Phosphoproteome profiling approaches for comprehensive monitoring of cell signaling events in interferon-[gamma] stimulated macrophages

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Développement de peptidomimétiques antagonistes du récepteur de l’interleukine-1β

Dans ce mémoire, je présente mes études sur la synthèse, la caractérisation et l’évaluation biologique de différentes séries d’analogues du D-heptapeptide appelé 101.10, un modulateur négatif allostérique du récepteur de l’interleukine-1β (IL-1β). Sachant que les peptides ont généralement de faibles propriétés pharmacologiques, le but de ce projet portait sur l’examen des structures nécessaires à la bioactivité, la conformation tridimensionnelle de ces derniers afin d’améliorer la droguabilité du peptide parent. Les stratégies d’optimisation du 101.10 utilisées furent : la coupure N- et C-terminale; la substitution par la proline, α-amino-γ-lactame (Agl), β-amino-γ-lactame (Bgl) et α-amino-β-hydroxy-γ-lactame (Hgl); et la rigidification du squelette à l’aide d’un bicycle, l’indolozidin-2-one (I2aa). Afin de clarifier certaines relations de structure-activité, quelques modifications furent apportées au peptide, incluant l’échange de la thréonine pour la valine, la permutation de la stéréochimie de certains résidus clés ainsi que le remplacement de certaines chaînes latérales par un méthyle. Pour pallier aux difficultés de reproductibilité des résultats avec des échantillons provenant de différentes sources, des études sur l’identité du contre-anion et la pureté du peptide furent conduites. Afin d’évaluer l’effet des modifications sur la conformation aqueuse et l’activité biologique du peptide, des analyses de dichroïsme circulaire et des tests in vitro mesurant l’inhibition de certains effets de l’IL-1β furent effectués. Ces essais cellulaires comportaient l’inhibition de la prolifération de cellules immunes et de l’activation des voies de signalisation inflammatoires du facteur nucléaire κB (NF-κB) et de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK), toutes deux stimulées par l’IL-1β. La compilation de ces données a permis de déceler certaines tendances entre la structure, la conformation et l’activité anti-IL-1β des peptidomimétiques.

Études génétiques moléculaires du gène de la polarité planaire SCRIBBLE1 chez les anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.

Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

Implication du peptide ScRALF3 dans le développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense

La coordination du développement par les communications intercellulaires est essentielle pour assurer la reproduction chez les plantes. Plusieurs études démontrent qu’une communication entre le sac embryonnaire et le tissu maternel, le sporophyte, est essentielle au bon développement des gamètes. Les molécules, peptides ou autres protagonistes impliqués dans ces voies de signalisation ainsi que leur mode d’action restent toutefois nébuleux. Les gènes de type RALF codent pour des petits peptides sécrétés retrouvés de manière spécifique ou ubiquitaire dans la plante. Leur structure en font de parfaits candidats pour permettre ces communications cellule-cellule entre les différents tissus. Treize gènes de type RALF ont été isolés actuellement chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Maintenant, nous montrons qu’un de ceux-ci, ScRALF3, est impliqué dans la polarisation du sac embryonnaire et dans la synchronicité des divisions mitotiques assurant la formation d’un gamétophyte femelle mature fonctionnel. Étant exprimé de manière spécifique au niveau des téguments de l’ovule, ScRALF3 est un candidat idéal pour réguler les communications cellule-cellule entre le sporophyte et le sac embryonnaire.

Conception, synthèse et diversification de l'azaGly-Pro : un mime de tour beta, outil d'étude structure-activité : application au développement d'un nouvel agent tocolytique

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré.

Caractérisation cytogénétique et moléculaire des translocations chromosomiques dans la phase blastique de la leucémie myéloïde chronique

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie.

Rôle de la déubiquitinase BAP1 dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle central dans divers processus biologiques. Elle peut être contrecarrée par les déubiquitinases (DUBs). "BRCA1-Associated Protein 1" (BAP1) est une déubiquitinase, qui fait partie de complexes multiprotéiques, possèdant une fonction de suppression tumorale ainsi qu'un potentiel anti-métastatique. De plus, BAP1 est phosphorylée suite aux dommages à l’ADN par les kinases ATM/ATR. En nous basant sur ces données, nous avons purifié les protéines associées à BAP1 dans des conditions de stress génotoxique. Bien que la composition du complexe et l’activité DUB semblent inchangées, nous avons pu identifier des changements critiques dans les niveaux et les sites de phosphorylation, confirmant la régulation de BAP1 suite aux dommages à l’ADN. En déplétant BAP1 par ARNi et en utilisant des mutants dominants négatifs, nous avons obtenu des résultats suggèrant que suite au stress génotoxique, cette DUB est requise pour prolonger le point de contrôle en G2/M et ce, en retardant la reprise du cycle cellulaire. D'un autre côté, l'expression de BAP1 dans des cellules cancéreuses qui en sont déficientes restore une ploïdie normale et diminue la fréquence d'aberrations nucléaires, suggérant que cette protéine joue un rôle dans la stabilité génomique. Nos résultats suggèrent fortement que BAP1 joue un rôle dans la réponse des cellules au stress génotoxique et la stabilité génomique. Nos travaux permettront ainsi d’identifier et de caractériser les voies de signalisation cellulaire régulant l’activité et la fonction de BAP1 durant les périodes d’exposition à des agents qui endommagent l’ADN. Les connaissances acquises seront donc d’une valeur tangible pour nôtre compréhension de la mutagenèse induite par des agents carcinogènes, un déterminant clé de la formation des tumeurs.

Étude préclinique de nouveaux médicaments inhibiteurs de PARP et Bcl-2 dans le neuroblastome

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante.

Impact of (pro)renin receptor deficiency in adipose tissue using a genetically engineered mouse model

La stimulation du récepteur de la rénine/prorénine [(P) RR], un membre récemment découvert du système rénine-angiotensine (SRA), augmente l'activité du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indépendante. Pour étudier l'impact potentiel du (P)RR dans le développement de l`obésité, nous avons émis l'hypothèse que les souris déficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le métabolisme du tissu adipeux, l'activité locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont été générées en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont été évalués hebdomadairement dans les mâles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors qu’ils étaient maintenu sur une diète normal. De plus, un groupe de femelles a été placé pour 6 semaines sur une diète riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activité ambulatoire ont été évaluées par l’EchoMRI et à l’aide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont été prélevés et pesés. De plus, les gras péri-gonadaux ont été utilisés pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont été évalués. Comme le gène du (P)RR est situé sur le chromosome X, les mâles étaient des KOs complets et les femelles étaient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport à WT, les différences étant plus prononcées chez les mâles. De plus, les femelles KOs étaient résistantes à l'obésité lorsqu'elles ont été placées sur la diète HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. L’analyse histologique des gras péri-gonadaux des KOs nous ont dévoilés qu’il avait une réduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de près de 3 fois de l'activité ambulatoire a été détectée chez les mâles. De plus, nous avons observé que leurs tibias étaient de longueur réduite ce qui suggère fortement l'affection de leur développement. Les gras péri-gonadaux des souris KO avaient une expression réduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associé avec le diabète de type II chez l'humain. Ainsi, les données recueillies suggèrent fortement que le (P)RR est impliquée dans la régulation du poids corporelle.

Regulation of excitotoxicity in thiamine deficiency : role of glutamate transporters.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Étude des mécanismes cellulaires activés par l'Angiopoïétine-1 et le VEGF régulant la perméabilité et la migration endothéliales

L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire existant. C’est un phénomène essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. L’activation des cellules endothéliales est contrôlée par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son récepteur le VEGFR-2 ont été prouvés comme étant spécifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le récepteur auquel se lie l’Ang-1, est requis aussi bien dans le développement vasculaire que dans l’angiogenèse tumorale. Il est connu que l’activation de Tie2 est nécessaire à la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la perméabilité vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premièrement découvert que le facteur de croissance pro-angiogénique, l’Ang-1 contrecarre les effets de perméabilité cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothéliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de l’activité de l’enzyme eNOS. Suite à l’activation de Tie2 par l’Ang-1, eNOS devient fortement phosphorylé sur la Thr497 après la phosphorylation et l’activation de la PKCζ. Nos résultats suggèrent que l’inhibition, par Tie2, de la perméabilité vasculaire durant l’angiogenèse serait due, en partie, à l’inhibition de la production de NO. Deuxièmement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothéliale induits par l’Ang-1 et le VEGF. À l’opposé du VEGF qui promeut une migration individuelle aléatoire, l’Ang-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette étude, nous avons identifié la β-caténine comme un nouveau partenaire moléculaire de la PKCζ. Cette association de la PKCζ à la β-caténine amène le complexe de polarité Par6-aPKC et le complexe des jonctions d’adhérences cellulaires à interagir ensemble à deux localisations différentes au niveau de la cellule endothéliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKCζ/β-caténine maintien la cohésion et l’adhésion cellulaire nécessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothéliales afin d’assurer la directionalité et la persistance de la migration endothéliale en réponse à l’Ang-1. D’une manière intéressante, lors de l’inhibition de la PKCζ ou de la β-caténine on assiste à un changement du mode de migration en réponse à l’Ang-1 qui passe d’une migration directionnelle collective à une migration individuelle aléatoire. Ce dernier mode de migration est similaire à celui observé chez des cellules endothéliales exposées au VEGF. Ces résultats ont été corroborés in vivo par une polarité et une adhésion défectueuses au cours de la vasculogenèse chez le poisson zèbre déficient en PKCζ. En résumé, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les réponses biologiques endothéliales déclenchées par le VEGF/VEGFR-2. L’identification des mécanismes moléculaires en aval de ces deux récepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la compréhension des différentes voies de signalisation activées par ces complexes moléculaires nous permettra de mettre la lumière sur des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies angiogéniques.

Rôle du facteur de transcription PITX1 dans la pathogenèse de l'arthrose.

L'arthrose ou ostéoarthrite (OA) est la plus commune des maladies chroniques associées au vieillissement. La multiplicité des loci et des polymorphismes associés à l'OA suggère l'implication de nombreuses voies de signalisation. La plupart des voies empruntées partagent des points en commun avec le processus d'ossification endochondrale. Dans l'arthrose, la réinitiation de ce processus pourrait être responsable de la dégradation du cartilage et de la présence d'ostéophytes. Un des gènes ayant fait surface autant dans l'OA que dans le développement musculosquelettique est PITX1. Contrairement à ce que son nom l'indique, PITX1 n'est pas seulement exprimé dans la glande pituitaire mais également dans l'os, le cartilage, les muscles et les fibroblastes. Pitx1 joue un rôle clé dans l'identité des membres inférieurs et son inactivation complète chez la souris mène à un phénotype ressemblant aux membres supérieurs. Moins sévère, son inactivation partielle provoque des symptômes apparentés à l'arthrose précoce chez la souris vieillissante. Chez l'humain, une perte d'expression de PITX1 est observée dans le cartilage OA de concert avec une augmentation des protéines EXTL3, REG1 et PARP1. Ces dernières pourraient favoriser la phase initiale de régénération associée à l'arthrose. Pour induire la prolifération des chondrocytes, de bas niveaux de PITX1 sont nécessaires. À l'inverse, de hauts niveaux de PITX1 pourraient prévenir la prolifération et être responsables du statut différencié des chondrocytes articulaires normaux. L'étude des mécanismes de régulation du gène PITX1 a mené à l'identification d'un co-répresseur, nommé prohibitine (PHB1), lié sur une région promotrice distale. PHB1 est normalement retrouvé au niveau des mitochondries mais son accumulation nucléaire semble corréler avec la perte de PITX1 et l'initiation de l'OA. Cette découverte pourrait avoir un impact sur le diagnostic et d'éventuels traitements visant à prévenir l'apparition de l'arthrose.

Impact d’un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions sur le développement des interneurones corticaux : rôle de l’adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)

L’encéphalopathie hypoxique-­‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-­‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-­‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-­‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-­‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-­‐type (WT) de la sous-­‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-­‐natals équivalents EP 10-­‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-­‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-­‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-­‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique.