Expression et caractérisation du récepteur hypophysaire de rat du facteur de libération de l'hormone de croissance ainsi que de ses isoformes

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Étude d'un variant de la toxine STb produite par Escherichia coli

Les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont souvent la cause de diarrhée post-sevrage chez le porc. Deux types d’entérotoxines sont retrouvées chez les ETEC, soit les thermolabiles, comme la toxine LT, et les thermostables, comme EAST-1, STa et STb. Cette dernière est composée de 48 acides aminés et est impliquée dans la pathologie causée par les ETEC. Pour la première fois un variant de la toxine STb fut découvert dans une étude. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’il y a présence de variants dans la population de souches ETEC du Québec. Dans les 100 souches STb+ analysées, 23 possédaient le gène de la toxine avec une variation dans la séquence génétique : l’asparagine était présente en position 12 remplaçant ainsi l’histidine. Une corrélation entre la présence du variant et la présence de facteurs de virulence retrouvés dans ces 100 souches ETEC étudiées a été effectuée. Ce variant semble fortement associé à la toxine STa puisque toutes les souches variantes ont hybridé avec le gène codant pour cette dernière. Étant donné sa présence répandue dans la population de souches ETEC du Québec, nous avons de plus émis l’hypothèse que ce variant a des caractéristiques biologiques altérées par rapport à la toxine sauvage. L’analyse par dichroïsme circulaire a montré que le variant et la toxine sauvage ont une structure secondaire ainsi qu’une stabilité similaires. Par la suite, l’attachement au récepteur de la toxine, le sulfatide, a été étudié par résonnance plasmonique de surface (biacore). Le variant a une affinité au sulfatide légèrement réduite comparativement à la toxine sauvage. Puisque l’internalisation de la toxine fut observée dans une étude précédente et qu’elle semble liée à la toxicité, nous avons comparé l’internalisation du variant et de la toxine sauvage à l’intérieur des cellules IPEC-J2. L’internalisation du variant dans les cellules est légèrement supérieure à l’internalisation de la toxine sauvage. Ces résultats suggèrent que le variant est biochimiquement et structurellement comparable à la toxine sauvage.

Structure d'une tagatose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : étude d'une apparente perte de stéréospécificité

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase de classe I qui fait montre d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-biphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-biphosphate (FBP), du sorbose-1,6-biphosphate et du psicose-1,6-biphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution de la structure native et en complexe avec le DHAP, a respectivement 1.87 et 1.92 Å de résolution. Ces mêmes structures ont permis de se représenter plus clairement le site actif de l'enzyme en général, et les résidus catalytiques en particulier. Le trempage des cristaux de TBP aldolase dans une solution saturante de DHAP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire iminium, ainsi que sa géométrie particulière en atteste. Des expériences d'échange de proton, entreprises afin d'évaluer le stéréoisomérisme du transfert de proton catalytique, ont également permis de faire une intéressante découverte : la TBP aldolase ne peut déprotoner le coté pro-R du C3 du DHAP, mais peut le protonner. Ce résultat, ainsi que la comparaison de la structure du complexe TBP aldolase-DHAP avec la structure du complexe FBP aldolase de muscle de lapin- DHAP, pointe vers un isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP. De plus, la résolution de ces deux structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.

Étude structure-fonction des fructose-1,6-bisphosphate aldolases métallo-dépendantes : mécanisme catalytique et développement d’antimicrobiens

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Application des librairies de codons dégénérés à l'étude du mécanisme de repliement et de la stabilisation de la structure du domaine liant ras de Raf

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Étude structure / fonction des sous-unités catalytiques de l'ARN polymérase II

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Influence de la structure moléculaire sur la structure cristalline et électronique de molécules organiques conjuguées : une étude spectroscopique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Conception, synthèse et diversification de l'azaGly-Pro : un mime de tour beta, outil d'étude structure-activité : application au développement d'un nouvel agent tocolytique

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré.

Étude structure/fonction des cotransporteurs Na+/glucose

Cette thèse porte sur l’étude de la relation entre la structure et la fonction chez les cotransporteurs Na+/glucose (SGLTs). Les SGLTs sont des protéines membranaires qui se servent du gradient électrochimique transmembranaire du Na+ afin d’accumuler leurs substrats dans la cellule. Une mise en contexte présentera d’abord un bref résumé des connaissances actuelles dans le domaine, suivi par un survol des différentes techniques expérimentales utilisées dans le cadre de mes travaux. Ces travaux peuvent être divisés en trois projets. Un premier projet a porté sur les bases structurelles de la perméation de l’eau au travers des SGLTs. En utilisant à la fois des techniques de modélisation moléculaire, mais aussi la volumétrie en voltage imposé, nous avons identifié les bases structurelles de cette perméation. Ainsi, nous avons pu identifier in silico la présence d’une voie de perméation passive à l’eau traversant le cotransporteur, pour ensuite corroborer ces résultats à l’aide de mesures faites sur le cotransporteur Na/glucose humain (hSGLT1) exprimé dans les ovocytes. Un second projet a permis d’élucider certaines caractéristiques structurelles de hSGLT1 de par l’utilisation de la dipicrylamine (DPA), un accepteur de fluorescence dont la répartition dans la membrane lipidique dépend du potentiel membranaire. L’utilisation de la DPA, conjuguée aux techniques de fluorescence en voltage imposé et de FRET (fluorescence resonance energy transfer), a permis de démontrer la position extracellulaire d’une partie de la boucle 12-13 et le fait que hSGLT1 forme des dimères dont les sous-unités sont unies par un pont disulfure. Un dernier projet a eu pour but de caractériser les courants stationnaires et pré-stationaires d’un membre de la famille des SGLTs, soit le cotransporteur Na+/myo-inositol humain hSMIT2 afin de proposer un modèle cinétique qui décrit son fonctionnement. Nous avons démontré que la phlorizine inhibe mal les courants préstationnaires suite à une dépolarisation, et la présence de courants de fuite qui varient en fonction du temps, du potentiel membranaire et des substrats. Un algorithme de recuit simulé a été mis au point afin de permettre la détermination objective de la connectivité et des différents paramètres associés à la modélisation cinétique.

Étude de la Structure-Fonction du Prosegment et du domaine CHRD de la PCSK9 humaine

L’excès des particules de LDL dans le sang constitue un facteur de risque majeur dans le développement des maladies cardiovasculaires. Dans ce contexte, nous étudions la protéine PCSK9 qui favorise directement ce facteur de risque. Cette protéine est sécrétée en majorité au niveau du foie par les hépatocytes et possède la capacité de reconnaître et de lier le récepteur LDLR. Le rôle premier de ce dernier est d’éliminer les particules de LDL circulant dans le plasma. Ainsi, lorsque la PCSK9 forme un complexe avec le LDLR et l’amène à la dégradation, la conséquence directe de la diminution des ces récepteurs est une accumulation malsaine des particules LDL dans le plasma. L’importante implication de la PCSK9 dans le métabolisme des lipides nous a menés vers des recherches de caractérisation de cette protéine ainsi que dans l’étude de son mode d’action. La PCSK9 est composée de trois domaines et notre intérêt s’est porté sur l’étude structure-fonction des deux domaines dont la fonction était inconnue, soit le domaine en N-terminal : le prodomaine et de son domaine en C-terminal : CHRD. Le premier article présenté dans cette thèse révèle l’importance d’une région acide (acide aminés 33-58) régulatrice de l’activité de la PCSK9 localisée en N-terminal du prodomaine ainsi que l’effet du pH acide, équivalent à celui des endosomes tardifs, qui accroît la capacité de la PCSK9 à induire la dégradation du LDLR. Le deuxième article dissèque davantage la structure de la PCSK9 et met en lumière la différence des prérequis structurels de la région ‘’Hinge’’ ainsi que du module M2, composant du domaine CHRD, dans la voie intracellulaire et la voie extracellulaire d’activité de la PCSK9. La mutation R434W localisée dans la région ‘’Hinge’’ résulte dans une inhibition totale de l’activité intracellulaire de la PCSK9 tandis que son activité extracellulaire est réduite à ~70%. Contrairement, la perte du module M2 du domaine CHRD est bien tolérée par la PCSK9 lors de son activité intracellulaire mais totalement inhibitrice pour son activité extracellulaire. Le troisième article se distingue en présentant une nouvelle stratégie d’inhibition de l’activité de la PCSK9 en utilisant une chimère composée de la fraction Fc de l’immunoglobuline IgG1 humaine couplée avec le prodomaine de la PCSK9. La protéine fusion Fcpro lie directement la PCSK9, crée un encombrement structurel qui résulte dans une régulation négative l’activité de la PCSK9. En résumé, nous présentons dans cette thèse, trois manuscrits qui apportent une contribution à la connaissance des composantes structurelles de la PCSK9 et leur implication dans le rôle de la protéine en tant que régulateur négatif du LDLR.

Étude de l’effet d'agents potentiellement perturbateurs de la structure des biofilms sur la diffusion des macromolécules dans les biofilms de Streptococcus mutans : cas de l’EDTA et de l’aspirine

Le but de ce travail de mémoire était d'explorer des moyens pour augmenter la perméabilité des biofilms de Streptococcus mutans aux macromolécules en utilisant des agents potentiellement perturbateurs de la structure des biofilms. L’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) ainsi que l’acide acétylsalicylique (aspirine) sont les agents perturbateurs choisis. Le changement de perméabilité des biofilms de S. mutans a été déterminé en mesurant les coefficients de diffusion globale du polyéthylène glycol (PEG) et de diffusion locale de dextrans. Les coefficients de diffusion globale ont été mesurés par spectroscopie infrarouge avec un échantillonnage par réflexion totale atténuée (ATR) alors que la spectroscopie par corrélation de fluorescence (SCF) a été utilisée pour la mesure des coefficients de diffusion locale. Les résultats ont démontré que l’incorporation de l’EDTA à une concentration de 7.5 (m/v) % dans la solution de diffusion permet d’améliorer les propriétés de transport du PEG dans les biofilms en augmentant sa pénétrabilité et son coefficient de diffusion globale. Par contre, aucune variation n’a été constatée dans la valeur du coefficient de diffusion locale de dextran fluorescent. Cette différence peut être expliquée, entre autres, par l'échelle des mesures et la nature différente des molécules diffusantes. L’aspirine n’a démontré aucun effet sur le transport du PEG à travers les biofilms de S. mutans. La pénétration accrue du PEG en présence de l’EDTA a été corrélée aux tests de viabilité des cellules bactériennes. En effet, la combinaison de la pénicilline G (PenG) avec l’EDTA 2 (m/v) % a eu comme effet l’augmentation du pouvoir biocide d’un facteur 3. De plus, les images de microscopie à épifluorescence et de microscopie confocale à balayage de laser ont démontré que les bactéries dans le cœur des microcolonies sont plus affectées par la PenG lorsque le milieu contient de l'EDTA. A la lumière des résultats obtenus, il s’avère que l’incorporation d'agents perturbateurs de la structure des biofilms est une option sérieuse à considérer dans l’éradication des biofilms microbiens. Plus d’études devront être effectuées afin d’investiguer l’effet d’autres molécules possédant les propriétés perturbatrices de la structure des biofilms sur la résistance de ces derniers aux agents antimicrobiens.

Étude structuro-fonctionnelle de SecP43 et caractérisation de ses interactions avec SepSecS et l’ARNtSec in vitro

Selenoproteins are proteins containing selenium in the form of the 21st amino acid, selenocysteine. Selenocysteine (Sec) is directly synthesized onto its cognate tRNA (tRNA[Ser]Sec or tRNASec) and inserted into selenoproteins co-translationally with the help of various cis- and trans-acting factors. Among those factors, SecP43 has been reported to possibly play an essential role in the methylation at the 2’-hydroxylribosyl moiety in the wobble position (Um34) of Sec-tRNA[Ser]Sec and consequently reduce the expression of glutathione peroxidase 1. SecP43 also called tRNASec-associated protein has also been reported to interact in with SepSecS and tRNASec in vivo and the targeted removal of one of these proteins affected the binding of the other to the Sec-tRNASec. The initial aim of the project was to solve the structure of SecP43 by means of x-ray crystallography. Secondly, we were interested in characterizing the interaction of the latter with some of the components of the selenocysteine insertion machinery. These factors are SepSecS and tRNASec. We were able to optimize the expression and the purification of soluble form of the human homologue of SecP43 and of SepSecS by using an adapted auto-induction protocol. This was a major challenge considering that full length SecP43 has not been expressed and purify to date. We did not succeed in crystallizing SecP43. Our failure to crystallize SecP43 is probably due to the fact that it is a partially folded protein as we were able to demonstrate by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). The SecP43 envelope calculated by SAXS displayed a rod-shape like structure. In order to enhance the stability of SecP43 required for crystallization, binding affinity studies were conducted to characterize the interaction between SecP43, tRNASec and SepSecS. We did not detect an interaction between SecP43 and tRNASec by using EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and gel filtration. We also could not detect an interaction between SecP43 and SepSecS using a cross-linking assay. In contrast, the tRNASec/SepSecS interaction was demonstrated by EMSA and the addition of SecP43 seemed to reduce the binding affinity. Therefore, SecP43 might induce a conformational change in SepSecS in the presence of tRNASec.

Étude in vivo de la relation entre la structure et la fonction de la boucle variable de l'ARN de transfert de la sélénocystéine d'E. coli

La sélénocystéine est le 21e acide aminé encodé génétiquement et on la retrouve à travers les trois domaines de la vie. Elle est synthétisée sur l'ARNtSec par un processus unique. L'ARNtSec se distingue également au niveau structural. La tige acceptrice possède 8 (procaryotes) et 9 (eucaryotes) paires de bases, contrairement aux ARNt canoniques qui ont invariablement 7 paires de bases dans la tige acceptrice. De plus, la tige D a 2 paires de bases additionnelles qui remplacent les interactions tertiaires universelles 8-14, 15-48 qui sont absentes chez l'ARNtSec. D'autre part, la longueur de la boucle variable de l'ARNtSec est plus longue que la majorité des ARNt de type II. Dans ce mémoire, on se concentre sur la région de la boucle variable de l'ARNtSec . La recherche consiste à distinguer les paires de bases de la boucle variable qui sont essentielles à la biosynthèse et l’insertion de la sélénocystéine. De plus, on regarde si la paire de base additionnelle de la tige acceptrice de l'ARNtSec (procaryote) est essentielle pour l'insertion de la sélénocystéine. Pour répondre à ces questions, on a utilisé l'approche expérimentale Évolution Instantanée qui consiste au criblage in vivo d'ARNtSec fonctionnels chez E. coli. Dans ce travail, on montre que l'insertion de la sélénocystéine ne nécessite pas une spécificité de la longueur ou de la séquence de l'ARNtSec. On montre aussi que ni la longueur de la tige acceptrice ou du domaine tige acceptrice/tige T n'est essentielle pour avoir un ARNtSec fonctionnel.