Identification de nouveaux substrats des kinases Erk1/2 par une approche bio-informatique, pharmacologique et phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle.

Exposition aux pesticides et risque de diabète de type 2 : une étude au nord du Bénin (Afrique de l'Ouest)

Introduction : La présente étude explore pour la première fois en Afrique, l'association entre l'exposition aux pesticides organochlorés (POC) et le risque de diabète de type 2. L’étude se déroule dans la région du Borgou, au nord du Bénin, où l’utilisation intense de pesticides pour la culture du coton coïncide avec une prévalence élevée du diabète par rapport aux autres régions du pays. Objectifs: 1) Décrire le niveau d’exposition de la population des diabétiques et non diabétiques du Borgou par le taux sérique de certains pesticides organochlorés ; 2) Explorer la relation entre le risque de diabète de type 2 et les concentrations sériques des POC; 3) Examiner l’association entre l’obésité globale, le pourcentage de masse grasse et l’obésité abdominale avec les concentrations sériques des POC; 4) Explorer la contribution de certaines sources d’exposition alimentaire et non-alimentaire aux concentrations sériques des POC. Méthodes : Il s'agit d'une étude cas-témoin qui concerne 258 adultes de 18 à 65 ans identifiés par deux valeurs glycémiques capillaire et veineuse au seuil de 7 mmol/l pour les diabétiques et 5,6mmol/l pour les témoins non diabétiques. Les 129 témoins ont été appariés aux 129 cas selon les critères suivants : l’ethnie, l’âge ± 5ans, le sexe et la localité de résidence. Les informations personnelles et celles portant sur les modes d’exposition ont été recueillies par questionnaire. Les concentrations sériques des POC ont été obtenues par chromatographie gazeuse couplée d’une spectrométrie de masse. L’obésité globale est déterminée par l’IMC ≥ 30 kg/m2. L’obésité abdominale est obtenue par le tour de taille selon les critères consensuels d’Alberti et al. pour la définition du syndrome métabolique. Le pourcentage de masse corporelle a été mesuré par bio-impédance électrique et été considéré comme élevé au seuil de 33% chez les femmes et 25% chez les hommes. Résultats: En comparant les 3ème et premier terciles des concentrations de p,p’-DDE et p,p’-DDT, les sujets du 3e tercile étaient deux à trois fois plus susceptibles de présenter du diabète que ceux du 1er tercile. La probabilité d’obésité abdominale ou de l’obésité générale (en contrôlant pour le statut diabétique) était accrue de trois à cinq fois dans le dernier tercile pour trois des quatre POC qui étaient détectables soit p,p’-DDT, β-HCH et trans-Nonachlore. Les facteurs socioéconomiques associés aux POC sériques sont le niveau d’éducation élevé, un meilleur revenu et la résidence en milieu urbain. Les sources d’exposition non alimentaire significativement associées aux concentrations sériques de POC étaient l’exposition professionnelle mixte (primaire et secondaire) aux pesticides et la consommation de tabac local. L’achat en opposition à l’autoproduction de plusieurs groupes de denrées alimentaire était associé à de plus fortes teneurs de POC. La fréquence de consommation hebdomadaire du poisson, des légumes, du fromage, de l’igname séchée ainsi que du mil, de l’huile de palme et de certaines légumineuses comme le soya, le néré, le niébé et le voandzou était significativement associées aux POC sériques. Conclusion : L’étude a mis en évidence la relation entre le niveau sérique de pesticides organochlorés d’une part, du diabète ou de l’obésité d’autre part. Les concentrations de POC observées au Borgou sont assez élevées et méritent d’être suivies et comparées à celles d’autres régions du pays. Les facteurs contribuant à ces teneurs élevées sont le niveau d’éducation élevé, un meilleur revenu, la résidence en milieu urbain, l’achat et la fréquence de consommation de plusieurs aliments. La contribution du mélange des polluants auxquels les habitants de cette région sont exposés à la prévalence croissante du diabète mérite d’être examinée, notamment les pesticides utilisés actuellement dans la région pour les productions de rente et autres polluants persistants. Ces résultats contribuent à accroître les connaissances sur les facteurs de risque émergents pour le diabète que sont des polluants environnementaux comme les pesticides. Les implications pour la santé publique sont importantes tant pour la prévention des maladies chroniques que pour la sensibilisation des autorités politiques du pays pour une politique agricole et sanitaire adéquate visant la réduction de l’exposition aux pesticides.