Contrôle de la réponse immunitaire par l’indoleamine 2,3-dioxygénase : étude de la régulation d’une molécule immuno-suppressive dans les cellules cancéreuses et les lymphocytes B chez l’humain

Le système immunitaire se doit d’être étroitement régulé afin d’éviter que des réponses immunologiques inappropriées ou de trop forte intensité ne surviennent. Ainsi, différents mécanismes permettent de maintenir une tolérance périphérique, mais aussi d’atténuer la réponse lorsque celle-ci n’est plus nécessaire. De tels mécanismes sont cependant aussi exploités par les tumeurs, qui peuvent ainsi échapper à une attaque par le système immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mécanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement à la réponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de l’immunité visant à générer une réponse anti-tumorale par l’immunothérapie. L’un des mécanismes par lesquels les tumeurs s’évadent du système immunitaire est l’expression d’enzymes responsables du métabolisme des acides aminés dont l’une des principales est l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO). Cette dernière dégrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilité dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets négatifs sur la prolifération, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont présents. Bien que la régulation de l’expression de cette enzyme ait été largement étudiée chez certaines cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa régulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons posé l’hypothèse que différents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) régulent l’expression de l’IDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement démontré qu’une expression de l’IDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite à une interaction avec des TIIC. Cette induction indépendante du contact cellulaire résulte principalement de l’interféron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activés, mais est régulée à la baisse par l’interleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilisée comme agent chimiothérapeutique inhibe l’induction de l’IDO chez les cellules tumorales en réponse aux lymphocytes T activés. Cette observation pourrait avoir des conséquences importantes en clinique sachant qu’une forte proportion d’échantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime l’IDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvés également dans certaines tumeurs et qui interagissent étroitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles à une induction transcriptionnelle et traductionnelle de l’IDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable l’utilisation de l’IDO par les lymphocytes B comme mécanisme pour freiner la réponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant à la régulation de l’expression de la molécule immunosuppressive IDO dans les cellules cancéreuses. Ils démontrent que l’expression de l’IDO est influencée par la nature des cytokines présentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibée par la fludarabine, un agent utilisé pour le traitement de certains cancers. Ces données devraient être prises en considération dans la planification de futurs essais immunothérapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les réponses cliniques anti-tumorales.

Caractérisation de l’ADNc et de l’ADN génomique codant l’intégrine plaquettaire αIIb‐β3 chez un cheval atteint de Thrombasthénie de Glanzmann

La thrombasthénie de Glanzmann (TG) est une maladie caractérisée par un défaut d’agrégation plaquettaire. C’est une maladie génétique autosomale récessive causée par une anomalie du récepteur plaquettaire pour le fibrinogène. Ce récepteur est une intégrine localisée à la surface plasmatique qui est formée par un complexe composé des sous‐unités αIIb et β3. Nous avons identifié un cheval démontrant les caractéristiques clinicopathologiques de la TG. Des études par cytométrie de flux ont révélé une déficience au niveau de la portion αIIb du récepteur. Ces résultats suggèrent une ou plusieurs mutations au niveau du gène codant pour cette portion αIIb du récepteur. L’objectif de notre étude était de caractériser l’ADNc et l’ADN génomique codant pour les gènes ITGA2B et ITGB3 codant respectivement pour les deux sous‐unités αIIb et β3 chez un cheval atteint de la TG. L’ADNc a été synthétisé par RT‐PCR en utilisant l’ARN total récolté à partir des plaquettes. L’ADN génomique a été extrait à partir des globules blancs. Des amorces spécifiques ont été utilisées pour l’amplification par PCR d’ITGA2B et d’ITGB3. Les séquences d’ADNc et d’ADN génomique de notre patient ont été caractérisées par séquençage et comparées par l’analyse BLAST (GenBank). Une substitution d’une guanine par une cytosine a été mise en évidence au niveau de l’exon 2 d’ITGA2B amenant à la substitution d’une arginine (Arg72) par une proline (Pro72). Ce changement d’acide aminé pourrait résulter en une conformation structurelle anormale qui amènerait à une sous‐unité αIIb inactive. L’analyse de l’ADN génomique a démontré que ce cheval était homozygote pour cette mutation. Le séquençage de l’ADN génomique des parents et de la grand‐mère du patient a démontré que ces individus étaient hétérozygotes pour cette mutation. Le séquençage d’ITGB3 n’a démontré aucune anomalie.

Amino acid substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins are selected during mammalian reovirus adaptation to Vero cells

Establishment of viral persistence in cell culture has previously led to the selection of mammalian reovirus mutants, although very few of those have been characterized in details. In the present study, reovirus was adapted to Vero cells that, in contrast to classically-used L929 cells, are inefficient in supporting the early steps of reovirus uncoating and are also unable to produce interferon as an antiviral response once infection occurs. The Vero cell-adapted reovirus exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 proteins. This contrasts with uncoating mutants from persistently-infected L929 cells, and various other cell types, that generally harbor amino acids substitutions in the σ3 outer capsid protein. The Vero cell-adapted virus remained sensitive to an inhibitor of lysosomal proteases; furthermore, in the absence of selective pressure for its maintenance, t he virus has partially lost its ability to resist interferon. The positions of the amino acids substitutions on the known protein structures suggest an effect on binding of the viral σ1 protein to the cell surface and on μ1 disassembly from the outer capsid.

Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.