Identification in silico d’éléments de réponse de récepteurs nucléaires impliqués dans le cancer du sein

La croissance de deux tiers des tumeurs mammaires dépend des œstrogènes. Le réseau de gènes responsable de propager les signaux prolifératifs des œstrogènes est encore mal connu. Des micropuces d’ADN de cellules de carcinome mammaire MCF7 traitées à l’œstradiol (E2) avec ou sans l’inhibiteur de synthèse protéique cycloheximide (CHX) ont permis d’identifier de nombreux gènes cibles primaires et secondaires. La séquence des promoteurs des gènes cibles a été criblée à l’aide d’une banque de 300 matrices modélisant les sites reconnus par divers facteurs de transcription. Les éléments de réponse aux œstrogènes (ERE) sont enrichis dans les promoteurs des gènes primaires. Les sites E2F sont enrichis dans les promoteurs des gènes cible secondaires. Un enrichissement similaire a été observé avec les régions liées par ERα et E2F1 en ChIP-on-chip pour chacune des catégories de gènes. La croissance des cellules de carcinome mammaire est inhibée par des traitements à l’acide rétinoïque (RA). L’analyse de micropuces d’ADN de MCF7 traitées avec RA a permis d’identifier de nombreux gènes cibles potentiels. Un enrichissement d’éléments de réponse à l’acide rétinoïque (RARE) est observable dans les promoteurs de ces gènes après avoir exclus les RARE se trouvant à l’intérieur d’éléments transposables. Des RARE présents dans des éléments transposables spécifiques aux primates sont aussi fixés in vivo dans les promoteurs de cibles connues de RA : BTG2, CASP9 et GPRC5A. Certains gènes cibles de RA dans les MCF7 sont aussi des cibles de E2, suggérant que le contrôle que ces molécules exercent sur la prolifération est en partie attribuable à des effets opposés sur un ensemble commun de gènes.

In silico analysis of mitochondrial proteins

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux.

Évaluation in silico des pompes d’assistance ventriculaire de type écoulement mixte

L'insuffisance cardiaque est une maladie à grande incidence dont le traitement définitif est difficile. Les pompes d'assistance ventriculaire ont été proposées comme thérapie alternative à long terme, mais la technologie est relativement jeune et selon son design, axial ou centrifuge, le dispositif favorise soit l'hémolyse, soit la stagnation de l'écoulement sanguin. Les pompes à écoulement mixte, combinant certaines propriétés des deux types, ont été proposées comme solution intermédiaire. Pour évaluer leurs performances, nous avons effectué des comparaisons numériques entre huit pompes, deux axiales, deux centrifuges, et quatre mixtes, en employant un modèle Windkessel du système cardiovasculaire avec paramètres optimisés pour l'insuffisance cardiaque résolu avec une méthode Radau IIA3, une méthode de résolution de système d'équations différentielles ordinaires L-stable appartenant à la famille des méthodes Runge-Kutta implicites. Nos résultats semblent suggérer que les pompes d'assistance mixtes ne démontrent qu'un léger avantage comparativement aux autres types en terme de performance optimale dans le cas de l'insuffisance cardiaque, mais il faudrait effectuer plus d'essais numériques avec un modèle plus complet, entre autres avec contrôles nerveux implémentés.

Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

Prédiction de boucles de régulation associant microARN et gènes régulés par le récepteur de l'acide rétinoïque dans le cancer du sein

Le récepteur de l'acide rétinoïque RAR est une protéine de la superfamille des récepteurs nucléaires liant le ligand acide rétinoïque (AR). En présence de son ligand, RAR induit la transcription de ses gènes cibles alors qu'en son absence la transcription est inhibée. Le mécanisme de régulation de RAR est altéré dans les lignées cellulaires humaines de carcinome mammaire dû à une baisse de capacité de synthèse de l'AR. Aussi, l'expression des microARN (miR) est perturbée dans le cancer du sein et un grand nombre de gènes ont été identifiés, après une analyse in-silico, comme des cibles prédites des miRs. Ces derniers peuvent être régulés pas des facteurs de transcription et ils sont capables d'inhiber la prolifération cellulaire et d'induire l'apoptose via la régulation de leurs cibles. Ainsi, les miRs peuvent jouer un rôle dans le mécanisme de régulation de RAR et être impliqués dans des boucles de régulation avec ce récepteur. Dans le cadre de ce travail, nous décrivons une approche développée pour prédire et caractériser des circuits de régulation au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel dans le cancer du sein. Nous nous sommes intéressés aux boucles de régulation de type feed-forward où RAR régule un miR et en commun ils régulent un ensemble de gènes codants pour des protéines dans les cellules tumorales mammaires MCF7 et SKBR3. Ces circuits ont été construits en combinant des données de ChIP-chip de RAR et des données de micro-puces d'ADN tout en utilisant des outils in-silico de prédiction des gènes cibles de miRs. Afin de proposer le modèle approprié de régulation, une analyse in-silico des éléments de réponse de l'AR (RARE) dans les promoteurs des miRs est réalisée. Cette étape permet de prédire si la régulation par RAR est directe ou indirecte. Les boucles ainsi prédites sont filtrées en se basant sur des données d'expression de miR existantes dans des bases de données et dans différentes lignées cellulaires, en vue d'éliminer les faux positifs. De plus, seuls les circuits pertinents sur le plan biologique et trouvés enrichis dans Gene Ontology sont retenus. Nous proposons également d'inférer l'activité des miRs afin d'orienter leur régulation par RAR. L'approche a réussi à identifier des boucles validées expérimentalement. Plusieurs circuits de régulation prédits semblent être impliqués dans divers aspects du développement de l'organisme, de la prolifération et de la différenciation cellulaire. De plus, nous avons pu valider que let-7a peut être induit par l'AR dans les MCF7.

Doppler vortography : detection and quantification of the vortices in the left ventricle

Nous proposons une nouvelle méthode pour quantifier la vorticité intracardiaque (vortographie Doppler), basée sur l’imagerie Doppler conventionnelle. Afin de caractériser les vortex, nous utilisons un indice dénommé « Blood Vortex Signature (BVS) » (Signature Tourbillonnaire Sanguine) obtenu par l’application d’un filtre par noyau basé sur la covariance. La validation de l’indice BVS mesuré par vortographie Doppler a été réalisée à partir de champs Doppler issus de simulations et d’expériences in vitro. Des résultats préliminaires obtenus chez des sujets sains et des patients atteints de complications cardiaques sont également présentés dans ce mémoire. Des corrélations significatives ont été observées entre la vorticité estimée par vortographie Doppler et la méthode de référence (in silico: r2 = 0.98, in vitro: r2 = 0.86). Nos résultats suggèrent que la vortographie Doppler est une technique d’échographie cardiaque prometteuse pour quantifier les vortex intracardiaques. Cet outil d’évaluation pourrait être aisément appliqué en routine clinique pour détecter la présence d’une insuffisance ventriculaire et évaluer la fonction diastolique par échocardiographie Doppler.

Conception, synthèse et caractérisation de nouvelles macromolécules branchées biocompatibles pour encapsuler des principes actifs hydrophobes

La vectorisation des médicaments est une approche très prometteuse tant sur le plan médical qu’économique pour la livraison des substances actives ayant une faible biodisponibilité. Dans ce contexte, les polymères en étoile et les dendrimères, macromolécules symétriques et branchées, semblent être les solutions de vectorisation les plus attrayantes. En effet, ces structures peuvent combiner efficacement une stabilité élevée dans les milieux biologiques à une capacité d’encapsulation des principes actifs. Grâce à leur architecture bien définie, ils permettent d’atteindre un très haut niveau de reproductibilité de résultats, tout en évitant le problème de polydispersité. Bien que des nombreuses structures dendritiques aient été proposées ces dernières années, il est cependant à noter que la conception de nouveaux nanovecteurs dendritiques efficaces est toujours d’actualité. Ceci s’explique par des nombreuses raisons telles que celles liées à la biocompatibilité, l’efficacité d’encapsulation des agents thérapeutiques, ainsi que par des raisons économiques. Dans ce projet, de nouvelles macromolécules branchées biocompatibles ont été conçues, synthétisées et évaluées. Pour augmenter leur efficacité en tant qu’agents d’encapsulations des principes actifs hydrophobes, les structures de ces macromolécules incluent un coeur central hydrophobe à base de porphyrine, décanediol ou trioléine modifié et, également, une couche externe hydrophile à base d’acide succinique et de polyéthylène glycol. Le choix des éléments structuraux de futures dendrimères a été basé sur les données de biocompatibilité, les résultats de nos travaux de synthèse préliminaires, ainsi que les résultats de simulation in silico réalisée par une méthode de mécanique moléculaire. Ces travaux ont permis de choisir des composés les plus prometteurs pour former efficacement et d’une manière bien contrôlable des macromolécules polyesters. Ils ont aussi permis d’évaluer au préalable la capacité de futurs dendrimères de capter une molécule médicamenteuse (itraconazole). Durant cette étape, plusieurs nouveaux composés intermédiaires ont été obtenus. L’optimisation des conditions menant à des rendements réactionnels élevés a été réalisée. En se basant sur les travaux préliminaires, l’assemblage de nouveaux dendrimères de première et de deuxième génération a été effectué, en utilisant les approches de synthèse divergente et convergente. La structure de nouveaux composés a été prouvée par les techniques RMN du proton et du carbone 13C, spectroscopie FTIR, UV-Vis, analyse élémentaire, spectrométrie de masse et GPC. La biocompatibilité de produits a été évaluée par les tests de cytotoxicité avec le MTT sur les macrophages murins RAW-262.7. La capacité d’encapsuler les principes actifs hydrophobes a été étudiée par les tests avec l’itraconazole, un antifongique puissant mais peu biodisponible. La taille de nanoparticules formées dans les solutions aqueuses a été mesurée par la technique DLS. Ces mesures ont montré que toutes les structures dendritiques ont tendance à former des micelles, ce qui exclue leurs applications en tant que nanocapsules unimoléculaires. L’activité antifongique des formulations d’itraconazole encapsulé avec les dendrimères a été étudiée sur une espèce d’un champignon pathogène Candida albicans. Ces tests ont permis de conclure que pour assurer l’efficacité du traitement, un meilleur contrôle sur le relargage du principe actif était nécessaire.

The study of RNA tertiary interactions in tRNA structure and function

Le rôle des deux paires de bases universelles inverse Hoogsteen U : A ( RHUAs ) présentent chez les ARNt standards , une dans la boucle T et l'autre dans le noyau de la forme en L , a été étudiée. Pour chacun des RHUAs , un criblage génétique spécialisé in vivo chez les bactéries , le système suppresseur ambre ( pour l'étude de la RHUA dans la boucle T ) et le système d'ARNt de la sélénocystéine ( tRNASec ) ( pour l'étude de la RHUA dans le noyau ) , ont été utilisé pour générer des variants fonctionnels à partir de multiples librairies combinatoires . Ces variants ont ensuite été séquencé et soumis à une analyse systématique qui comprend la modélisation informatique et un type d'analyse phylogénétique. Les résultats du système suppresseur ambre ont montré un ensemble de variants fonctionnels qui ne nécessitent pas le motif RHUA dans la boucle T et qui ont remplacé la méthode standard de l'interaction entre les boucles D et T avec une double hélice interboucle , ILDH . D'autres études ont abouti à la détermination d'un modèle In silico de l'alternative à la norme standard de la boucle T, sous le nom de type III . Les résultats du système tRNASec ont révélé que pour cette ARNt exceptionnel, l'absence de RHUA ( dans le noyau ) assure une flexibilité accrue qui est spécifiquement nécessaire pour la fonction de tRNASec . Ainsi, les ARNt standards , à la différence de tRNASec , avec la présence universelle de RHUA dans le noyau , a été naturellement sélectionnée pour être rigide . Pris ensemble, la RHUA joue un rôle essentiel dans la stabilisation des interactions tertiaires.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Understanding the transcriptional control of EIF4E and its dysregulation in acute myeloid leukemia: role of NF-κB

EIF4E, le facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est un oncogène puissant et qui se trouve induit dans plusieurs types de cancers, parmi lesquels les sous-types M4 et M5 de la leucémie aiguë myéloblastique (LAM). EIF4E est régulé à plusieurs niveaux cependant, la régulation transcriptionnelle de ce gène est peu connue. Mes résultats montrent que EIF4E est une cible transcriptionnelle directe du facteur nucléaire « kappa-light- chain- enhancer of activated B cells » (NF-κB).Dans les cellules hématopoïétiques primaires et les lignées cellulaires, les niveaux de EIF4E sont induits par des inducteurs de NF-κB. En effet, l’inactivation pharmaceutique ou génétique de NF-κB réprime l’activation de EIF4E. En effet, suite à l’activation de NF-κB chez l’humain, le promoteur endogène de EIF4E recrute p65 (RelA) et c-Rel aux sites évolutionnaires conservés κB in vitro et in vivo en même temps que p300 ainsi que la forme phosphorylée de Pol II. De plus, p65 est sélectivement associé au promoteur de EIF4E dans les sous-types LAM M4/M5 mais non pas dans les autres sous-types LAM ou dans les cellules hématopoïétiques primaires normales. Ceci indique que ce processus représente un facteur essentiel qui détermine l’expression différentielle de EIF4E dans la LAM. Les analyses de données d’expressions par séquençage de l’ARN provenant du « Cancer Genome Atlas » (TCGA) suggèrent que les niveaux d’ARNm de EIF4E et RELA se trouvent augmentés dans les cas LAM à pronostic intermédiaire ou faible mais non pas dans les groupes cytogénétiquement favorables. De plus, des niveaux élevés d’ARNm de EIF4E et RELA sont significativement associés avec un taux de survie relativement bas chez les patients. En effet, les sites uniques κB se trouvant dans le promoteur de EIF4E recrutent le régulateur de transcription NF-κB p65 dans 47 nouvelles cibles prévues. Finalement, 6 nouveaux facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation du gène EIF4E ont été prédits par des analyses de données ChIP-Seq provenant de l’encyclopédie des éléments d’ADN (ENCODE). Collectivement, ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur le control transcriptionnel de EIF4E et offrent une nouvelle base moléculaire pour sa dérégulation dans au moins un sous-groupe de spécimens de LAM. L’étude et la compréhension de ce niveau de régulation dans le contexte de spécimens de patients s’avère important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’expression du gène EIF4E moyennant des inhibiteurs de NF-κB en combinaison avec la ribavirine.

Identification and characterization of new biomarkers in aggressive subtypes of breast cancer

En 2015, la récidive tumorale et les métastases du cancer du sein demeurent une cause importante de décès à travers le monde. Toutefois, ces cancers sont souvent hétérogènes car en dépit d’un phénotype similaire, l’évolution clinique et la réponse au traitement peuvent varier considérablement. Il y a donc un intérêt évident à identifier et à caractériser de nouveaux biomarqueurs pour permettre classer les tumeurs mammaires dans des sous-groupes plus homogènes. Notre hypothèse est que chaque cancer mammaire possède des caractéristiques distinctes au plan des altérations du génome et des profils d’expression géniques et que ces changements se traduisent cliniquement par une prédisposition à former des métastases ou à répondre ou non à la chimiothérapie et aux thérapies ciblées. Dans le cadre de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux sous-types agressifs de tumeurs mammaires et notamment les cancers de type triple négatif. Nous avons aussi tenté d’identifier des marqueurs capables de distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Pour ce faire, nous avons d’abord utilisé une stratégie in silico à partir de données publiques (micro-puces d’ADN et séquençage de l’ARN). Nous avons ensuite construit sept micro-matrices tissulaires (TMA) provenant de tissus mammaires normaux et tumoraux fixés à la formaline et enrobés en paraffine. Ces outils nous ont permis d’évaluer par immunohistochimie les niveaux d’expression différentielle des marqueurs suivants : ANXA1, MMP-9, DP103 et MCM2. Ceux-ci ont été comparés aux marqueurs usuels du cancer du sein (ER, PR, HER2, CK5/6 et FOXA1) et corrélés aux données cliniques (survie globale et métastase). Nos résultats indiquent que ces nouveaux marqueurs jouent un rôle important dans l’évolution clinique défavorable des tumeurs de haut grade. Dans un premier article nous avons montré que l’expression d’ANXA1 est dérégulée dans les cancers de type triple-négatif et aussi, dans une certaine mesure, dans les tumeurs HER2+. Nous croyons qu’ANXA1 permet de mieux comprendre le processus d’hétérogénéité tumorale et facilite l’identification des tumeurs de haut grade. Nous proposons également qu’ d’ANXA1 stimule la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la formation des métastases. Dans un second temps, nous avons montré que les niveaux d’expression de MMP-9 reflètent la différenciation cellulaire et corrèlent avec les sous-types de cancers mammaires ayant un mauvais pronostic. Nous estimons que MMP-9 permet de mieux comprendre et d’identifier les tumeurs mammaires à haut risque. De fait, la surexpression de MMP-9 est associée à une augmentation des métastases, une récidive précoce et une diminution de la survie globale. Dans le cadre d’un troisième article, nous avons montré que la surexpression du marqueur de prolifération MCM2 s’observe dans les cancers triple-négatifs, HER2+ et Luminal B par comparaison aux cancers luminal A (p< 0.0001). Nos résultats suggèrent qu’en utilisant un seuil de 40% de noyaux marqués, nous pourrions distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Cela dit, avant de pouvoir envisager l’utilisation de ce marqueur en clinique, une étude de validation sur une nouvelle cohorte de patientes s’impose. En somme, les résultats de nos travaux suggèrent qu’ANXA1, MMP-9 et MCM2 sont des marqueurs intéressants pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la progression tumorale et le développement des métastases. À terme, ces nouveaux marqueurs pourraient être utilisés seuls ou en combinaison avec d’autres gènes candidats pour permettre le développement de trousses « multigènes » ou d’essais protéomiques multiplex pour prédire l’évolution clinique des cancers mammaires.

Role of the Protein Tyrosine Kinase 7 gene in human neural tube defects

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies développementales où le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prévenir cette maladie, une connaissance accrue des processus moléculaires est nécessaire. L’étiologie des ATN est complexe et implique des facteurs génétiques et environnementaux. La supplémentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de développer une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du début de la supplémentation et de l’origine démographique. Les gènes impliqués dans les ATN sont largement inconnus. Les études génétiques sur les ATN chez l’humain se sont concentrées sur les gènes de la voie métabolique des folates du à leur rôle protecteur dans les ATN et les gènes candidats inférés des souris modèles. Ces derniers ont montré une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gène Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause l’ATN sévère de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit génétiquement avec Vangl2 (un autre gène de la voie PCP), où les doubles hétérozygotes montrent une spina bifida. Ces données font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez l’humain. Nous avons re-séquencé la région codante et les jonctions intron-exon de ce gène dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types d’ATN. Nous avons identifié 6 mutations rares (fréquence allélique <1%) faux-sens présentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de données publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allèle hypermorphique lorsqu'elle est surexprimée dans le modèle de poisson zèbre. Nos résultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'idée d'un rôle pathogène de la signalisation PCP dans ces malformations.

Improving the use of G-CSF during chemotherapy using physiological mathematical modelling : a quantitative systems pharmacology approach

La diminution des doses administrées ou même la cessation complète d'un traitement chimiothérapeutique est souvent la conséquence de la réduction du nombre de neutrophiles, qui sont les globules blancs les plus fréquents dans le sang. Cette réduction dans le nombre absolu des neutrophiles, aussi connue sous le nom de myélosuppression, est précipitée par les effets létaux non spécifiques des médicaments anti-cancéreux, qui, parallèlement à leur effet thérapeutique, produisent aussi des effets toxiques sur les cellules saines. Dans le but d'atténuer cet impact myélosuppresseur, on administre aux patients un facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhG-CSF), une forme exogène du G-CSF, l'hormone responsable de la stimulation de la production des neutrophiles et de leurs libération dans la circulation sanguine. Bien que les bienfaits d'un traitement prophylactique avec le G-CSF pendant la chimiothérapie soient bien établis, les protocoles d'administration demeurent mal définis et sont fréquemment déterminés ad libitum par les cliniciens. Avec l'optique d'améliorer le dosage thérapeutique et rationaliser l'utilisation du rhG-CSF pendant le traitement chimiothérapeutique, nous avons développé un modèle physiologique du processus de granulopoïèse, qui incorpore les connaissances actuelles de pointe relatives à la production des neutrophiles des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. À ce modèle physiologique, nous avons intégré des modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) de deux médicaments: le PM00104 (Zalypsis®), un médicament anti-cancéreux, et le rhG-CSF (filgrastim). En se servant des principes fondamentaux sous-jacents à la physiologie, nous avons estimé les paramètres de manière exhaustive sans devoir recourir à l'ajustement des données, ce qui nous a permis de prédire des données cliniques provenant de 172 patients soumis au protocol CHOP14 (6 cycles de chimiothérapie avec une période de 14 jours où l'administration du rhG-CSF se fait du jour 4 au jour 13 post-chimiothérapie). En utilisant ce modèle physio-PK/PD, nous avons démontré que le nombre d'administrations du rhG-CSF pourrait être réduit de dix (pratique actuelle) à quatre ou même trois administrations, à condition de retarder le début du traitement prophylactique par le rhG-CSF. Dans un souci d'applicabilité clinique de notre approche de modélisation, nous avons investigué l'impact de la variabilité PK présente dans une population de patients, sur les prédictions du modèle, en intégrant des modèles PK de population (Pop-PK) des deux médicaments. En considérant des cohortes de 500 patients in silico pour chacun des cinq scénarios de variabilité plausibles et en utilisant trois marqueurs cliniques, soient le temps au nadir des neutrophiles, la valeur du nadir, ainsi que l'aire sous la courbe concentration-effet, nous avons établi qu'il n'y avait aucune différence significative dans les prédictions du modèle entre le patient-type et la population. Ceci démontre la robustesse de l'approche que nous avons développée et qui s'apparente à une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP). Motivés par l'utilisation du rhG-CSF dans le traitement d'autres maladies, comme des pathologies périodiques telles que la neutropénie cyclique, nous avons ensuite soumis l'étude du modèle au contexte des maladies dynamiques. En mettant en évidence la non validité du paradigme de la rétroaction des cytokines pour l'administration exogène des mimétiques du G-CSF, nous avons développé un modèle physiologique PK/PD novateur comprenant les concentrations libres et liées du G-CSF. Ce nouveau modèle PK a aussi nécessité des changements dans le modèle PD puisqu’il nous a permis de retracer les concentrations du G-CSF lié aux neutrophiles. Nous avons démontré que l'hypothèse sous-jacente de l'équilibre entre la concentration libre et liée, selon la loi d'action de masse, n'est plus valide pour le G-CSF aux concentrations endogènes et mènerait en fait à la surestimation de la clairance rénale du médicament. En procédant ainsi, nous avons réussi à reproduire des données cliniques obtenues dans diverses conditions (l'administration exogène du G-CSF, l'administration du PM00104, CHOP14). Nous avons aussi fourni une explication logique des mécanismes responsables de la réponse physiologique aux deux médicaments. Finalement, afin de mettre en exergue l’approche intégrative en pharmacologie adoptée dans cette thèse, nous avons démontré sa valeur inestimable pour la mise en lumière et la reconstruction des systèmes vivants complexes, en faisant le parallèle avec d’autres disciplines scientifiques telles que la paléontologie et la forensique, où une approche semblable a largement fait ses preuves. Nous avons aussi discuté du potentiel de la pharmacologie quantitative des systèmes appliquées au développement du médicament et à la médecine translationnelle, en se servant du modèle physio-PK/PD que nous avons mis au point.

Évaluation neurobiologique des souris spontanément hypertendues : Du vieillissement à la génomique comparative

Le but de cette thèse est premièrement d’évaluer l’effet du vieillissement sur les fonctions psychomotrices des souches de souris sélectionnées génétiquement en fonction de leur tension artérielle (TA); deuxièmement, de localiser les déterminants génétiques des phénotypes psychophysiologiques à partir de souches recombinantes congéniques (RCS). Ces travaux ont mené à la publication de 4 articles. Le premier article décrit l’évaluation des fonctions psychomotrices des souches avec une tension artérielle élevée (HBP), basse (LBP) et normale (NBP). La performance aux épreuves d’exploration, d’habiletés motrices et d’apprentissage spatial, a été mesurée sur deux cohortes âgées respectivement de 12 mois et de trois mois. Indépendamment de l’âge, les HBPs sont hyperactives dans l’open-field (OF), mais pas dans le test d’exploration de trous. Inversement, les LBP explorent moins d’espaces que les NBP et, à trois mois seulement, sont hypoactives dans l’OF. Par ailleurs, les HBPs et les LBP présentent des déficits précoces de coordination motrice et des fonctions visuo-motrices. Le second article concerne l’évaluation longitudinale de la coordination motrice, de l’anxiété et de l’apprentissage spatial des souches HBP, LBP et NBP, à l’âge de deux mois et de 12 mois. Le vieillissement accentue l’hyperactivité des HBPs dans l’OF. Par contre, l’hypoactivité des souris LBP est détectable seulement à l’âge de deux mois. Indépendamment de l’âge, les souris HBP et LBP montrent une perception réduite du danger dans l’épreuve d’anxiété et des dysfonctions visuo-motrices au labyrinthe aquatique. Enfin, des déficits précoces de coordination motrice se manifestent seulement chez les HBPs. Il reste à déterminer si les déficits observés sont liés à des déterminants génétiques indépendants ou secondaires aux altérations de la tension artérielle. Le troisième article présente la comparaison entre les souches consanguines A/J et C57Bl/6J (B6) aux épreuves de l’OF, de la planche à trous, du labyrinthe aquatique et du cintre (coordination motrice). Les B6 explore d’avantage l’OF et la planche à trous. Les B6 sont moins rapides sur le cintre, mais supérieurs aux A/J dans le labyrinthe aquatique, avec une plate-forme invisible ou visible. Ces résultats démontrent l’implication de déterminants génétiques. Cette thèse se termine par un quatrième article sur la localisation des déterminants génétiques de la susceptibilité au stress dans les RCS, dérivées de A/J et B6, et présentant un agencement spécifique de 12.5% du génome. La réactivité émotionnelle est évaluée dans l’OF et le plus-maze; la réponse de stress est mesurée par radio télémétrie de la température interne pendant le stress d’immobilisation (SI) sous diète régulière et riche en sel; l’excrétion des électrolytes urinaires est dosée après 24 heures de diète salée. Les loci les plus significatifs sont situés dans les régions suivantes: de l’émotionalité dans l’OF (Emo1) sur le chr. 1 (LOD=4.6) correspondant à la région homologue impliquée dans la cohorte d’hypertension familiale du Saguenay; de la dopa décarboxylase (ddc) sur le chr. 11 pour l’émergence du plus-maze (LOD=4.7); de la protéine liant l’endotoxine (lbp) sur le chr. 2 pour l’hypothermie initiale en réponse au SI (LOD=4); et de HSP90 sur le chr. 12 pour l’excrétion de Ca++ (LOD=4.6). Des banques de données sont ensuite interrogées pour recenser les polymorphismes des régions régulatrices ou codantes des gènes candidats chez les souches ancestrales A/J et B6, dont les séquences sont disponibles pour le génome entier. Des utilitaires web permettent de dévoiler les changements dans la structure secondaire de l’ARNm, l’interférence avec des microARN ou avec d’autres motifs de liaison. Plusieurs SNPs fonctionnels ont été identifiés pour le QTL du chr. 1, particulièrement dans les éléments de régulation; ceux-ci impliquant des gènes reliés avec les réponses inflammatoire/immunitaire ou avec le système cardiovasculaire. La quantification par la PCR confirme une régulation à la baisse d’atp1a2 dans le cœur et le cerveau des souches susceptibles à l’anxiété. Ces résultats confirment l’intrication des altérations de la susceptibilité au stress et de la régulation de la TA.

Conception de microARNs pour attenuer l'expression de genes

Les microARNs appartiennent à la famille des petits ARNs non-codants et agissent comme inhibiteurs des ARN messagers et/ou de leurs produits protéiques. Les mi- croARNs sont différents des petits ARNs interférants (siARN) car ils atténuent l’ex- pression au lieu de l’éliminer. Dans les dernières années, de nombreux microARNs et leurs cibles ont été découverts chez les mammifères et les plantes. La bioinforma- tique joue un rôle important dans ce domaine, et des programmes informatiques de découvertes de cibles ont été mis à la disposition de la communauté scientifique. Les microARNs peuvent réguler chacun des centaines de gènes, et les profils d’expression de ces derniers peuvent servir comme classificateurs de certains cancers. La modélisation des microARNs artificiels est donc justifiable, où l’un pourrait cibler des oncogènes surexprimés et promouvoir une prolifération de cellules en santé. Un outil pour créer des microARNs artificiels, nommé MultiTar V1.0, a été créé et est disponible comme application web. L’outil se base sur des propriétés structurelles et biochimiques des microARNs et utilise la recherche tabou, une métaheuristique. Il est démontré que des microARNs conçus in-silico peuvent avoir des effets lorsque testés in-vitro. Les sé- quences 3’UTR des gènes E2F1, E2F2 et E2F3 ont été soumises en entrée au programme MultiTar, et les microARNs prédits ont ensuite été testés avec des essais luciférases, des western blots et des courbes de croissance cellulaire. Au moins un microARN artificiel est capable de réguler les trois gènes par essais luciférases, et chacun des microARNs a pu réguler l’expression de E2F1 et E2F2 dans les western blots. Les courbes de crois- sance démontrent que chacun des microARNs interfère avec la croissance cellulaire. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes vers des possibilités thérapeutiques.