18 resultados para CD8 T cell
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Les cellules T CD8+ jouent un rle primordial dans le contrle des infections virales en limitant la dissmination des cellules infectes. Lors de linfection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spcifiques ne se diffrencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectes par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de prolifrer ou de produire l IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et lengagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces dficits fonctionnels des cellules T . Le rle de PD-1 dans la rgulation d'vnements transcriptionnels contrlant la diffrentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste dmontrer. Id2 joue un rle central dans la diffrenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons mis lhypothse que le dfaut de maturation observ chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spcifiques (CD8+PD-1hi) au cours de linfection chronique par le virus HIV pouvait tre li la diminution dexpression du rgulateur Id2. Nous avons ainsi dmontr que l'engagement de PD-1 contribuait une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir lexpression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines chaine gamma joue un rle clef dans la survie et lhomostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons dmontr que lIL-15 tait unique grce ses capacits de stimulation de lexpression dId2 et ses proprits favorisant la survie ainsi que la diffrenciation des cellules T CD8+ effectrices. lIL-15 induit la prolifration de toutes les populations de cellules T mmoires provenant de donneurs sains. Laddition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur diffrenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par lIL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur diffrenciation. Un test de cytotoxiciti par cytomtrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spcifiques par lIL-15 favorisait lexpression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spcifiques. En conclusion, nous avons pour la premire fois dans cette thse dfini les mcanismes molculaires impliqus dans la modulation de lexpression du rgulateur transcriptionnel Id2 par lIL-15. Nous avons galement rvl comment lengagement de PD-1 conduisait a une altration de lexpression et de la fonction dId2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spcifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que lIL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer une meilleure stimulation des rponses immunes favorisant ainsi la ractivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectes de manire latente.
Resumo:
Linfection par le VIH-1 est caractrise par une dpltion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en labsence de traitements anti-rtroviraux, conduit inluctablement la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mcanismes impliqus dans ce dysfonctionnement de la rponse cellulaire T ont t lucids et ont rvl un rle important de la molcule PD-1 dans lexhaustion des cellules T en phase chronique de linfection. En effet, des niveaux levs de PD-1 ont t associs une charge virale leve ainsi qu une diminution de la production de cytokines et de la capacit de prolifrer des cellules T spcifiques du virus. De plus, bloquer in vitro linteraction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rtabli la fonction de ces cellules. De faon intressante, notre groupe ainsi que dautres quipes, ont montr que lexpression de PD-1 tait non seulement augmente sur les cellules spcifiques de lantigne mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant limpact de lexpression de PD-1 sur le renouvellement et la diffrenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de linfection. Lexpression de PD-1 na notamment pas t tudie en phase aigue de linfection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue quen phase chronique de linfection, lexpression de PD-1 est augmente sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naves. Nous avons galement mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phnotype plus diffrenci, et ce tous les stades de la maladie. Dans cette thse, nous discutons le rle possible de PD-1 dans lhomostasie des cellules T chez les individus infects par le VIH-1. En tudiant la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection, nous avons trouv que les sous-populations T CD8+ des individus rcemment infects exprimaient moins de PD-1 que celles des individus un stade plus avanc de la maladie. Ces niveaux plus levs de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associs des niveaux rduits de prolifration in vivo comme mesur par lexpression de Ki67 suggrant que lexpression de PD-1 est partiellement implique dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naves saccumulent en frquence lors de la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection. Considrant que les cellules naves expriment dj des hauts niveaux de PD-1, nous avons mis lhypothse que lactivation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infects est affecte. En rsum, nous proposons un modle o des hauts niveaux dexpression de PD-1 sont associs (1) un dysfonctionnement de la rponse cellulaire T CD8+ et (2) un dfaut dactivation des cellules naves ce qui contribue non seulement la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter lefficacit de potentiels vaccins dans linfection par le VIH-1 en empchant toute nouvelle rponse dtre initie. Afin de mieux dissquer la rponse immunitaire mise en place lors dune infection comme celle du VIH-1, nous avons dvelopp un outil qui permet de dtecter les cellules T CD4+ i.e. des ttramres de CMH de classe II. Ces ractifs ont pour but daugmenter lavidit du CMH de classe II pour son ligand et donc de dtecter des TCR de faible affinit. Dans cette thse, nous dcrivons une mthode originale et efficace pour produire diverses molcules de HLA-DR liant de faon covalente le peptide antignique. Mieux dterminer les mcanismes responsables de lexhaustion des cellules T dans linfection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que dvelopper des outils de pointe pour suivre ces rponses T, est central une meilleure comprhension de linteraction entre le virus et le systme immunitaire de lhte, et permettra ainsi le dveloppement de stratgies pertinentes pour lutter contre linfection par le VIH-1.
Resumo:
Limmunothrapie tumorale mdiation cellulaire est un traitement qui utilise le systme immunitaire des patients afin dinduire une rponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette rponse est produite suite la reconnaissance des antignes par les T CD8+. Ces cibles sont appeles antignes tumoraux (TAA) et dfinies comme des protines exprimes par les cellules cancreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifi Dickkopf-1 (DKK1), une protine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothrapie mdiation cellulaire efficace requiert lidentification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothrapie pourrait galement tre amliores par laugmentation de la puissance daction anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spcifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractrisation de lexpression de DKK1 dans les cancers communs et la dtermination de son immunognicit afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints dun cancer commun, vers un phnotype moins diffrenti afin daugmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractris lexpression de DKK1 dans le cancer du sein et dans dautres cancers communs. Le profil dexpression de DKK1 a t tudi par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignes cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. Lexpression de DKK1 a aussi t tudie dans des chantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant dun cancer du sein exprimaient DKK1. La moiti des tumeurs DKK1(+) tait triple ngative, donc pas de rcepteurs dstrogne et de progestrone et tait Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilits de traitements trs restreintes). De plus, 50% des chantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectues dans le cancer du poumon ont t, par la suite, corrobores par d'autres groupes qui ont montr une corrlation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Aprs avoir confirme lexpression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons valu limmunognicit de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectu des stimulations in vitro de cellules mononucles du sang priphrique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s dun cancer du sein ou du poumon avec des peptides drivs de DKK1 pouvant tre prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont t identifis et isols. Par essai multiplex et cytomtrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalit dun ces clones T CD8+ spcifiques DKK1 a t tudie et a rvle un profil effecteur, renforant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans lensemble, les rsultats obtenus dans cette premire partie de thse suggrent une possible utilisation de DKK1 en immunothrapie contre les cancers communs, attribuable son expression dans ces cancers et la possibilit de faire prolifrer des T CD8+ effecteurs spcifiques DKK1 partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thse, je dcrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints dun cancer commun, afin daugmenter la force et la dure de leurs fonctions anti-tumorales. Il a t dmontr que des lymphocytes moins diffrentis sont capables dune rponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons bas ce projet sur lutilisation dun inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur confrer un phnotype moins diffrenti, partageant des caractristiques de la cellule nave et de la cellule mmoire. Des cultures de T CD8+, spcifiques des antignes viraux, en prsence de linhibiteur ont permis daugmenter la scrtion dinterfron (IFN)- et leur activit cytotoxique. Ces rsultats indiquent un effet de lactivation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportes pour la premire fois chez les T CD8+ humains et suggrent une nouvelle stratgie, applicables limmunothrapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activit anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont men la ralisation dune tape trs importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la dmonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux drivs dorganes importants. Ces travaux ont galement men la dmonstration de limmunognicit de DKK1, par lidentification dun peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, ltude de la polyfonctionnalit des T CD8+ spcifiques DKK1 a rvle un profil effecteur favorable pour lobtention dune rponse anti-tumorale efficace. Ces dcouvertes pourraient servir llaboration dune stratgie dimmunothrapie mdiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, ltude phnotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donn lieu lobservation dun phnotype encore jamais rapport chez lhumain, confrant aux T CD8+ un aspect moins diffrenti avec des caractristiques propre un phnotype mmoire. Ces rsultats sont pertinents dans lamlioration de limmunothrapie du cancer, passant par laugmentation de la persistance des lymphocytes. En rsum, les rsultats prsents dans cette thse de doctorat fournissent des vidences indniables quant la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothrapie mdiation cellulaire des cancers communs. Ces rsultats fournissent galement des preuves quant la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par lactivation de la voie de la voie de Wnt, afin de gnrer des lymphocytes mdiateurs plus efficaces pour ce type de thrapie.
Resumo:
CD4+ T lymphocytes play an important role in CD8+ T cell-mediated responses against tumors. Considering that about 20% of melanomas express major histocompatibility complex (MHC) class II, it is plausible that concomitant antigenic presentation by MHC class I and class II complexes shapes positive (helper T cells) or negative (regulatory T cells) anti-tumor responses. Interestingly, gp100, a melanoma antigen, can be presented by both MHC class I and class II when expressed endogenously, suggesting that it can reach endosomal/MHC class II compartments (MIIC). Here, we demonstrated that the gp100 putative amino-terminal signal sequence and the last 70 residues in carboxy-terminus, are essential for MIIC localization and MHC class II presentation. Confocal microscopy analyses confirmed that gp100 was localized in LAMP-1+ endosomal/MIIC. Gp100-targeting sequences were characterized by deleting different sections in the carboxy-terminus (residues 590 to 661). Transfection in 293T cells, expressing MHC class I and class II molecules, revealed that specific deletions in carboxy-terminus resulted in decreased MHC class II presentation, without effects on MHC class I presentation, suggesting a role in MIIC trafficking for these deleted sections. Then, we used these gp100-targeting sequences to mobilize the green fluorescent protein (GFP) to endosomal compartments, and to allow MHC class II and class I presentation of minimal endogenous epitopes. Thus, we concluded that these specific sequences are MIIC targeting motifs. Consequently, these sequences could be included in expression cassettes for endogenously expressed tumor or viral antigens to promote MHC class II and class I presentation and optimize in vivo T cell responses, or as an in vitro tool for characterization of new MHC class II epitopes.
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Suite la rencontre dun antigne (Ag) prsent la surface des cellules prsentatrice de lAg (CPA), les lymphocytes T nafs, ayant un rcepteur des cellules T (RCT) spcifique de lAg, vont prolifrer et se diffrencier en LT effecteurs (1). Suite llimination de lAg la majorit des LTe vont mourir par apoptose alors que les restants vont se diffrencier en LT mmoire (LTm) protgeant lorganisme long terme. Les mcanismes qui permettent la diffrenciation des LTe en LTm sont encore inconnus. Pour comprendre comment les LTm CD8+ sont gnrs partir des LTe, nous avons mis lhypothse que la densit de lAg prsent par les CPA peut avoir un impact sur la slection des LT CD8+ rpondant lAg se diffrencier en LTm. De manire intressante, nos rsultats montrent quune immunisation avec des cellules dendritiques (DCs) exprimant un haut niveau de complexe CMH/peptide sa surface permet le dveloppement de LTm. linverse, le dveloppement des LTm est fortement rduit (10-20X) lorsque les souris sont immunises avec des DCs exprimant un niveau faible de complexes CMH/peptide leur surface. De plus, la quantit dAg na aucune influence ni sur lexpansion des LT CD8+ ni sur lacquisition de leurs fonctions effectrices, mais affecte de manire critique la gnration des LTm. Nos rsultats suggrent que le nombre de RCT engag lors de la reconnaissance de lAg est important pour la formation des LTm. Pour cela nous avons observ par vido-microscopie le temps dinteraction entre des LTn et des DCs. Nos rsultats montrent que le temps et la qualit de linteraction sont dpendants de la densit dAg prsent par les DCs. Effectivement, nous observons une diminution dans le pourcentage de LT faisant une interaction prolonge avec les DCs quand le niveau dAg est faible. De plus, nous observons des variations de lexpression des facteurs de transcription clefs impliqus dans la diffrenciation des LTm tels quEomes, Bcl-6 et Blimp-1. Par ailleurs, la densit dAg fait varier lexpression du Neuron-derived orphan nuclear receptor 1 (Nor-1). Nor-1 est impliqu dans la conversion de Bcl-2 en molcule pro-apoptotique et contribue la mort par apoptose des LTe pendant la phase de contraction. Notre modle propose que la densit de lpitope contrle la gnration des CD8+ LTm. Une meilleure comprhension des mcanismes impliqus dans la gnration des LTm permettra le dveloppement de meilleures stratgies pour la gnration de vaccin. Dans un second temps, nous avons valu le rle du signal RCT dans lhomostasie des LTm. Pour ce faire, nous avons utilis un modle de souris transgnique pour le RCT dont son expression peut tre module par un traitement la ttracycline. Ce systme nous a permis dabolir lexpression du RCT la surface des LTm. De manire intressante, en absence de RCT exprim, les LTm CD8+ peuvent survivre long terme dans lorganisme et rester fonctionnels. De plus, une sous population des LTm CD4+ a la capacit de survivre sans RCT exprim dans un hte lymphopnique alors que lautre sous population ncessite lexpression du RCT.
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Limmunit adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertbrs mchoire reposent sur la prsentation de peptides par les rcepteurs dhistocompatibilit majeur de classe I. Les peptides antigniques, prsents par les molcules du complexe dhistocompatibilit (CMH), sont scruts par les lymphocytes T CD8 pour une rponse immunitaire approprie. Le rpertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appel immunopeptidome, est gnr par la dgradation protosomale des protines endognes, et a un rle essentiel dans la rgulation de limmunit cellulaire. La composition de limmunopeptidome dpend du type de cellule et peut prsenter des caractristiques lies des maladies comme le cancer. Les peptides antigniques peuvent tre utiliss des fins immunothrapeutiques notamment dans le traitement voire la prvention de certains cancers. La spectromtrie de masse est un outil de choix pour lidentification, le squenage et la caractrisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides amins, la faible abondance et la diversit de ces peptides compliquent leur dtection et leur squenage. Nous avons dvelopp un programme appel StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives la fragmentation des peptides. laide de ce programme, nous montrons sans quivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent trs diffremment des peptides trypsiques communment utiliss en protomique. Nanmoins, la fragmentation par dcomposition induite par collision plus haute nergie (HCD) propose par le spectromtre LTQ-Orbitrap Velos amliore la fragmentation et fournit une haute rsolution qui permet dobtenir une meilleure confiance dans lidentification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet deffectuer le squenage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifis par les recherches utilisant des bases de donnes. La comparaison des programmes de squenage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en vidence que le dernier permet didentifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intgr dans une chane de traitement de recherche dantignes mineurs dhistocompatibilit. Enfin, une base de donnes contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a t dveloppe.
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L'interleukine-15 (IL-15) contribue au dveloppement et lactivation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont t impliques dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclrose en plaques. Des niveaux levs de l'IL-15 ont t trouvs chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux tmoins, mais aucune tude n'a examin les effets de tels niveaux levs sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre tude taient 1- de caractriser lexpression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de dterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- dvaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modles murins de la sclrose en plaques. Nous avons tabli que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont t significativement augmentes lors des co-cultures avec des cellules B alloractives exprimant l'IL-15. Dans les modles murins de la sclrose en plaques, nous avons dtect au sein du systme nerveux central des cellules immunes exprimant lIL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le rcepteur pour cette cytokine diffrents stades de la maladie. Nous avons dmontr que les cellules B modulent des rponses des lymphocytes T CD8 via lIL-15, ce qui suggre un rle pour les cellules B dans la pathogense de la sclrose en plaques. Nous avons aussi mis en vidence la prsence de cellules exprimant lIL-15 dans le systme nerveux central dans des modles murins de cette maladie.
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La sclrose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire dmylinisante et neurodgnrative du systme nerveux central (SNC). Les cellules T actives qui expriment le PD-1 sont inhibes via linteraction avec lun des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des tudes effectues chez le modle murin de la SEP, lencphalomylite auto-immune exprimentale (EAE), ont dmontr que linteraction du PD-1 avec ses ligands contribue attnuer la maladie. Toutefois, le rle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogense de la SEP chez lhumain et dans le modle murin na pas t compltement lucid. Nous avons dtermin que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de faon significative cette expression en rponse des cytokines inflammatoires. Le blocage de lexpression du PD-L1 par les astrocytes laide de siRNA spcifiques mne laugmentation significative des rponses des cellules T CD8+ (prolifration, cytokines, enzymes lytiques). Nos rsultats tablissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les rponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus crbraux post-mortem par immunohistochimie dmontre que dans les lsions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus levs que dans les tissus de tmoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moiti des lymphocytes T CD8+ ayant infiltr des lsions de SEP nexpriment pas le rcepteur PD-1. Au cours du dveloppement de lEAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprim par les cellules T ds le dbut des symptmes, mais son intensit diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoy par le PD-L1. Nous avons observ que les cellules endothliales humaines formant la barrire hmato-encphalique (BHE) expriment de faon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que lexpression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprims par les cellules endothliales ont la capacit de freiner lactivation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration travers la BHE. Lendothlium du cerveau des tissus normaux et des lsions SEP nexprime pas des taux dtectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moiti de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lsions SEP. Nos travaux dmontrent que lentre des cellules T actives est contrle dans des conditions physiologiques grce la prsence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, lexpression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lsions SEP nuit au contrle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ tant dpourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprim par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester actives.
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Le virus de lhpatite C (VHC) infecte ~185 millions dindividus dans le monde. Malgr le dveloppement des nouvelles thrapies diriges contre le VHC, on compte deux millions de nouvelles infections chaque anne, en particulier dans les pays sous-dvelopps et les populations marginalises. Comme pour la plupart des virus infection chronique, le dveloppement dun vaccin prophylactique efficace est limit par le manque de caractrisation des dterminants de la mmoire immunitaire protectrice lors des pisodes de rinfection naturelle chez les tres humains. Le VHC reprsente un modle unique au sein des virus infection chronique pour tudier limmunit protectrice. En effet ~30% des patients infects par le VHC peuvent tre guris suite un premier pisode dinfection spontanment. Dans cette thse, nous avons tudi limmunit protectrice contre le VHC dans une cohorte dutilisateurs de drogues par injection qui sont risque dtre infects ou rinfects. Notre hypothse est que la majorit des patients qui ont rsolu une premire infection par le VHC sont protgs contre le dveloppement dune infection chronique sils sont rexposs. Cette immunit protectrice est associe la prsence des cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles qui possdent des frquences, magnitudes et avidits leves. La capacit protectrice des cellules T mmoire contre les squences variables du VHC est dpendante de la diversit et flexibilit du rpertoire de leurs rcepteurs de cellules T (TCR), qui reconnaissent les squences variables des pitopes cibls. Notre premier objectif tait de dfinir et dtailler les dterminants de limmunit protectrice confre par les cellules T spcifiques du VHC. Nos rsultats ont montr que la protection pendant lpisode de rinfection tait associe une augmentation de la magnitude et du spectre des rponses spcifiques par les cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles, ainsi que par lapparition dune population de cellules T ttramre+ CD8+ effectrices qui expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) lors du pic de la rponse. Chez les patients qui ont dvelopp une infection chronique pendant lpisode de rinfection, nous avons observ une expansion trs limite des cellules T CD4 et CD8. Le squenage des pitopes cibls par les cellules T CD8 chez ces patients qui sont non-protgs a montr que les squences de ces pitopes sont diffrentes des squences de rfrence qui taient utilises pour tous les essais immunologiques de cette tude. Le deuxime objectif tait danalyser la dynamique du rpertoire des TCRs des cellules T CD8 spcifiques chez les patients protgs versus les patients non-protgs. Nos rsultats ont montr que le rpertoire des cellules T CD8 spcifiques est plus focalis que chez les patients protgs. En plus, nous avons observ que les clonotypes qui forment le rpertoire chez les patients protgs sont distincts de ceux chez les patients non-protgs. Ces clonotypes chez les patients protgs ont montr de plus grandes avidit et polyfonctionnalit que leurs homologues chez les patients non-protgs. En conclusion, nos rsultats suggrent que la protection contre le dveloppement dune infection chronique pendant lpisode de rinfection par le VHC est associe une augmentation de la magnitude, du spectre et de la fonctionnalit des rponses des cellules T spcifiques, ainsi qu un rpertoire des TCRs plus focalis compos des clonotypes distincts qui possdent de plus grandes avidit et polyfonctionnalit que chez les patients non-protgs. Lhomologie des squences des souches virales entre les diffrents pisodes de linfection est un dterminant majeur de ltablissement dune protection efficace. Ces rsultats ont donc des implications trs importantes pour le dveloppement dun vaccin prophylactique contre le VHC et dautres virus infection chronique.
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Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays dvelopps. Lautoimmunit rsulte de la rupture des mcanismes de tolrance du systme immunitaire vis--vis des autoantignes exprims par les tissus de lorganisme, entranant la destruction dun ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. Lhpatite autoimmune et le diabte autoimmun se caractrisent par la destruction slective des hpatocytes et des cellules beta pancratiques, respectivement. De plus en plus darguments suggrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le dclenchement, la progression et la rgulation des rponses associes plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi lvolution de clones de lymphocytes T CD8+ spcifiques un antigne particulier dont le site dexpression diffrait. Pour ce faire, nous avons dvelopp deux nouveaux modles murins double transgniques par croisement entre une ligne de souris exprimant un TCR transgnique spcifique la nucloprotine (NP) du virus de la choriomningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hpatocytes (modle dhpatite autoimmune), ou 2) simultanment dans le thymus et le pancras (modle de diabte autoimmun). Lavidit fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spcifiques la NP chez les souris TCR transgniques tait inversement proportionnelle au niveau dexpression du TCR. Le rpertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang priphrique a t caractris pour chacune des lignes de souris double transgniques, de mme que la capacit fonctionnelle et le phnotype (marqueurs dactivation/mmoire) des lymphocytes T CD8+ autoractifs. Chacun des deux nouveaux modles prsents dans cette tude ont montr que les lymphocytes T CD8+ spcifiques la NP sont aptes briser la tolrance centrale et priphrique et provoquer une raction dautoimmunit spontane. Dans le modle dhpatite autoimmune, o lexpression de lautoantigne tait restreinte au foie, la surexpression du TCR transgnique a entran une dltion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spcifiques la NP prvenant le dveloppement dune hpatite spontane. alors quun niveau de TCR comparable celui dune souris de type sauvage a permis une slection positive des lymphocytes autoractifs qui se sont accumuls dans le foie o ils se sont activs pour provoquer une hpatite autoimmune spontane. Dans le modle de diabte autoimmun, o lautoantigne tait exprim dans le pancras et le thymus, les souris des deux lignes double transgniques ont montr une dltion thymique partielle, peu importe le niveau dexpression du TCR. Seuls les mles adultes dveloppaient un diabte spontan et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulire de marqueurs dactivation/mmoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire tait absente chez les souris femelles et les mles sains. Ltude de la tolrance des lymphocytes T CD8+ autoractifs dans nos deux nouveaux modles murins double transgniques a permis didentifier des mcanismes alternatifs possiblement impliqus dans la tolrance et lactivation, et de mieux comprendre le rle des lymphocytes T CD8+ autoractifs dans le processus autoimmun menant lhpatite autoimmune et au diabte autoimmun. Ces dcouvertes seront utiles pour dvelopper de nouvelles approches thrapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoractifs.
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Chez la souris, la thrapie anti-HER2 est dpendante de la prsence de cellules T CD8+IFN-+ et des rponses IFN de type I. Ces IFN sont induits par les TLRs suite la reconnaissance de signaux de danger, appels PAMPs et DAMPs. Les TLR-3 et TLR-9 sont tous deux de bons inducteurs dIFN de type I et sont galement capable dagir en synergie afin daugmenter les niveaux dIFN-, de TNF- et dIL-12. Notre hypothse fut que la stimulation de ces deux TLRs mnerait lamlioration de lactivit anti-tumorale du trastuzumab via le recrutement et lactivation des cellules immunitaires. Nos buts furent de confirmer le potentiel thrapeutique de la combinaison de lanticorps anti-HER2, de lagoniste de TLR-3, le poly(I:C), et de lagoniste de TLR-9, le CpG ODN. Des tudes in vivo et in vitro nous ont permis de dcouvrir une synergie entre ces agents qui rsulte en une cytotoxicit cible plus efficace. De plus, cette thrapie savra efficace chez des modles CD8-dpendants et CD8-indpendents. Les souris purent rejeter leur tumeur et demeurer sains plusieurs semaines aprs larrt des injections. Ces souris taient galement protges lors dun challenge, soulignant ainsi la prsence dune immunit mmoire. Nous avons aussi dcouvert que ladministration combine de trastuzumab des deux agonistes de TLRs mne des rponses systmiques. Des tudes de dpltion confirmrent que les cellules T CD8+ sont cruciales pour la protection long terme des animaux, mais que les pDC sont moins impliques que ce que lon pourrait croire. Leur absence na que modestement affect les effets de notre thrapie. loppos, les cellules NK sont dimportants mdiateurs des effets thrapeutiques. Des expriences dADCC ont rvl que le CpG ODN et poly(I:C) ont tous deux la capacit damliorer les fonctions des cellules NK, mais que la stimulation simultane des TLR-3 et TLR-9 permet de maximiser les effets bnfiques du trastuzumab. De la mme manire, laddition de CpG ODN et de poly(I:C) aux anticorps anti-HER2 a permis daugmenter les rponses pro-inflammatoires, plus spcifiquement lIFN-, le TNF-, lIP-10 et lIL-12.
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La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) constitue un traitement de choix pour une multitude de pathologies hmatologiques malignes et non malignes chez lenfant et dans certains cas ladulte. La TSCO est associe certaines complications, dont une reconstitution immunitaire plus lente et une incidence leve dinfections opportunistes, notamment celles relies au cytomgalovirus (CMV) et au virus varicella-zoster (VZV). Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intresss dans un premier temps la caractrisation de la reconstitution immunitaire spcifique au CMV et au VZV. Nos rsultats ont dmontr que la reconstitution de limmunit cellulaire ne requiert ni un statut sropositif pr-transplantation ni le dveloppement de la maladie. De plus, des reconstitutions spontanes ont t dtectes chez certains patients srongatifs vis--vis du CMV ou du VZV. Outre le fait quelle se manifeste surtout partir de 6 mois post-transplantation, ladite reconstitution mrite le qualificatif de protectrice en termes de ractivations virales et du dveloppement de signes cliniques lorsquune frquence de 150 cellules produisant lIFN-/million est dpasse. Toutefois, moins de 5% des patients dveloppent une rponse T anti-VZV et anti-CMV au cours 100 premiers jours suivant la TSCO. Il est donc possible que les lymphocytes CD8+ T provenant du SCO, comparativement leurs homologues provenant de la moelle osseuse (MO), prsentent un dfaut de fonctionnalit, communment appel puisement clonal . La caractrisation du rpertoire de rcepteurs inhibiteurs exprims par les cellules T CD8+ suivant la TSCO ou la transplantation de moelle osseuse (TMO) a rvl une augmentation significative de la frquence des cellules exprimant PD-1 tt suivant la transplantation. Cette population, caractrise majoritairement par un phnotype effecteur-mmoire (EM), dmontre une perte significative de la capacit prolifrative et exprime moins d'IFN-, d'IL-2, de TNF- et de CD107a. Une meilleure caractrisation de la reconstitution immunitaire aprs TSCO permettrait, d'une part de slectionner des biomarqueurs en vue dune meilleure gestion des patients risques de dvelopper des infections virales et/ou de rechuter, et d'autre part d'amliorer leur pronostic.
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Drak2 est un membre de la famille des protines associes la mort et cest une srine/thronine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne prsentent aucune dfectuosit apparente en apoptose induite par activation, aprs stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation rduit, compares aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre tude, lanalyse dhybridation in situ a rvl que lexpression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie dune expression plus focale dans les divers organes pendant la priode prinatale et lge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la mdullaire surrnale, lestomac, la peau et les testicules. Nous avons cr des souris transgniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularit et leur poids splniques taient infrieurs compar aux souris de type sauvage. Aprs activation TCR, la rponse prolifrative des cellules T Tg Drak2 tait normale, mme si leur production dinterleukine (IL)-2 et IL-4 mais non dinterfron-r tait augmente. Les cellules T Tg Drak2 actives ont dmontr une apoptose significativement accrue en prsence dIL-2 exogne. Au niveau molculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifest une augmentation moins leve des facteurs anti-apoptotiques durant lactivation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnrables aux attaques subsquentes dIL-2. Lapoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a t associe un nombre rduit de cellules T ayant le phnotype des cellules mmoires (CD62Llo) et avec des ractions secondaires rprimes des cellules T dans lhypersensibilit de type diffr. Ces rsultats dmontrent que Drak2 sexprime dans le compartiment des cellules T mais nest pas spcifique aux cellules T; et aussi quil joue des rles dterminants dans lapoptose des cellules T et dans le dveloppement des cellules mmoires T. En outre, nous avons recherch le rle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabte. LARNm et la protine Drak2 ont t rapidement induits dans les cellules beta de llot aprs stimulation exogne par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est prsente de faon endogne dans le diabte, quil soit de type 1 ou de type 2. La rgulation positive de Drak2 a t accompagne dune apoptose accrue des cellules beta. Lapoptose des cellules beta provoque par les stimuli en question a t inhibe par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a men lapoptose aggrave des cellules beta dclenche par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les lots a compromis laugmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expriences in vivo ont dmontr que les souris Tg Drak2 taient sujettes au diabte de type 1 dans un modle de diabte provoqu par de petites doses multiples de streptozotocine et quelles taient aussi sujettes au diabte de type 2 dans un modle dobsit induite par la dite. Nos donnes montrent que Drak2 est dfavorable la survie des cellules beta. Nous avons aussi tudi la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouv que Drak2 purifie pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entran laugmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que labaissement de Drak2 dans ces cellules a rduit la phosphorylation. Ces recherches mcanistes ont prouv que p70S6 kinase tait vritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette tude a dcouvert les fonctions importantes de Drak2 dans lhomostasie des cellules T et le diabte. Nous avons prouv que p70S6 kinase tait un substrat de Drak2. Nos rsultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 lintrieur des systmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rles de Drak2 dans le dveloppement des cellules mmoires T et la survie des cellules beta pourraient tre explores pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabte.
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Le diabte auto-immun rsulte de la destruction des cellules bta pancratiques scrtrices dinsuline par les lymphocytes T du systme immunitaire. Il sensuit une dficience hormonale qui peut tre comble par des injections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, toutefois il demeure ce jour impossible de gurir les patients atteints de la maladie. De faon gnrale, un systme immunitaire sain reconnat une multitude dantignes diffrents et assure ainsi notre dfense lgard de diffrents pathognes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons gntiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent sactiver de faon aberrante suite la reconnaissance dantignes provenant du soi. Cest ce bris de tolrance qui mne au dveloppement de pathologies auto-immunes telles que le diabte auto-immun. Afin de limiter lauto-immunit, des mcanismes de slection stricts permettent dliminer la majorit des lymphocytes T prsentant une forte affinit envers des antignes du soi lors de leur dveloppement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes russissent toutefois chapper lapoptose et migrent en priphrie afin dy circuler en qute dun antigne spcifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mcanismes priphriques assurent le maintien de la tolrance immunitaire en faisant obstacle lactivation et la prolifration des lymphocytes T auto-ractifs. Lune des avenues afin dinhiber le dveloppement de rponses immunitaires aberrantes est la gnration de lymphocytes T rgulateurs. Ces cellules, dorigine thymique ou priphrique, peuvent arborer diffrents phnotypes et agissent via de multiples mcanismes afin dinactiver et/ou liminer les cellules impliques dans lapparition de pathologies auto-immunes. Lutilisation de modles murins transgniques a permis la mise en vidence dune population peu caractrise de lymphocytes T au potentiel rgulateur. En effet, la proportion de ces cellules T nexprimant pas les corcepteurs CD4 et CD8 (double ngatives, DN) a t inversement corrle la prdisposition lauto-immunit chez ces ii souris. Lobjectif principal de cette thse est de dmontrer la fonction immuno-rgulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs gntiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observ que les lymphocytes T DN exercent une activit cytotoxique lgard des lymphocytes B de faon spcifique lantigne, via la libration de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons tabli quun unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin dinhiber le dveloppement du diabte auto-immun chez des htes transgniques prdisposs la maladie. Le recours des souris dficientes pour lexpression du gne CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prdisposition au diabte auto-immun Idd13, qui contient le gne Sirp, a t identifi pour son rle dans la rgulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse gntique a rvl que dautres intervalles gntiques sont impliqus dans le contrle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situ en rgion proximale du chromosome 12 a t valid grce la cration de souris congniques. Grce aux rsultats prsents dans cette thse, notre comprhension de la biologie ainsi que de la rgulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la cration de thrapies cellulaires novatrices permettant de prvenir et de gurir diverses pathologies auto-immunes.
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La tolrance immunitaire dpend de la distinction entre le soi et le non soi par le systme immunitaire. Un bris dans la tolrance immunitaire mne l'auto-immunit, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du systme nerveux central. Le diabte auto-immun, galement connu sous le nom diabte juvnile et diabte de type 1, rsulte d'une attaque auto-immune sur les cellules pancratiques scrtrices dinsuline, localises au niveau des lots de Langerhans du pancras. Bien que le diabte auto-immun soit traitable par une combinaison dinjections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, de rgime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limites , la ccit, les maladies cardiovasculaires, linsuffisance rnale et l'amputation. En raison des nombreuses complications lies au diabte auto-immun long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqus dans la progression de la maladie dans le but de dvelopper de nouvelles thrapies qui empcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rle primordial dans la gnration et l'entretien de la tolrance immunitaire a t attribu au nombre et la fonction des sous-populations de cellules rgulatrices. Une de ces populations est constitue de cellules T CD4-CD8- (double ngatives, DN), qui ont t tudies chez la souris et l'humain pour leur contribution la tolrance priphrique, la prvention des maladies et pour leur potentiel associ la thrapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intrt thrapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorgulateur antigne-spcifique dans divers cadres exprimentaux, y compris la prvention du diabte auto-immun. Dailleurs, en utilisant un systme transgnique, nous avons dmontr que les souris prdisposes au diabte auto-immun prsentent peu de cellules T DN, et que ce phnotype contribue la susceptibilit au diabte auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empcher la progression vers le diabte chez les souris prdisposes au diabte auto-immun. Ces rsultats suggrent que les cellules T DN puissent prsenter un intrt thrapeutique pour les patients diabtiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces rsultats en utilisant un modle non-transgnique, qui est plus physiologiquement comparable l'humain. L'objectif principal de cette thse est de dfinir la fonction immunorgulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thrapeutique de celles-ci dans la prvention du diabte auto-immun chez un modle non-transgnique. Dans cette thse, on dmontre que les souris rsistantes au diabte auto-immun prsentent une proportion et nombre absolu plus levs de cellules T DN non-transgniques, lorsque compares aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilit la maladie. On observe que les cellules T DN liminent les cellules B actives in vitro par une voie dpendante de la voie perforine et granzyme, o la fonction des cellules T DN est quivalente entre les souris rsistantes et prdisposes au diabte auto-immun. Ces rsultats confirment que l'association au diabte auto-immun est due une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutt qu une dficience fonctionnelle. On dmontre que les cellules T DN non-transgniques liminent des cellules B charges avec des antignes d'lots, mais pas des cellules B charges avec un antigne non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on tablit que le transfert des cellules T DN actives peut empcher le dveloppement du diabte auto-immun dans un modle de souris non-transgnique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux lots pancratiques, et subissent une activation et une prolifration prfrentielles au niveau des ganglions pancratiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entrane une diminution d'auto-anticorps spcifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les lots, ce qui corrle avec les rsultats dcrits ci-dessus. Les rsultats prsents dans cette thse permettent de dmontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel li la thrapie cellulaire pour le diabte auto-immun.
