Impact du genre et du modèle sur les mécanismes d’épileptogénèse dans le cerveau immature

Les modèles kainate et pentylènetétrazole représentent deux modèles d’épilepsie du lobe temporal dont les conséquences à long terme sont différentes. Le premier est un modèle classique d’épileptogénèse avec crises récurrentes spontanées tandis que le second se limite aux crises aigües. Nous avons d’abord caractérisé les différents changements survenant dans les circuits excitateurs et inhibiteurs de l’hippocampe adulte de rats ayant subi des crises à l’âge immature. Ensuite, ayant observé dans le modèle fébrile une différence du pronostic lié au genre, nous avons voulu savoir si cette différence était aussi présente dans des modèles utilisant des neurotoxines. L’étude électrophysiologique a démontré que les rats KA et PTZ, mâles comme femelles, présentaient une hyperactivité des récepteurs NMDA au niveau des cellules pyramidales du CA1, CA3 et DG. Les modifications anatomiques sous-tendant cette hyperexcitabilité ont été étudiées et les résultats ont montré une perte sélective des interneurones GABAergiques contenant la parvalbumine dans les couches O/A du CA1 des mâles KA et PTZ. Chez les femelles, seul le DG était légèrement affecté pour les PTZ tandis que les KA présentaient, en plus du DG, des pertes importantes au niveau de la couche O/A. Les évaluations cognitives ont démontré que seuls les rats PTZ accusaient un déficit spatial puisque les rats KA présentaient un apprentissage comparable aux rats normaux. Cependant, encore une fois, cette différence n’était présente que chez les mâles. Ainsi, nos résultats confirment qu’il y a des différences liées au genre dans les conséquences des convulsions lorsqu’elles surviennent chez l’animal immature.

Expression profile of plasticity-related mRNAs in the cortex and hippocampus of young and aged rats and of 3xTg and wild type mice

De récents travaux ont mis en évidence que des dysfonctionnements dans l’expression de gènes impliqués dans la plasticité synaptique contribuent aux déclins cognitifs qu’on observe chez les gens âgés et à la progression de la maladie d’Alzheimer. Notre étude avait comme objectif d’étudier le profil d’expression d’ARNm spécifiques impliqués dans la plasticité synaptique chez des rats jeunes et âgés et chez des souris transgéniques 3xTg et WT. Des expériences en qRT-PCR ont été effectuées dans des extraits de cortex et d’hippocampe de rats jeunes et âgés et de souris 3xTg et WT, respectivement. Les résultats ont démontré une augmentation significative de l’expression d’ARNm MAP1B, Stau2, BDNF, CREB et AGO2 principalement dans l’hippocampe (régions CA1-CA3) des souris 3xTg comparé aux souris WT. Une diminution significative a également été observée pour l’ARNm αCaMKII dans le cortex des souris 3xTg comparé aux souris WT. Contrairement à ces observations, aucun changement n’a été observé pour l’expression de gènes impliqués dans la plasticité synaptique chez les rats âgés comparé aux rats jeunes. Ces résultats démontrent qu’un dysfonctionnement existe réellement au début de la maladie d’Alzheimer dans l’expression de gènes spécifiques impliqués dans la plasticité synaptique et contribue potentiellement à la progression de la maladie en engendrant un déséquilibre entre la LTP et la LTD. De plus, les différences d’expressions sont particulièrement observées dans l’hippocampe (régions CA1-CA3) ce qui est consistant avec les études sur la progression de la maladie d’Alzheimer puisqu’il est connu que la région CA1 de l’hippocampe est la plus vulnérable à l’apparition de la maladie. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des événements moléculaires qui deviennent dérégulés à l’apparition de la maladie d’Alzheimer.

Implication de Syngap1 dans la transmission GABAergique et la plasticité synaptique

La déficience intellectuelle affecte de 1 à 3% de la population mondiale, ce qui en fait le trouble cognitif le plus commun de l’enfance. Notre groupe à découvert que des mutations dans le gène SYNGAP1 sont une cause fréquente de déficience intellectuelle non-syndromique, qui compte pour 1-3% de l’ensemble des cas. À titre d’exemple, le syndrome du X fragile, qui est la cause monogénique la plus fréquente de déficience intellectuelle, compte pour environ 2% des cas. Plusieurs patients affectés au niveau de SYNGAP1 présentent également des symptômes de l’autisme et d’une forme d’épilepsie. Notre groupe a également montré que SYNGAP1 cause la déficience intellectuelle par un mécanisme d’haploinsuffisance. SYNGAP1 code pour une protéine exprimée exclusivement dans le cerveau qui interagit avec la sous-unité GluN2B des récepteurs glutamatergique de type NMDA (NMDAR). SYNGAP1 possède une activité activatrice de Ras-GTPase qui régule négativement Ras au niveau des synapses excitatrices. Les souris hétérozygotes pour Syngap1 (souris Syngap1+/-) présentent des anomalies de comportement et des déficits cognitifs, ce qui en fait un bon modèle d’étude. Plusieurs études rapportent que l’haploinsuffisance de Syngap1 affecte le développement cérébral en perturbant l’activité et la plasticité des neurones excitateurs. Le déséquilibre excitation/inhibition est une théorie émergente de l’origine de la déficience intellectuelle et de l’autisme. Cependant, plusieurs groupes y compris le nôtre ont rapporté que Syngap1 est également exprimé dans au moins une sous-population d’interneurones GABAergiques. Notre hypothèse était donc que l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones contribuerait en partie aux déficits cognitifs et au déséquilibre d’excitation/inhibition observés chez les souris Syngap1+/-. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré un modèle de souris transgéniques dont l’expression de Syngap1 a été diminuée uniquement dans les interneurones dérivés des éminences ganglionnaires médianes qui expriment le facteur de transcription Nkx2.1 (souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1). Nous avons observé une diminution des courants postsynaptiques inhibiteurs miniatures (mIPSCs) au niveau des cellules pyramidales des couches 2/3 du cortex somatosensoriel primaire (S1) et dans le CA1 de l’hippocampe des souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1. Ces résultats supportent donc l’hypothèse selon laquelle la perte de Syngap1 dans les interneurones contribue au déséquilibre d’excitation/inhibition. De manière intéressante, nous avons également observé que les courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSCs) étaient augmentés dans le cortex S1, mais diminués dans le CA1 de l’hippocampe. Par la suite, nous avons testé si les mécanismes de plasticité synaptique qui sous-tendraient l’apprentissage étaient affectés par l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones. Nous avons pu montrer que la potentialisation à long terme (LTP) NMDAR-dépendante était diminuée chez les souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1, sans que la dépression à long terme (LTD) NMDAR-dépendante soit affectée. Nous avons également montré que l’application d’un bloqueur des récepteurs GABAA renversait en partie le déficit de LTP rapporté chez les souris Syngap1+/-, suggérant qu’un déficit de désinhibition serait présent chez ces souris. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de Syngap1 dans les interneurones qui contribue aux déficits observés chez les souris affectées par l’haploinsuffisance de Syngap1.

Identification des canaux TRPC impliqués dans la potentialisation à long terme des interneurones de la région CA1 de l'hippocampe chez le rat

Le réseau neuronal de l’hippocampe joue un rôle central dans la mémoire en modifiant de façon durable l’efficacité de ses synapses. Dans les interneurones de la couche oriens/alveus (O/A), l’induction de la potentialisation à long terme (PLT) requiert les courants postsynaptiques excitateurs évoqués par les récepteurs métabotropes du glutamate de sous-type 1a (CPSEmGluR1a) et l’entrée subséquente de Ca2+ via des canaux de la famille des transient receptor potential (TRP). Le but de ce projet était d’identifier les canaux TRP responsables des CPSEmGluR1a et d’explorer les mécanismes moléculaires régulant leur ouverture. Nous avons déterminé par des enregistrements électrophysiologiques que les CPSEmGluR1a étaient spécifiques aux interneurones O/A et qu’ils étaient indépendants de la phospholipase C. Nous avons ensuite examiné l’expression des TRPC et leur interaction avec mGluR1a par les techniques de RT-PCR, d’immunofluorescence et de co-immunoprécipitation. Nos résultats montrent que TRPC1 et mGluR1a s’associent dans l’hippocampe et que ces deux protéines sont présentes dans les dendrites des interneurones O/A. En revanche, TRPC4 ne semble s’associer à mGluR1a qu’en système recombinant et leur colocalisation paraît limitée au corps cellulaire. Finalement, nous avons procédé à des enregistrements d’interneurones dans lesquels l’expression des TRPC a été sélectivement supprimée par la transfection d’ARN interférant et avons ainsi démontré que TRPC1, mais non TRPC4, est une sous-unité obligatoire du canal responsable des CPSEmGluR1a. Ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de la transmission synaptique des interneurones O/A et de mettre en évidence un rôle potentiel de TRPC1 dans la PLT.

Rôle des récepteurs glutamatergiques dans l'activité épileptiforme des interneurones inhibiteurs de l'hippocampe

Les patients atteints d'épilepsie du lobe temporal (TLE) ainsi que les rats injectés à l'acide kaïnique (KA) exhibent des patrons pathophysiologiques similaires de crises, de sclérose de l'hippocampe et de perte de certains types neuronaux. Parmi les cellules atteintes dans le modèle KA du TLE on retrouve certains interneurones inhibiteurs du CA1. En effet, certains interneurones des couches oriens et alveus (O/A-IN) meurent suite à une injection de KA chez le rat, contrairement aux interneurones à la bordure des couches radiatum et lacunosum/moleculare (R/LM-IN) de la même région. Bien que cette perte soit empêchée par des antagonistes des récepteurs glutamatergiques métabotropes de groupe I (mGluR1/5), la cause de cette perte sélective des O/A-INs reste à être précisée. Au cours des travaux de cette thèse, nous avons effectué des enregistrements de patch-clamp en configuration cellule-entière en modes courant- et voltage-imposé couplés à l'imagerie calcique pour étudier les causes de la vulnérabilité sélective des O/A-INs dans ce modèle. Dans un premier temps, nous avons évalué les effets d'une application aiguë de KA sur les propriétés membranaires et calciques pour voir s'il y avait des différences entre les O/A-INs et R/LM-INs qui pourraient expliquer la vulnérabilité. Nos résultats montrent que les dépolarisations et variations de résistance d'entrée ainsi que les augmentations de calcium intracellulaire, dépendantes principalement des récepteurs -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxasole propionic acid (AMPA), sont similaires entre les deux types d'interneurones suite à des applications aigües de KA. Ceci indique que l'effet aigu du KA sur les interneurones ne serait pas la cause de la vulnérabilité des O/A-INs. Dans un second temps nous avons comparé l'implication des sous-types de récepteurs mGluR1 et 5 dans l'activité épileptiforme des deux types d'interneurones évoquée dans un modèle de tranche désinhibée. Dans ce cas, nos données montrent un rôle important des mGluR1 et 5 activés synaptiquement lors des décharges épileptiformes et ce, de manière spécifique aux O/A-INs. Les courants synaptiques sous-tendant ces décharges impliquent des récepteurs ionotropes et métabotropes du glutamate. En présence d'antagonistes des récepteurs ionotropes glutamatergiques, les courants synaptiques sont biphasiques et formés de composantes rapide et lente. Les récepteurs mGluR1 et 5 sont différemment impliqués dans ces composantes: les mGluR5 étant impliqués dans les composantes rapide et lente, et les mGluR1 que dans la composante lente. Ces résultats indiquent que les mGluR1 et 5 contribuent différemment à l'activité épileptiforme, et spécifiquement dans les O/A-INs, et pourraient donc être impliqués dans la vulnérabilité sélective de ces interneurones dans le modèle KA.

Increased expression of "peripheral-type" benzodiazepine receptors in human temporal lobe epilepsy: implications for PET imaging of hippocampal sclerosis.

Increased binding sites for "peripheral-type" benzodiazepine receptor (PTBR) ligands have been described in a wide range of neurological disorders including both human and experimental epilepsy. This study was undertaken to assess PTBR expression in relation to the presence of hippocampal sclerosis in human temporal lobe epilepsy (TLE). For this purpose, hippocampal CA1 subfields were dissected from surgical samples from patients with therapy-refractive TLE with (n = 5) or without (n = 2) hippocampal sclerosis and from age-matched nonepileptic postmortem controls (n = 5). PTBR expression was assessed by immunohistochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction. Receptor sites were evaluated using an in vitro binding assay and the selective PTBR ligand [3H]PK11195. Epileptic patients with hippocampal sclerosis showed increases in PTBR binding sites, immunoreactivity, and mRNA expression compared to both nonsclerotic TLE patients and postmortem nonepileptic controls. Induction of PTBR expression and binding sites were directly correlated with the presence of hippocampal sclerosis and the accompanying reactive gliosis.

Induction of astrocytic cyclooxygenase-2 in epileptic patients with hippocampal sclerosis.

Induction of cyclooxygenase-2 (COX-2) has been described in a wide range of neurological diseases including animal models of epilepsy. The present study was undertaken to assess COX-2 expression in hippocampal biopsies from patients with therapy-refractive temporal lobe epilepsy (TLE). For this purpose, hippocampal CA1 subfield was dissected from epileptic patients with (n=5) or without (n=2) hippocampal sclerosis (HS). COX-2 expression was investigated using immunohistochemistry and semi-quantitative RT-PCR. COX-2 immunoreactivity in TLE patient material in the absence of HS was restricted to a few neurons of the hippocampus. In the presence of HS, on the other hand, a significant induction of astrocytic COX-2 immunoreactivity associated with a concomitant increase in the steady-state level of COX-2 mRNA was observed in the CA1 subfield. These findings suggest that induction of astrocytic COX-2 is implicated in the pathogenesis of HS in TLE and is consistent with the previous findings of increased concentrations of prostaglandins in the cerebrospinal fluid of these patients.

Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces. Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques. Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs. Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique.