les protases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi gnrs sont directement chargs sur les molcules de CMH de classe II lintrieur de ce compartiment. Par la suite, des mcanismes de recyclage vsiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte sgrgation des voies dapprtement antignique a t durement prouve par la capacit des cellules prsentatrices dantignes effectuer lapprtement dantignes exognes et permettre leur prsentation sur des molcules de CMH de classe I. De plus, lidentification rcente de peptides dorigine intracellulaire associs des molcules de CMH de classe II a clairement indiqu la prsence dinteractions entre les deux voies dapprtement antignique permettant de transgresser le dogme pralablement tabli. Lobjectif du travail prsent ici tait de caractriser les voies dapprtement antignique menant la prsentation dantignes viraux par les molcules du CMH de classe I lors dune infection par le virus de lHerps simplex de type I (HSV-1). Dans les rsultats rapports ici, nous dcrivons une nouvelle voie dapprtement antignique rsultant de la formation dautophagosomes dans les cellules infectes. Cette nouvelle voie permet le transfert dantignes viraux vers un compartiment vacuolaire dgradatif dans la phase tardive de linfection par le virus HSV-1. Cette mise en branle dune seconde voie dapprtement antignique permet daugmenter le niveau de prsentation de la glycoprotine B (gB) virale utilise comme modle dans cette tude. De plus, nos rsultats dcrivent la formation dune nouvelle forme dautophagosomes drivs de lenveloppe nuclaire en rponse linfection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert dantignes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action galement assure par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxime partie du travail prsent ici, nous utilisons linfection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en rsulte pour tudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dgradatif. Nos rsultats mettent en valeur limportance du rticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en drivent, dans ces mcanismes de transfert antignique permettant damplifier la prsentation antignique de la protine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. Lensemble de nos rsultats dmontrent galement une troite collaboration entre la voie classique de prsentation antignique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la prsence dinteraction entre les deux voies.
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Le cancer de la prostate est le cancer le plus frquemment diagnostiqu chez les hommes canadiens et la troisime cause de dcs reli au cancer. Lorsque diagnostiqu un stade prcoce de la maladie, le cancer de la prostate est trait de manire curative par chirurgie et radiothrapie. Par contre, les thrapies actuelles ne peuvent radiquer la maladie lorsquelle progresse des stades avancs. Ces thrapies, comme la chimiothrapie et lhormonothrapie, demeurent donc palliatives. Il est primordial doptimiser de nouvelles thrapies visant llimination des cellules cancreuses chez les patients atteints des stades avancs de la maladie. Une de ces nouvelles options thrapeutiques est limmunothrapie. Limmunothrapie du cancer a fait des progrs considrables durant les dernires annes. Cependant, les avancements encourageants obtenus lors dessais prcliniques ne se sont pas encore traduits en des rsultats cliniques significatifs. En ce qui concerne le cancer de la prostate, les rsultats ngligeables suivants des interventions immunothrapeutiques peuvent tre causs par le fait que la plupart des tudes sur le microenvironnement immunologique furent effectues chez des modles animaux. De plus la majorit des tudes sur limmunologie tumorale humaine furent effectues chez des patients atteints dautres cancers, tels que le mlanome, et non chez les patients atteints du cancer de la prostate. Donc, le but central de cette thse de doctorat est dtudier le microenvironnement immunologique chez les patients atteints du cancer de la prostate afin de mieux dfinir les impacts de la tumeur sur le dveloppement de la rponse immunitaire antitumorale. Pour raliser ce projet, nous avons tabli deux principaux objectifs de travail : (i) la caractrisation prcise des populations des cellules immunitaires infiltrant la tumeur primaire et les ganglions mtastatiques chez les patients atteints du cancer de la prostate; (ii) lidentification et ltude des mcanismes immunosuppressifs exprims par les cellules cancreuses de la prostate. Les rsultats prsents dans cette thse dmontrent que la progression du cancer de la prostate est associe au dveloppement dun microenvironnement immunosuppressif qui, en partie, est rgul par la prsence des andrognes. Ltude initiale avait comme but la caractrisation du microenvironnement immunologique des ganglions drainant la tumeur chez des patients du cancer de la prostate. Les rsultats prsents dans le chapitre III nous a permis de dmontrer que les ganglions mtastatiques comportent des signes cellulaires et histopathologiques associs une faible ractivit immunologique. Cette immunosuppression ganglionnaire semble dpendre de la prsence des cellules mtastatiques puisque des diffrences immunologiques notables existent entre les ganglions non-mtastatiques et mtastatiques chez un mme patient. La progression du cancer de la prostate semble donc associe au dveloppement dune immunosuppression affectant les ganglions drainant la tumeur primaire. Par la suite, nous nous sommes intresss limpact de la thrapie par dpltion des andrognes (TDA) sur le microenvironnement immunologique de la tumeur primaire. La TDA est associe une augmentation marque de linflammation prostatique. De plus, les protocoles dimmunothrapies pour le cancer de la prostate actuellement valus en phase clinique sont dirigs aux patients hormonorfractaires ayant subi et chou la thrapie. Cependant, peu dinformation existe sur la nature de linfiltrat de cellules immunes chez les patients castrs. Il est donc essentiel de connatre la nature de cet infiltrat afin de savoir si celui-ci peut rpondre de manire favorable une intervention immunothrapeutique. Dans le chapitre IV, je prsente les rsultats sur labondance des cellules immunes infiltrant la tumeur primaire suivant la TDA. Chez les patients castrs, les densits de lymphocytes T CD3+ et CD8+ ainsi que des macrophages CD68+ sont plus importantes que chez les patients contrles. Nous avons galement observ une corrlation entre la densit de cellules NK et une diminution du risque de progression de la maladie (rechute biochimique). Inversement, une forte infiltration de macrophages est associe un plus haut risque de progression. Conjointement, durant cette tude, nous avons dvelopp une nouvelle approche informatise permettant la standardisation de la quantification de linfiltrat de cellules immunes dans les chantillons pathologiques. Cette approche facilitera la comparaison dtudes indpendantes sur la densit de linfiltrat immun. Ces rsultats nous ont donc permis de confirmer que les effets pro-inflammatoires de la TDA chez les patients du cancer de la prostate ciblaient spcifiquement les lymphocytes T et les macrophages. Lhypothse intressante dcoulant de cette tude est que les andrognes pourraient rguler lexpression de mcanismes immunosuppressifs dans la tumeur primaire. Dans le chapitre V, nous avons donc tudi lexpression de mcanismes immunosuppressifs par les cellules cancreuses du cancer de la prostate ainsi que leur rgulation par les andrognes. Notre analyse dmontre que les andrognes augmentent lexpression de molcules proprits immunosuppressives telles que larginase I et larginase II. Cette surexpression dpend de lactivit du rcepteur aux andrognes. Chez les patients castrs, lexpression de larginase II tait diminue suggrant une rgulation andrognique in vivo. Nous avons observ que larginase I et larginase II participent la prolifration des cellules du cancer de la prostate ainsi qu leur potentiel immunosuppressif. Finalement, nous avons dcouvert que lexpression de linterleukin-8 tait aussi rgule par les andrognes. De plus, linterleukin-8, indpendamment des andrognes, augmente lexpression de larginase II. Ces rsultats confirment que les andrognes participent au dveloppement dune microenvironnement immunosuppressif dans le cancer de la prostate en rgulant lexpression de larginase I, larginase II et linterleukin-8. En conclusion, les rsultats prsents dans cette thse tmoignent du caractre unique du microenvironnement immunologique chez les patients atteints du cancer de la prostate. Nos travaux ont galement permis dtablir de nouvelles techniques bases sur des logiciels danalyse dimage afin de mieux comprendre le dialogue entre la tumeur et le systme immunitaire chez les patients. Approfondir les connaissances sur les mcanismes de rgulation du microenvironnement immunologique chez les patients atteint du cancer de la prostate permettra doptimiser des immunothrapies mieux adaptes radiquer cette maladie.
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Les mthodes de vaccination actuelles contre linfluenza, axes sur la rponse anticorps dirige contre des antignes hautement variables, ncessitent la production dun vaccin pour chaque nouvelle souche. Le dfi est maintenant de stimuler simultanment une rponse cellulaire pan-spcifique ciblant des antignes conservs du virus, tel que la protine de la matrice (M1) ou la nucloprotine (NP). Or, la prsentation antignique de ces protines est peu dfinie chez lhumain. Nous avons analys la prsentation endogne par les complexes majeurs dhistocompatibilit de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protines M1 et NP ont t exprimes dans des cellules prsentatrices dantignes (CPAs). Notamment, des pitopes de M1 et de NP endognes peuvent tre prsentes par CMH-I et -II, ce qui rsulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ prcdemment isols. tant donn limportance des lymphocytes T CD4+ dans la rponse cellulaire, nous avons clon M1 ou NP en fusion avec des squences de la protine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la prsentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de faon endogne ces constructions modifies ou sauvages ont ensuite t utilises pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualit a t value selon la production de cytokines et la prsence de molcules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observ une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spcifiques scrtant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-, TNF, MIP-1) dans des proportions comparables avec une prsentation par CMH-II basale ou amliore. Cette qualit indpendante du niveau de prsentation endogne par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggre que cette prsentation est suffisante court terme. En outre, la prsentation endogne de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spcifiques des pitopes conservs du virus, tel quidentifi laide une mthode didentification originale base sur des segments dARNm, mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) . Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la prsentation antignique de M1 et de NP pourraient servir tablir de nouvelles stratgies vaccinales pan-spcifiques contre linfluenza.
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La diffrentiation entre le soi et le non-soi est un processus biologique essentiel la vie. Les peptides endognes prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit de classe I (CMH I) reprsentent le fondement du soi pour les lymphocytes T CD8+. On donne le nom dimmunopeptidome lensemble des peptides prsents la surface cellulaire par les molcules du CMH I. Nos connaissances concernant lorigine, la composition et la plasticit de limmunopeptidome restent trs limites. Dans le cadre de cette thse, nous avons dvelopp une nouvelle approche par spectromtrie de masse permettant de dfinir avec prcision : la nature et labondance relative de lensemble des peptides composant limmunopeptidome. Nous avons trouv que limmunopeptidome, et par consquent la nature du soi immun, est surreprsent en peptides provenant de transcrits fortement abondants en plus de dissimuler une signature tissu-spcifique. Nous avons par la suite dmontr que limmunopeptidome est plastique et modul par lactivit mtabolique de la cellule. Nous avons en effet constat que les modifications du mtabolisme cellulaire par linhibition de mTOR (de langlais mammalian Target Of Rapamycin) provoquent des changements dynamiques dans la composition de limmunopeptidome. Nous fournissons galement la premire preuve dans ltude des systmes que limmunopeptidome communique la surface cellulaire lactivit de certains rseaux biochimiques ainsi que de multiples vnements mtaboliques rguls plusieurs niveaux lintrieur de la cellule. Nos dcouvertes ouvrent de nouveaux horizons dans les domaines de la biologie des systmes et de limmunologie. En effet, notre travail de recherche suggre que la composition de limmunopeptidome est module dans lespace et le temps. Il est par consquent trs important de poursuivre le dveloppement de mthodes quantitatives au niveau des systmes qui nous permettront de modliser la plasticit de limmunopeptidome. La simulation et la prdiction des variations dans limmunopeptidome en rponse diffrents facteurs cellulaires intrinsques et extrinsques seraient hautement pertinentes pour la conception de traitements immunothrapeutiques.
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Cryptococcus neoformans var. grubii est responsable de la majeure partie des infections au Cryptococcus chez les individus infects au VIH-1. Cryptococcus gattii infecte gnralement les personnes immunocomptentes. Afin de comprendre les mcanismes responsables de la susceptibilit diffrentielle de ces espces lors de linfection au VIH-1, nous avons tabli et caractris un modle novateur de la cryptococcose chez des souris transgniques (Tg) CD4C/HIVMutA exprimant des gnes du VIH-1, et qui dveloppent une maladie similaire au SIDA. Les objectifs sont de dmontrer une diffrence significative au niveau de la survie, de la rponse inflammatoire et du recrutement cellulaire pulmonaire en fonction de la prsence du transgne et de lespce de Cryptococcus inocule. Des analyses de survie, dhistopathologie et de cytomtrie en flux sur les populations cellulaires pulmonaires ont t effectues. Les souris Tg infectes avec C. neoformans H99 ou C23 ont dmontr une survie rduite et une augmentation de la dissmination comparativement aux souris non-Tg, contrairement aux souris Tg infectes au C. gattii R265 ou R272. Lexamen histopathologique des poumons de souris Tg infectes au H99 a montr une faible rponse inflammatoire, contrairement aux souris non-Tg. Pour la souche R265, il y avait une trs faible rponse inflammatoire chez les deux types de souris. Enfin, ltude des populations cellulaires du poumon a rvl chez les souris Tg une augmentation des pourcentages de macrophages interstitiels et de cellules polymorphonuclaires, ainsi quune diminution des lymphocytes T CD4+ et CD8+, indpendamment de linfection au Cryptococcus. Ce modle novateur reprsente donc un outil trs pertinent pour ltude de limmunopathogense de la cryptococcose dans le contexte du VIH.
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La sclrose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du systme nerveux central (SNC) caractrise par une infiltration privasculaire de cellules mononuclaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules mylodes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phnomne dinfiltration est d une fragilisation de la barrire hmato-encphalique (BHE). Lentre des cellules immunitaires au SNC va mener la destruction de la gaine de myline et donc lapparition de plaques de dmylinisation. Ainsi, nous avons mis lhypothse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang priphrique travers la BHE est contrle par des mcanismes molculaires distincts et spcifiques chaque type cellulaire. Afin de rpondre cette hypothse, quatre diffrentes tudes ont t mises sur pieds. En premier lieu, nous dmontrons un effet bnfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs molculaire soluble. Ce phnomne sopre via la suppression du processus disoprenylation, et en empchant probablement la contraction des cellules endothliales de la BHE. De plus, nous dmontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflamm sont en mesures de se diffrencier en DCs et dinduire une rponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes travers la BHE est contrle par une nouvelle molcule dadhrence nomme Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit une inhibition spcifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu une amlioration des signes cliniques du modle animal de la SEP, soit lencphalomylite auto-immune exprimentale (EAE). Finalement, nous dmontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC seffectue via lintgrine alpha-4. De plus, la majorit des lymphocytes T CD8+ que lon retrouve dans le liquide cphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infecte au virus de lhpatite murine portent un phnotype effecteur mmoire. Ces donnes pourraient expliquer lmergence de leucoencphalopathie multifocale progressive observe chez certains patients SEP traits au natalizumab, un anticorps dirig contre lintgrine alpha-4. En conclusion, notre tude a permis de dmontrer limportance des monocytes provenant de la priphrie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. Linhibition dentre de ces cellules pourrait savrer bnfique en SEP tout en permettant limmuno-surveillance du cerveau, ce que lanti-alpha-4 intgrine ne permet pas. Les statines pourraient savrer une autre option intressante puisquelles agissent sur les processus inflammatoires impliqus dans la SEP.
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La sclrose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire dmylinisante et neurodgnrative du systme nerveux central (SNC). Les cellules T actives qui expriment le PD-1 sont inhibes via linteraction avec lun des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des tudes effectues chez le modle murin de la SEP, lencphalomylite auto-immune exprimentale (EAE), ont dmontr que linteraction du PD-1 avec ses ligands contribue attnuer la maladie. Toutefois, le rle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogense de la SEP chez lhumain et dans le modle murin na pas t compltement lucid. Nous avons dtermin que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de faon significative cette expression en rponse des cytokines inflammatoires. Le blocage de lexpression du PD-L1 par les astrocytes laide de siRNA spcifiques mne laugmentation significative des rponses des cellules T CD8+ (prolifration, cytokines, enzymes lytiques). Nos rsultats tablissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les rponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus crbraux post-mortem par immunohistochimie dmontre que dans les lsions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus levs que dans les tissus de tmoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moiti des lymphocytes T CD8+ ayant infiltr des lsions de SEP nexpriment pas le rcepteur PD-1. Au cours du dveloppement de lEAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprim par les cellules T ds le dbut des symptmes, mais son intensit diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoy par le PD-L1. Nous avons observ que les cellules endothliales humaines formant la barrire hmato-encphalique (BHE) expriment de faon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que lexpression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprims par les cellules endothliales ont la capacit de freiner lactivation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration travers la BHE. Lendothlium du cerveau des tissus normaux et des lsions SEP nexprime pas des taux dtectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moiti de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lsions SEP. Nos travaux dmontrent que lentre des cellules T actives est contrle dans des conditions physiologiques grce la prsence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, lexpression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lsions SEP nuit au contrle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ tant dpourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprim par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester actives.
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Objectifs: Chez les patients atteints de sclrose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molcules dadhrence afin de parvenir traverser la barrire hmo-encphalique (BHE) et former des lsions multifocales dans le systme nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polariss en TH17 (scrtant de lIL-17) sont reconnus comme contribuant la formation des lsions. Le rle des lymphocytes CD8 TC17 est quant lui encore mal dfini. Lidentification de marqueurs de surface spcifiquement exprims par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractrisation de ces sous-populations pathogniques et fournirait de nouvelles cibles thrapeutiques pour traiter la SEP. Mthodologie: Nous avons identifi MCAM lors danalyses protomiques de cellules endothliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractris le phnotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, partir de matriel obtenu de tmoins (contrles), de patients atteints de SEP et danimaux atteints dencphalomylite auto-immune exprimentale (EAE). Rsultats: MCAM est exprim la fois par les cellules endothliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mmoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus dIL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, lexpression de MCAM est fortement augmente la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des pousses de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent lexpression. In situ, lexpression de MCAM par les cellules endothliales de la BHE est plus marque au site des lsions de SEP et dEAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats privasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 travers les cellules endothliales de la BHE humaine. In vivo, dplter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ amliore les signes cliniques de lEAE par transfert. Par ailleurs, lexpression de MCAM est rgule la hausse la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgnique TCR1640, un modle animal dEAE spontane. Finalement, bloquer MCAM attnue les dficits neurologiques chroniques aussi bien du modle dEAE induite avec le MOG35-55 que du modle dEAE spontane. Conclusion: Nos donnes dmontrent que les lymphocytes encphalitogniques produisant de lIL-17 et prsentant une capacit effectrice et migratoire marque expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thrapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires.
