Contribution of the C-terminal tri-lysine regions of human immunodeficiency virus type 1 integrase for efficient reverse transcription and viral DNA nuclear import

Affiliation: Zhujun Ao, Éric Cohen & Xiaojian Yao : Département de microbiologie et immunologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal

Le fragment LG3 du perlécan : un nouveau régulateur de remodelage vasculaire en transplantation

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation

Potential use of a recombinant replication-defective adenovirus vector carrying the C-terminal portion of the P97 adhesin protein as a vaccine against Mycoplasma hyopneumoniae in swine.

Mycoplasma hyopneumoniae causes severe economic losses to the swine industry worldwide and the prevention of its related disease, enzootic porcine pneumonia, remains a challenge. The P97 adhesin protein of M. hyopneumoniae should be a good candidate for the development of a subunit vaccine because antibodies produced against P97 could prevent the adhesion of the pathogen to the respiratory epithelial cells in vitro. In the present study, a P97 recombinant replication-defective adenovirus (rAdP97c) subunit vaccine efficiency was evaluated in pigs. The rAdP97c vaccine was found to induce both strong P97 specific humoral and cellular immune responses. The rAdP97c vaccinated pigs developed a lower amount of macroscopic lung lesions (18.5 ± 9.6%) compared to the unvaccinated and challenged animals (45.8 ± 11.5%). rAdP97c vaccine reduced significantly the severity of inflammatory response and the amount of M. hyopneumoniae in the respiratory tract. Furthermore, the average daily weight gain was slightly improved in the rAdP97c vaccinated pigs (0.672 ± 0.068 kg/day) compared to the unvaccinated and challenged animals (0.568 ± 0.104 kg/day). A bacterin-based commercial vaccine (Suvaxyn® MH-one) was more efficient to induce a protective immune response than rAdP97c even if it did not evoke a P97 specific immune response. These results suggest that immunodominant antigens other than P97 adhesin are also important in the induction of a protective immune response and should be taken into account in the future development of M. hyopneumoniae subunit vaccines.

La fibrose en deux parties : de la paillasse à la souris

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique. En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique. Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF. Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-.

Neurotensinergic modulation of glutamatergic neurotransmission in VTA neurons.

L’aire tegmentaire ventrale (VTA) contient une forte densité de terminaisons neurotensinergiques ainsi que des récepteurs à la surface des neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques. Le VTA a été impliqué dans des maladies comme la schizophrénie, les psychoses et l’abus de substance. Les drogues d’abus sont connues pour induire le phénomène de sensibilisation - un processus de facilitation par lequel l’exposition à un stimulus produit une réponse augmentée lors de l’exposition subséquente au même stimulus. La sensibilisation se développe dans le VTA et implique mécanismes dopaminergiques et glutamatergiques. Il a été montré que les antagonistes neurotensinergiques bloquaient le développement de la sensibilisation et certains mécanismes de récompense et ces effets pourraient être médiés indirectement par une modulation de la neurotransmission glutamatergique. Cependant, on connaît peu les mécanismes de modulation de la transmission glutamatergique par la neurotensine (NT) dans le VTA. Le but de la présente thèse était d’étudier la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique du patch clamp dans la cellule entière dans des tranches horizontales du VTA pour étudier les effets de différents agonistes et antagonistes neurotensinergiques. Les neurones ont été identifié comme Ih+ (présumés dopaminergiques) ou Ih- (présumés non-dopaminergiques) selon qu’ils exprimaient ou non un courant cationique activé par l’hyperpolarisation (Ih). Des techniques d’immunocytochimie ont été utilisées pour marquer les neurones et vérifier leur localisation dans le VTA. Dans une première étude nous avons trouvé que la neurotensine indigène (NT1-13) ou son fragment C-terminal, NT8-13, induisait une augmentation comparable des courants postsynaptiques excitateurs glutamatergiques (CPSEs) dans les neurones Ih+ ou Ih- du VTA. L'augmentation induite dans les neurones Ih+ par la NT8-13 a été bloquée par le SR48692, un antagoniste des récepteurs NTS1, et par le SR142948A, un antagoniste des récepteurs NTS1 et NTS2, suggérant que l'augmentation était médiée par l’activation des récepteurs NTS1. Dans les neurones Ih- l'augmentation n’a été bloquée que par le SR142948A indiquant une implication des récepteurs NTS2. Dans une deuxième étude, nous avons testé les effets de la D-Tyr[11]NT (un analogue neurotensinergique ayant différentes affinités de liaison pour les sous-types de récepteurs neurotensinergiques) sur les CPSEs glutamatergiques dans les neurones Ih+ et Ih- en parallèle avec une série d’expériences comportementales utilisant un paradigme de préférence de place conditionnée (PPC) menée dans le laboratoire de Pierre-Paul Rompré. Nous avons constaté que la D-Tyr[11]NT induisaient une inhibition dépendante de la dose dans les neurones Ih+ médiée par l'activation de récepteurs NTS2. En revanche, la D-Tyr[11]NT a produit une augmentation des CPSEs glutamatergiques médiée par des récepteurs NTS1 dans les neurones Ih-. Les résultats des expériences comportementales ont montré que des microinjections bilatérales de D-Tyr[11]NT dans le VTA induisait une PPC bloquée uniquement par la co-injection de SR142948A et SR48692, indiquant un rôle pour les deux types de récepteurs, NTS1 et NTS2. Cette étude nous a permis de conclure que i) la D-Tyr[11]NT agit dans le VTA via des récepteurs NTS1 et NTS2 pour induire un effet de récompense et ii) que cet effet est dû, au moins en partie, à une augmentation de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones non-dopaminergiques (Ih-). Dans une troisième étude nous nous sommes intéressés aux effets de la D-Tyr[11]NT sur les réponses isolées médiées par les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et acide α-amino-3- hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) dans les neurones du VTA. Nous avons constaté que dans les neurones Ih+ l’amplitude des CPSEs NMDA et AMPA étaient atténuées de la même manière par la D-Tyr[11] NT. Cette modulation des réponses était médiée par les récepteurs NTS1 et NTS2. Au contraire, dans les neurones Ih-, l’amplitude des réponses NMDA et AMPA étaient augmentées en présence de D-Tyr[11]NT et ces effets dépendaient de l’activation des récepteurs NTS1 localisés sur les terminaisons glutamatergiques. Ces résultats fournissent une preuve supplémentaire que le NT exerce une modulation bidirectionnelle sur la neurotransmission glutamatergique dans les neurones du VTA et met en évidence un nouveau type de modulation peptidergique des neurones non-dopaminergiques qui pourrait être impliqué dans la sensibilisation. En conclusion, la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA se fait en sens opposé soit, respectivement, par une inhibition ou par une excitation. De plus, ces effets sont médiés par différents types de récepteurs neurotensinergiques. En outre, nos études mettent en évidence une modulation peptidergique de la neurotransmission glutamatergique dans le VTA qui pourrait jouer un rôle important dans les mécanismes de lutte contre la toxicomanie.

Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

Analysis of HIV-1 Vpr determinants responsible for cell growth arrest in Saccharomyces cerevisiae

Affiliation: Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Nouvelles stratégies d’imageries afin de faciliter l’étude des interactions entre les récepteurs couplés aux protéines G

L’étude de l’assemblage et de l’acheminement à la membrane plasmique des complexes de signalisation des RCPGs va jouer un rôle crucial dans le développement de nouveaux médicaments ayant moins d’effets secondaires. Des outils permettant l’étude de ces phénomènes existent déjà, mais un outil polyvalent qui permettrait d’étudier plusieurs aspects pourrait grandement faciliter et accélérer ces études. L’étiquette SNAP est un candidat intéressant puisqu’avec cette étiquette il est possible de marquer une seule construction avec une variété de différents substrats. Une construction encodant pour le récepteur β2AR avec une étiquette SNAP à son extrémité C-terminale a été ingénérée. Cette construction est apte à lier son ligand, à être acheminée à la membrane plasmique et à homodimériser. La protéine exprimée a été marquée avec le fluorophore BG-430. De la fluorescence non spécifique a été détectée dans la cellule (même en absence de l’étiquette SNAP sur le récepteur). Un essai BRET a été développé, utilisant la construction HA-β2AR-SNAP en tant qu’accepteur et est fonctionnel. L’étiquette SNAP, comme utilisée ici, ne présente pas un aussi bon candidat qu’attendu, puisque le substrat n’ayant pas réagi demeure coincé dans la cellule. Le facteur activateur de plaquette (PAF) et son récepteur (PAFR) jouent un rôle critique dans plusieurs réponses inflammatoires et le récepteur FP est impliqué dans l’accouchement prématuré. Une meilleure compréhension des complexes de signalisation associés à ces récepteurs pourrait être la première étape dans la compréhension de leur signalisation dans des situations normales ou de maladies. Des expériences de BRET étudiant des interactions de bases entre les récepteurs et leurs partenaires d’interactions connus ont été réalisées. Elles ont permis de déterminer que : les récepteurs PAF et FP homodimérisent, que les récepteurs PAF et FP hétérodimérisent, que les protéines Gβγ interagissent de manière constitutive avec ces récepteurs et qu’aucun signal de BRET n’a été détecté avec la protéine Gα et ce, en présence ou en absence de stimulation par un agoniste (suggérant qu’il est nécessaire d’optimiser le système présentement utilisé).

Phosphorylation du CTD de l'ARN polymérase II et impact de l'histone H2A.Z sur le positionnement des nucléosomes chez S. cerevisiae

La phosphorylation du domaine C-terminal de l’ARN polymérase II permet à ce complexe protéique d’exécuter la transcription des gènes, en plus de coupler à la transcription des événements moléculaires comme la maturation des ARNm. Mes résultats montrent que même si cette phosphorylation suit un patron similaire à l’ensemble des gènes, il existe des exceptions pouvant être dues à des mécanismes alternatifs de phosphorylation du CTD. Le présent ouvrage s’intéresse également au rôle qu’occupe la variante d’histone H2A.Z dans l’organisation de la chromatine. Des études précédentes on montré que le positionnement de certains nucléosomes le long de l’ADN serait influencé par H2A.Z et aurait une influence sur la capacité de transcrire les gènes. Par une approche génomique utilisant les puces à ADN, j’ai cartographié l’impact de la délétion de H2A.Z sur la structure des nucléosomes. Enfin, des résultats intéressants sur la dynamique d’incorporation de H2A.Z à la chromatine ont été obtenus.

Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

La calnexine: un élément clé dans l'apoptose chez la levure Schizosaccharomyces pombe.

La mort cellulaire programmée (PCD pour Programmed Cell Death) est un processus essentiel aux cellules. Le PCD a d’abord été caractérisé dans le développement cellulaire et peut être divisé en plusieurs groupes selon les caractéristiques observées. L’apoptose, un sous-groupe du PCD, est caractérisé par plusieurs distinctions morphologiques et signalétiques attribué tout d’abord aux organismes complexes pour son rôle dans le développement et dans le maintien de l’intégrité tissulaire. Depuis la dernière décennie, de nombreuses études font état de l’existence d’un programme apoptotique dans des organismes unicellulaires comme les levures. Ce programme apoptotique a surtout été étudié chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe et partage certaines caractéristiques avec l’apoptose des mammifères. Par contre, l’apoptose associé aux levures est distinct à certains égards entre autre par l’absence de certains homologues présents chez les mammifères. L’intérêt au niveau de l’étude du phénomène apoptotique chez les levures est sans cesse grandissant par la facilité avec laquelle les levures peuvent être utilisées comme système modèle. L’apoptose peut être induit dans les cellules de différentes façons en réponse à des stimuli internes ou externes. L’accumulation de protéines mal repliées au niveau du réticulum endoplasmique (RE) causant un stress est un inducteur bien caractérisé de la voie apoptotique. La signalisation de l’apoptose dans un cas de stress au RE fait appel aux transducteurs des signaux de la voie du UPR ( Unfolded Protein Response). Récemment, il a été montré que la calnexine, une chaperone transmembranaire du RE connue et caractérisée surtout pour ses fonctions d’aide au repliement des protéines et au contrôle de qualité, joue un rôle dans la transduction du signal apoptotique en réponse au stress du RE chez mammifères. Le rôle de la calnexine dans ce cas consiste principalement en l’échafaudage pour le clivage par la caspase 8 de la protéine apoptotique Bap31. Nous avons tout d’abord démontré que le stress du RE et que la déficience en inositol, un précurseur essentiel de nombreuses molécules signalétiques, sont deux inducteurs de l’apoptose chez la levure S. pombe. Ces deux voies semblent induire l’apoptose par deux voies distinctes puisque seule la voie de la déficience en inositol induit l’apoptose de façon dépendante à la métacaspase Pca1p. La calnexine, essentielle à la viabilité chez la levure S. pombe, est impliquée dans ces deux phénomènes apoptotiques. L’apoptose induit par le stress du RE nécessite une version de la calnexine ancrée à la membrane du RE pour être optimal. De façon opposée, l’apoptose induit par une déficience en inositol nécessite la présence de la queue cytosolique ancrée à la membrane de la calnexine pour être retardé. Ces deux actions différentes imputables à une même protéine laisse croire à une double fonction pro et anti-apoptotique de celle-ci. Suite à la découverte de l’existence d’un clivage endogène de la calnexine en situation normale de croissance, un modèle a été élaboré expliquant les rôles distincts de la calnexine dans ces deux voies apoptotiques. Ce modèle fait état d’un rôle associé au clivage de la calnexine dans l’apoptose.

Src family kinases are required for limb trajectory selection by spinal motor axons

Signal relay by guidance receptors at the axonal growth cone is a process essential for the assembly of a functional nervous system. We investigated the in vivo function of Src family kinases (SFKs) as growth cone guidance signaling intermediates in the context of spinal lateral motor column (LMC) motor axon projection toward the ventral or dorsal limb mesenchyme. Using in situ mRNA detection we determined that Src and Fyn are expressed in LMC motor neurons of chick and mouse embryos at the time of limb trajectory selection. Inhibition of SFK activity by C-terminal Src kinase (Csk) overexpression in chickLMCaxons using in ovo electroporation resulted inLMC axons selecting the inappropriate dorsoventral trajectory within the limb mesenchyme, with medial LMC axon projecting into the dorsal and ventral limb nerve with apparently random incidence. We also detected LMC axon trajectory choice errors in Src mutant mice demonstrating a nonredundant role for Src in motor axon guidance in agreement with gain and loss of Src function in chickLMCneurons which led to the redirection ofLMCaxons. Finally, Csk-mediated SFK inhibition attenuated the retargeting ofLMCaxons caused by EphA or EphB over-expression, implying the participation of SFKs in Eph-mediated LMC motor axon guidance. In summary, our findings demonstrate that SFKs are essential for motor axon guidance and suggest that they play an important role in relaying ephrin:Eph signals that mediate the selection of motor axon trajectory in the limb.