A mechanism for co-transcriptional recruitment of mRNA localization factor on nascent mRNAs in budding yeast

Le transport et la localisation des ARN messagers permettent de réguler l’expression spatiale et temporelle de facteurs spécifiques impliqués dans la détermination du destin cellulaire, la plasticité synaptique, la polarité cellulaire et la division asymétrique des cellules. Chez S.cerevisiæ, plus de trente transcrits sont transportés activement vers le bourgeon cellulaire. Parmi ces transcrits, l’ARNm ASH1 (asymetric synthesis of HO) est localisé à l’extrémité du bourgeon pendant l’anaphase. Ce processus va entrainer une localisation asymétrique de la protéine Ash1p, qui sera importée uniquement dans le noyau de la cellule fille, où elle entraine le changement de type sexuel. La localisation asymétrique de l’ARNm ASH1, et donc de Ash1p, implique la présence de différents facteurs de localisation. Parmi ces facteurs, les protéines She (She1p/Myo4p, She2p et She3p) et les répresseurs traductionnels (Puf6p, Loc1p et Khd1p) participent à ce mécanisme. La protéine navette She2p est capable de lier l’ARNm ASH1 et va entrainer le ciblage de cet ARNm vers l’extrémité du bourgeon en recrutant le complexe She3p-Myo4p. Des répresseurs traductionnels régulent la traduction de cet ARNm et évitent l’expression ectopique de la protéine Ash1p pendant son transport. Alors que la fonction cytoplasmique de She2p sur la localisation des ARNm est connue, sa fonction nucléaire est encore inconnue. Nous avons montré que She2p contient une séquence de localisation nucléaire non classique qui est essentielle à son import nucléaire médié par l’importine α (Srp1p). L’exclusion de She2p du noyau par mutation de son NLS empêche la liaison de Loc1p et Puf6p sur l’ARNm ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et de la protéine. Pour étudier plus en détail l’assemblage de la machinerie de localisation des ARNm dans le noyau, nous avons utilisé des techniques d’immunoprécipitation de chromatine afin de suivre le recrutement des facteurs de localisation et des répresseurs traductionnels sur les ARNm naissants. Nous avons montré que She2p est recruté sur le gène ASH1 pendant sa transcription, via son interaction avec l’ARNm ASH1 naissant. Puf6p est également recruté sur ASH1, mais d’une manière dépendante de la présence de She2p. De façon intéressante, nous avons détecté une interaction entre She2p et la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (Rpb1p). Cette interaction est détectée avec la forme active en élongation de l’ARN polymérase II. Nous avons également démontré que She2p interagit avec le complexe d’élongation de la transcription Spt4p/Spt5p. Une délétion de SPT4 ou une mutation dans SPT5 (Ts spt5) à température restrictive empêche l’interaction entre She2p et Rpb1p, et diminue le recrutement de She2p au gène ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et un défaut de localisation asymétrique de la protéine Ash1p. De manière globale, nos résultats montrent que les facteurs impliqués dans la localisation cytoplasmique des ARNm et dans leur contrôle traductionnel sont recrutés de façon co-transcriptionnelle sur les ARNm naissants via leur interaction avec la machinerie de transcription, suggèrant un rôle important de la machinerie transcriptionelle dans la localisation des ARNm.

An examination of the effects of 4E-T-mediated re-localization of eIF4E on eIF4E function

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer.

Localisation et fonction de CHK2 en mitose

Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2 a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les cellules U2OS.

Study of the subcellular localization of cell cycle regulator Cks1 and its impact on cancer

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par de vagues oscillantes de cyclines et des kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces kinases sont régulées positivement par l’association des sous-unités cyclines régulatrices et négativement en se liant aux inhibiteurs de Cdk. Parmi ces derniers, p27 inhibe tous les complexes cycline-Cdk quelle que soit la phase cellulaire et agit en tant que régulateur négatif principal de la prolifération cellulaire dans une variété de cellules et de tissus. Intrinsèquement, p27 phosphorylé est ubiquitiné et dégradé par le complexe SCFSkp2-Cks1. Des études génétiques de la souris, ainsi que des examens cliniques chez l’homme, ont montré que p27 est un important suppresseur de tumeur. Le gène est rarement muté. Cependant, p27 est fréquemment réprimé dans les cancers humains en raison d’une augmentation de l’expression de Skp2 et de Cks1 dans le noyau, ce qui est généralement associée à un mauvais pronostic. La localisation subcellulaire de Cks1 est donc d'une importance primordiale dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats récents de notre laboratoire ont montré une interaction entre Cks1 et les protéines de transport nucléaire importine α1 et β3. Aussi, l’analyse de la séquence primaire de Cks1 a également révélé un signal de localisation nucléaire classique (NLS) à son extrémité C-terminale. Des mutations ont été effectuées sur le NLS suspect pour déterminer si oui ou non l'import nucléaire de Cks1 était contrôlé par cette séquence. Un inhibiteur synthétique de l’importine β a également été utilisé pour étudier l’import de Cks1 dans le noyau. Les résultats indiquent que l’extrémité C-terminale de Cks1 est en effet un NLS puisque les mutations de Cks1 et l'inhibition de l’importine β conduisent, tous deux, à l'accumulation de Cks1 dans le cytoplasme. Ces résultats ont été utiles pour mieux comprendre le mécanisme régulant la localisation de Cks1. Toutefois, des travaux futurs sont nécessaires pour mieux comprendre l'impact de la séquestration cytoplasmique de Cks1 sur le cancer et ainsi espérer aboutir à l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques impliqués dans la prolifération cellulaire.

CEP78, a novel centrosomal protein

Contexte: Le centrosome est un petit organite bien connu pour son rôle dans l'établissement du fuseau bipolaire pendant la division cellulaire. Les déficiences de la fonction du centrosome donnent souvent lieu à des maladies humaines, y compris le cancer et la formation de kystes rénaux. Nous sommes intéressés à étudier la fonction d'une nouvelle protéine centrosomale nommée CEP78, identifiée dans un criblage protéomique pour de nouveaux composants centrosomaux. Méthodes et résultats : Le traitement des cellules avec le nocodazole, un agent qui dépolymérise spécifiquement les microtubules cytoplasmiques mais pas les microtubules stabilisés du centrosome, a montré que CEP78 est un composant centrosomal stable. La colocalisation de cette protéine avec d'autres marqueurs centrosomaux tels que CEP164, SAS6, Centrine, tubuline polyglutamylée et POC5, à différentes phases du cycle cellulaire a indiqué que CEP78 est précisément à l'extrémité distale des centrioles, mères et filles. Il existe deux pointts CEP78 au cours de l’interphase et les cellules passent par la mitose, procentrioles maturent, et le nombre de points de CEP78 augmente à 4 par cellule et, à la fin de la télophase chaque cellule fille possède 2 points CEP78. La caractérisation des domaines fonctionnels de CEP78 a montré que des répétitions riches en leucine sont nécessaires pour la localisation centrosomale de la protéine. En outre, nous avons constaté que la surexpression de CEP78 ne change pas le nombre de mères/procentrioles mais diminue le nombre et l'intensité des points de CEP170 (protéine d'appendice sous-distal) sans diminution du niveau d'expression de cette protéine. D'autres études ont montré qu'il n'y a pas d'interaction entre ces deux protéines. Enfin, la surexpression de CEP78 protège des microtubules contre la dépolymérisation en présence de nocodazole, ce qui suggère qu'il possède la capacité de lier les microtubules. Conclusion : Nos résultats suggèrent que CEP78 est destiné à l'extrémité distale des centrioles matures par ses répétitions riche en lecuine, où il pourrait être impliqué dans la maturation ou la régulation de l'assemblage ou de la rénovation de l'appendice sous-distal centriolaire, une structure connue dans la nucléation des microtubules et d'ancrage. Comprendre la fonction de Cep78 contribuera à éclaircir le rôle du centrosome dans le cycle cellulaire.

Localization and function of the endocannabinoid system throughout the retinogeniculate pathway of vervet monkeys

Le système endocannabinoïde (eCB) est présent dans le système nerveux central (SNC) de mammifères, incluant la rétine, et est responsable de la régulation de nombreux processus physiologiques. Bien que la présence du récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1R) a bien été documenté dans la rétine de rongeurs et primates, il y a encore une controverse quant à la présence du récepteur cannabinoïde de type 2 (CB2R) au niveau du SNC. En utilisant la microscopie confocale, nous sommes les premiers à signaler les patrons d’expression du CB2R dans la rétine de singe. Nos résultats démontrent que le CB2R est exprimé exclusivement dans les cellules de Müller de la rétine du singe. En outre, nous avons comparé les différents patrons d’expression du système eCB dans la rétine de la souris, du toupaye, ainsi que du singe vervet et macaque. Nous rapportons que les distributions de CB1R, FAAH (fatty acid amid hydrolase), MAGL (monoacylglycerol lipase) et DAGLα (diacylglycerol lipase alpha) sont hautement conservées parmi ces espèces alors que CB2R et NAPE-PLD (N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D) présentent différents profils d'expression. CB2R n'a pas été détecté dans les cellules neuronales de la rétine des primates. L’immunoréactivité de NAPE-PLD est présente dans les couches de la rétine de souris et toupayes, mais a été limitée à la couche des photorécepteurs des singes vervet et macaque. Pour étudier les corrélats neuronaux et le rôle de la signalisation du système eCB dans la rétine, nous avons établi un protocole standard pour l'électrorétinographie (ERG), puis enregistré la réponse ERG de la rétine après le blocage des récepteurs avec des antagonistes spécifiques pour CB1R (AM251) et CB2R (AM630). Comparé au témoin, dans des conditions photopiques, et à certaines intensités faibles du stimulus, le blocage de CB1R diminue l'amplitude de l'onde-b, alors qu’à des intensités plus élevées, le blocage de CB2R augmente l'amplitude des deux-ondes a et b. De plus, le blocage des récepteurs cannabinoïdes provoque une augmentation de la latence des deux ondes a et b. Dans des conditions d’adaptation à l'obscurité, le blocage de CB1R et CB2R réduit l’amplitudes de l'onde a seulement à des intensités plus élevées et réduit l’onde b à intensités plus faibles. Des augmentations significatives de latence ont été observées dans les deux cas. Ces résultats indiquent que les récepteurs CB1 et CB2 chez les primates non humains sont impliqués dans la fonction rétinienne conditions photopiques. En outre, nous avons évalué le profil d'expression du CB1R, de FAAH et de NAPE-PLD au-delà de la rétine dans le corps géniculé latéral des singes et nous rapportons pour la première fois que CB1R et FAAH sont exprimés davantage dans les couches magnocellulaires. La NAPE-PLD a été localisée à travers les couches magno- et parvocellulaires. Aucune de ces composantes n’est exprimée dans les couches koniocellulaires. Ces résultats nous aident à mieux comprendre les effets des cannabinoïdes sur le système visuel qui pourraient nous mener à trouver éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques.