Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and replication which is phenotypically distinct from MARC-145 cell line

Background Airborne transmitted pathogens, such as porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), need to interact with host cells of the respiratory tract in order to be able to enter and disseminate in the host organism. Pulmonary alveolar macrophages (PAM) and MA104 derived monkey kidney MARC-145 cells are known to be permissive to PRRSV infection and replication and are the most studied cells in the literature. More recently, new cell lines developed to study PRRSV have been genetically modified to make them permissive to the virus. The SJPL cell line origin was initially reported to be epithelial cells of the respiratory tract of swine. Thus, the goal of this study was to determine if SJPL cells could support PRRSV infection and replication in vitro. Results The SJPL cell growth was significantly slower than MARC-145 cell growth. The SJPL cells were found to express the CD151 protein but not the CD163 and neither the sialoadhesin PRRSV receptors. During the course of the present study, the SJPL cells have been reported to be of monkey origin. Nevertheless, SJPL cells were found to be permissive to PRRSV infection and replication even if the development of the cytopathic effect was delayed compared to PRRSV-infected MARC-145 cells. Following PRRSV replication, the amount of infectious viral particles produced in SJPL and MARC-145 infected cells was similar. The SJPL cells allowed the replication of several PRRSV North American strains and were almost efficient as MARC-145 cells for virus isolation. Interestingly, PRRSV is 8 to 16 times more sensitive to IFNα antiviral effect in SJPL cell in comparison to that in MARC-145 cells. PRRSV induced an increase in IFNβ mRNA and no up regulation of IFNα mRNA in both infected cell types. In addition, PRRSV induced an up regulation of IFNγ and TNF-α mRNAs only in infected MARC-145 cells. Conclusions In conclusion, the SJPL cells are permissive to PRRSV. In addition, they are phenotypically different from MARC-145 cells and are an additional tool that could be used to study PRRSV pathogenesis mechanisms in vitro.

Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and resporatory syndrome virus replication

Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une des maladies les plus dévastatrices économiquement pour l'industrie mondiale du porc. L'agent étiologique du SRRP est le virus du SRRP (VSRRP) lequel est connu pour avoir une spécificité d'hôte très restreinte et pour sa transmission par voie aerosol. Les antigènes et les ARN du VSRRP ont été trouvés dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire de porcs infectés par le virus. L’interaction entre les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et le VSRRP a été démontrée comme jouant un rôle important dans l’infection causée par le virus. Malgré cela, l’interaction prenant place entre les cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin et le virus ne devrait pas être négligée. Jusqu’à présent, la réplication du VSRRP in vitro dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin n’a pas été conduite avec succès et les tentatives pour le faire ont échoué. Une nouvelle lignée de cellules épithéliales de poumon de porc (SJPL) est maintenant disponible et sera utilisée dans cette étude afin de déterminer si elle est permissive à la réplication du VSRRP et si elle peut être un modèle approprié pour l’étude de la pathogénèse virale du VSRRP. L’expérimentation a démontré que cette nouvelle lignée cellulaire était permissive à l’infection et à la réplication du VSRRP. Afin de corroborer ces résultats, la cinétique de réplication du virus à été effectuée avec les cellules MARC-145 et SJPL. Aucune différence significative dans la production virale totale n’a été trouvée entre les deux lignées cellulaires. Les cellules SJPL ont permis la réplication de plusieurs souches Nord-Américaines du VSRRP, quoiqu’elles sont légèrement moins efficaces que les cellules MARC-145 pour l’isolement du virus. De plus, les cellules SJPL sont phénotypiquement différentes des cellules MARC-145. Plus précisément, les cellules SJPL sont plus sensibles à l’activation par le VSRRP des pro-caspases 3/7 et plusieurs inducteurs apoptotiques. Elles ont également montré de 8 à 16 fois plus de sensibilité à l’effet antiviral causé par l’IFN-α sur la réplication du virus contrairement aux cellules MARC-145. Ces résultats démontrent que les cellules SJPL pourraient représenter un substitut intéressant aux cellules MARC-145 pour la production d’antigènes pour un vaccin anti-VSRRP. Également, dû à leurs origines (poumon de l’hôte naturel), elles pourraient s’avérer être un modèle in vitro plus approprié pour l’étude de la pathogénèse du VSRRP.

The role of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus structural and non-structural proteins in virus pathogenesis.

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is an economically devastating viral disease affecting the swine industry worldwide. The etiological agent, PRRS virus (PRRSV), possesses a RNA viral genome with nine open reading frames (ORFs). The ORF1a and ORF1b replicase-associated genes encode the polyproteins pp1a and pp1ab, respectively. The pp1a is processed in nine non-structural proteins (nsps): nsp1a, nsp1b, and nsp2 to nsp8. Proteolytic cleavage of pp1ab generates products nsp9 to nsp12. The proteolytic pp1a cleavage products process and cleave pp1a and pp1ab into nsp products. The nsp9 to nsp12 are involved in virus genome transcription and replication. The 30 end of the viral genome encodes four minor and three major structural proteins. The GP2a, GP3 and GP4 (encoded by ORF2a, 3 and 4), are glycosylated membrane associated minor structural proteins. The fourth minor structural protein, the E protein (encoded by ORF2b), is an unglycosylated membrane associated protein. The viral envelope contains two major structural proteins: a glycosylated major envelope protein GP5 (encoded by ORF5) and an unglycosylated membrane M protein (encoded by ORF6). The third major structural protein is the nucleocapsid N protein (encoded by ORF7). All PRRSV non-structural and structural proteins are essential for virus replication, and PRRSV infectivity is relatively intolerant to subtle changes within the structural proteins. PRRSV virulence is multigenic and resides in both the non-structural and structural viral proteins. This review discusses the molecular characteristics, biological and immunological functions of the PRRSV structural and nsps and their involvement in the virus pathogenesis.

Deletion of the RNR4 gene causes hyperresistance to the carcinogen 4-NQO in the yeast model

La stabilité génomique, qui est essentielle à la vie, est possible grâce à la réplication et la réparation de l’ADN. Une des enzymes responsables de la réplication et de la réparation de l’ADN est la ribonucleotide reductase (RNR), qui est retrouvée chez la levure et chez l’humain. Cette enzyme catalyse la formation de déoxyribonucléotides et maintien le pool de dNTP requis pour la réparation et la réplication de l’ADN. L’enzyme RNR est un tétramère α2β2 constitué d’une grande (R1, α2) et d’une petite (R2, β2) sous-unité. Chez S. cerevisiae, les gènes RNR1 et RNR3 encodent la sous-unité α2 (R1). L’activité catalytique de RNR dépend d’une interaction avec le fer et de la formation d’un complexe entre R1 et R2. L’expression de toutes les sous-unités est inductible par les dommages causés à l’ADN. Dans cette étude, nous démontrons que des cellules qui n’expriment pas une des sous-unités, Rnr4, du complexe RNR sont sensibles à divers agents endommageant l’ADN, tels que le méthyl méthane sulfonate, la bléomycine, le péroxyde d’hydrogène et les rayons ultraviolets (UVC 254 nm). Au contraire, le mutant est résistant au 4-nitroquinoline-1- oxide (4-NQO), un composé qui engendre des lésions encombrantes. Par conséquent, le mutant rnr4Δ démontre une réduction marquée en mutations induites par le 4-NQO comparativement à la souche parentale. Nous voulions identifier la voie de réparation de l’ADN qui conférait cette résistance au 4-NQO ainsi que les protéines impliquées. Les voies BER, NER et MMR n’ont pas aboli la résistance au 4-NQO de la souche rnr4Δ. La protéine recombinante Rad51 ne joue pas un rôle critique dans la réparation de l’ADN et dans la résistance au 4-NQO. La délétion du gène REV3, qui encode une polymérase de contournement, impliquée dans la réparation post-réplication, a partiellement aboli la résistance au 4-NQO dans rnr4Δ. Ces résultats suggèrent que la polymérase Rev3 et possiblement d’autres polymérases translésion (Rev1, Rev7, Rad30) pourraient être impliquées dans la réparation de lésions encombrantes dans l’ADN dans des conditions de carence en dNTP. La réparation de l’ADN, un mécanisme complexe chez la levure, implique une vaste gamme de protéines, dont certaines encore inconnues. Nos résultats indiquent qu’il y aurait plus qu’une protéine impliquée dans la résistance au 4-NQO. Des investigations plus approfondies seront nécessaires afin de comprendre la recombinaison et la réparation post-réplication.

Régulation dépendante du cycle cellulaire de la réparation par excision de nucléotides

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN.

Rôle de la structure du génome viral sur la réplication du virus de l’hépatite C.

Le virus de l'hépatite C (VHC) touche 3% de la population mondiale et environ 30% des patients chroniquement infectés développeront une fibrose hépatique. Son génome est un ARN simple brin de polarité positive qui possède un cadre ouvert de lecture flanqué de deux régions non traduites hautement conservées. Différents facteurs peuvent influencer le cycle de réplication du VHC. Deux d’entre eux ont été étudiés dans cette thèse. Tout d'abord, nous nous sommes intéressés à l'effet des structures secondaires et tertiaires du génome sur la réplication du VHC. Les extrémités 5' et 3' du génome contiennent des structures ARN qui régulent la traduction et la réplication du VHC. Le 3'UTR est un élément structural très important pour la réplication virale. Cette région est constituée d’une région variable, d’une séquence poly(U/C) et d’un domaine hautement conservé appelé région X. Des études in vitro ont montré que le 3'UTR possède plusieurs structures ARN double brin. Cependant, les structures ARN telles qu'elles existent dans le 3'UTR dans un contexte de génome entier et dans des conditions biologiques étaient inconnues. Pour élucider cette question, nous avons développé une méthode in situ pour localiser les régions ARN simple brin et double brin dans le 3'UTR du génome du VHC. Comme prédit par les études antérieures, nous avons observé qu’in situ la région X du 3’UTR du génome présente des éléments ARN double brin. Étonnamment, lorsque la séquence poly (U/UC) est dans un contexte de génome entier, cette région forme une structure ARN double brin avec une séquence située en dehors du 3'UTR, suggérant une interaction ARN-ARN distale. Certaines études ont démontré que des structures ARN présentes aux extrémités 5’ et 3' du génome du VHC régulent à la fois la traduction et la réplication du VHC. Cela suggère qu'il y aurait une interaction entre les extrémités du génome qui permettrait de moduler ces deux processus. Dans ce contexte, nous avons démontré l'existence d'une interaction distale ARN-ARN, impliquant le domaine II du 5'UTR et la séquence codante de NS5B du génome du VHC. En outre, nous avons démontré que cette interaction joue un rôle dans la réplication de l'ARN viral. Parallèlement, nous avons étudié l'impact d'une molécule immuno-modulatrice sur la réplication du VHC. La fibrose hépatique est une manifestation majeure de l’infection par le VHC. Hors, il a été montré qu'une molécule immuno-modulatrice appelée thalidomide atténuait la fibrose chez les patients infectés par le VHC. Cependant, son impact sur la réplication virale était inconnu. Ainsi, nous avons étudié l'effet de cette molécule sur la réplication du VHC in vitro et nous avons démontré que la thalidomide active la réplication du virus en inhibant la voie de signalisation de NF-kB. Ces résultats soulignent l’importance de la voie de signalisation NF-kB dans le contrôle de la réplication du VHC, et sont à prendre en considération dans l’établissement d’un traitement contre la fibrose hépatique.

Le maintien de la stabilité génomique du plastide : un petit génome d’une grande importance

Chez les plantes, le génome plastidique est continuellement exposé à divers stress mutagènes, tels l’oxydation des bases et le blocage des fourches de réplication. Étonnamment, malgré ces menaces, le génome du plastide est reconnu pour être très stable, sa stabilité dépassant même celle du génome nucléaire. Néanmoins, les mécanismes de réparation de l’ADN et du maintien de la stabilité du génome plastidique sont encore peu connus. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons développé une approche, basée sur l’emploi de la ciprofloxacine, qui nous permet d’induire des bris d’ADN double-brins (DSBs) spécifiquement dans le génome des organelles. En criblant, à l’aide de ce composé, une collection de mutants d’Arabidopsis thaliana déficients pour des protéines du nucléoïde du plastide, nous avons identifié 16 gènes vraisemblablement impliqués dans le maintien de la stabilité génomique de cette organelle. Parmi ces gènes, ceux de la famille Whirly jouent un rôle primordial dans la protection du génome plastidique face aux réarrangements dépendants de séquences de microhomologie. Deux autres familles de gènes codant pour des protéines plastidiques, soit celle des polymérases de types-I et celle des recombinases, semblent davantage impliquées dans les mécanismes conservateurs de réparation des DSBs. Les relations épistatiques entre ces gènes et ceux des Whirly ont permis de définir les bases moléculaires des mécanismes de la réparation dépendante de microhomologies (MHMR) dans le plastide. Nous proposons également que ce type de mécanismes servirait en quelque sorte de roue de secours pour les mécanismes conservateurs de réparation. Finalement, un criblage non-biaisé, utilisant une collection de plus de 50,000 lignées mutantes d’Arabidopsis, a été réalisé. Ce criblage a permis d’établir un lien entre la stabilité génomique et le métabolisme des espèces réactives oxygénées (ROS). En effet, la plupart des gènes identifiés lors de ce criblage sont impliqués dans la photosynthèse et la détoxification des ROS. Globalement, notre étude a permis d’élargir notre compréhension des mécanismes du maintien de la stabilité génomique dans le plastide et de mieux comprendre l’importance de ces processus.

Rôle de l'autophagie dans la dissémination du VIH-1 par les cellules dendritiques dérivées des monocytes circulants

Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART.

Genome-wide location analysis and expression studies reveal a role for p110 CUX1 in the activation of DNA replication genes.

Proteolytic processing of the CUX1 transcription factor generates an isoform, p110 that accelerates entry into S phase. To identify targets of p110 CUX1 that are involved in cell cycle progression, we performed genome-wide location analysis using a promoter microarray. Since there are no antibodies that specifically recognize p110, but not the full-length protein, we expressed physiological levels of a p110 isoform with two tags and purified chromatin by tandem affinity purification (ChAP). Conventional ChIP performed on synchronized populations of cells confirmed that p110 CUX1 is recruited to the promoter of cell cycle-related targets preferentially during S phase. Multiple approaches including silencing RNA (siRNA), transient infection with retroviral vectors, constitutive expression and reporter assays demonstrated that most cell cycle targets are activated whereas a few are repressed or not affected by p110 CUX1. Functional classes that were over-represented among targets included DNA replication initiation. Consistent with this finding, constitutive expression of p110 CUX1 led to a premature and more robust induction of replication genes during cell cycle progression, and stimulated the long-term replication of a plasmid bearing the oriP replicator of Epstein Barr virus (EBV).

In vitro and in vivo virulence evaluation of the new genotype of porcine circovirus type 2 and identification of a new cell line permissive to virus replication

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

In vitro effect of deoxynivalenol (DON) mycotoxin on porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication.

Deoxynivalenol (DON) is a mycotoxin produced by Fusarium spp. Among monogastric farm animals, swine are the most susceptible to DON as it markedly reduces feed intake and decreases weight gain. DON has also been shown to increase susceptibility to viral infections; therefore the objective of this study was to investigate in vitro impact of DON on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Permissive cells were infected or not with PRRSV and were treated with increasing concentrations of DON. Cell survival and mortality were evaluated by determining the number of viable cells with a tetrazolium compound and by measuring lactate dehydrogenase (LDH) release, respectively. Virus titration and antiviral cytokines mRNA expression were evaluated by quantitative PCR. DON significantly affected the survival of noninfected cells in a dose dependent manner. However, DON concentrations between 140 and 280 significantly increased the survival of cells infected with PRRSV. These concentrations significantly decreased PRRSV replication by inducing a pro-inflammatory cytokines environment and an early activation of apoptosis, which in turn seem to interrupt viral replication. For the first time, this study showed that DON had significant effects on the survival of PRRSV infected cells and on virus replication, in a dose dependent manner.

Actinobacillus pleuropneumoniae induces SJPL cell cycle arrest in G2/M-phase and inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication

Background: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most important pathogens in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it are commercially available. We recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the porcine pleuropneumonia causative agent, has an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. Objectives of this study were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae and (ii) to characterize the active molecules present in the bacterial culture supernatant. Methods: Antibody microarray analysis was used in order to point out cellular pathways modulated by the A. pleuropneumoniae supernatant. Subsequent, flow cytometry analysis and cell cycle inhibitors were used to confirm antibody microarray data and to link them to the antiviral activity of the A. pleuropneumoniae supernatant. Finally, A. pleuropneumoniae supernatant characterization was partially achieved using mass spectrometry. Results: Using antibody microarray, we observed modulations in G2/M-phase cell cycle regulation pathway when SJPL cells were treated with A. pleuropneumoniae culture supernatant. These modulations were confirmed by a cell cycle arrest at the G2/M-phase when cells were treated with the A. pleuropneumoniae culture supernatant. Furthermore, two G2/M-phase cell cycle inhibitors demonstrated the ability to inhibit PRRSV infection, indicating a potential key role for PRRSV infection. Finally, mass spectrometry lead to identify two molecules (m/z 515.2 and m/z 663.6) present only in the culture supernatant. Conclusions: We demonstrated for the first time that A. pleuropneumoniae is able to disrupt SJPL cell cycle resulting in inhibitory activity against PRRSV. Furthermore, two putative molecules were identified from the culture supernatant. This study highlighted the cell cycle importance for PRRSV and will allow the development of new prophylactic or therapeutic approaches against PRRSV.

Probe-level linear model fitting and mixture modeling results in high accuracy detection of differential gene expression

Affiliation: Institut de recherche en immunologie et en cancérologie, Université de Montréal

Contribution of the C-terminal tri-lysine regions of human immunodeficiency virus type 1 integrase for efficient reverse transcription and viral DNA nuclear import

Affiliation: Zhujun Ao, Éric Cohen & Xiaojian Yao : Département de microbiologie et immunologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal

Genes involved in the metabolism of fatty acids and risk for Crohn's disease in children: a candidate gene study

Contexte - La prévalence de la maladie de Crohn (MC), une maladie inflammatoire chronique du tube digestif, chez les enfants canadiens se situe parmi les plus élevées au monde. Les interactions entre les réponses immunes innées et acquises aux microbes de l'hôte pourraient être à la base de la transition de l’inflammation physiologique à une inflammation pathologique. Le leucotriène B4 (LTB4) est un modulateur clé de l'inflammation et a été associé à la MC. Nous avons postulé que les principaux gènes impliqués dans la voie métabolique du LTB4 pourrait conférer une susceptibilité accrue à l'apparition précoce de la MC. Dans cette étude, nous avons exploré les associations potentielles entre les variantes de l'ADN des gènes ALOX5 et CYP4F2 et la survenue précoce de la MC. Nous avons également examiné si les gènes sélectionnés montraient des effets parent-d'origine, influençaient les phénotypes cliniques de la MC et s'il existait des interactions gène-gène qui modifieraient la susceptibilité à développer la MC chez l’enfant. Méthodes – Dans le cadre d’une étude de cas-parents et de cas-témoins, des cas confirmés, leurs parents et des contrôles ont été recrutés à partir de trois cliniques de gastro-entérologie à travers le Canada. Les associations entre les polymorphismes de remplacement d'un nucléotide simple (SNP) dans les gènes CYP4F2 et ALOX5 ont été examinées. Les associations allélique et génotypiques ont été examinées à partir d’une analyse du génotype conditionnel à la parenté (CPG) pour le résultats cas-parents et à l’aide de table de contingence et de régression logistique pour les données de cas-contrôles. Les interactions gène-gène ont été explorées à l'aide de méthodes de réduction multi-factorielles de dimensionnalité (MDR). Résultats – L’étude de cas-parents a été menée sur 160 trios. L’analyse CPG pour 14 tag-SNP (10 dans la CYP4F2 et 4 dans le gène ALOX5) a révélé la présence d’associations alléliques ou génotypique significatives entre 3 tag-SNP dans le gène CYP4F2 (rs1272, p = 0,04, rs3093158, p = 0.00003, et rs3093145, p = 0,02). Aucune association avec les SNPs de ALOX5 n’a pu être démontrée. L’analyse de l’haplotype de CYP4F2 a montré d'importantes associations avec la MC (test omnibus p = 0,035). Deux haplotypes (GAGTTCGTAA, p = 0,05; GGCCTCGTCG, p = 0,001) montraient des signes d'association avec la MC. Aucun effet parent-d'origine n’a été observé. Les tentatives de réplication pour trois SNPs du gene CYP4F2 dans l'étude cas-témoins comportant 225 cas de MC et 330 contrôles suggèrent l’association dans un de ceux-ci (rs3093158, valeur non-corrigée de p du test unilatéral = 0,03 ; valeur corrigée de p = 0.09). La combinaison des ces deux études a révélé des interactions significatives entre les gènes CYP4F2, ALOX et NOD2. Nous n’avons pu mettre en évidence aucune interaction gène-sexe, de même qu’aucun gène associé aux phénotypes cliniques de la MC n’a pu être identifié. Conclusions - Notre étude suggère que la CYP4F2, un membre clé de la voie métabolique LTB4 est un gène candidat potentiel pour MC. Nous avons également pu mettre en évidence que les interactions entre les gènes de l'immunité adaptative (CYP4F2 et ALOX5) et les gènes de l'immunité innée (NOD2) modifient les risques de MC chez les enfants. D'autres études sur des cohortes plus importantes sont nécessaires pour confirmer ces conclusions.