790 resultados para signalisation cellulaire
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La division cellulaire est influence par les diffrents stimuli provenant de lextrieur ou de lintrieur de la cellule. Plusieurs rseaux enzymatiques labors au cours de lvolution relayent linformation gnre par ces signaux. Les modules MAP kinases sont extrmement importants au sein de la cellule. Chez lhumain, 14 MAP kinases sont regroupes en sept voies distinctes intervenant dans le contrle dune myriade de processus cellulaires. ERK3/4 sont des homologues de ERK1/2 pour lesquelles on ne connat que trs peu de choses concernant leurs fonctions et rgulation. Ces MAP kinases sont dites atypiques puisquelles ont des particularits structurales et des modes de rgulation qui diffrent des autres MAP kinases classiques. Ainsi, notre laboratoire a dmontr que lactivit de ERK3 est rgule par le systme ubiquitine-protasome et quelle pourrait avoir un rle jouer dans le contrle de la diffrenciation et la prolifration cellulaire. La premire tude prsente dcrit la rgulation de ERK3 au cours du cycle cellulaire. Nous avons observ que ERK3 est hyperphosphoryle et saccumule spcifiquement au cours de la mitose. Des analyses de spectromtrie de masse ont men lidentification de quatre sites de phosphorylation situs lextrmit du domaine C-terminal. Nous avons pu dmontrer que la kinase mitotique CDK1/cycline B phosphoryle ces sites et que les phosphatases CDC14A et CDC14B les dphosphorylent. Finalement, nous dmontrons que la phosphorylation mitotique de ERK3 a pour effet de la stabiliser. Au dbut de mes tudes doctorales, la kinase MK5 fut identifie comme premier partenaire et substrat de ERK3. MK5 a trs peu de fonctions connues. Des donnes dans la littrature suggrent quelle peut moduler le cycle cellulaire dans certaines conditions. Par exemple, MK5 a rcemment t identifi comme inducteur de la snescence induite par loncogne Ras. Dans la deuxime tude, nous dcrivons une nouvelle fonction de MK5 dans le contrle du cycle cellulaire. Nous dmontrons par des expriences de gain et perte de fonction que MK5 ralentit lentre en mitose suite un arrt de la rplication. Cette fonction est dpendante de lactivit enzymatique de MK5 qui rgule indirectement lactivit de CDK1/cycline B. Finalement, nous avons identifi Cdc25A comme un nouveau substrat in vitro de MK5 dont la surexpression supprime leffet de MK5 sur lentre en mitose. En conclusion, nos rsultats dcrivent un nouveau mcanisme de rgulation de ERK3 au cours de la mitose, ainsi quune nouvelle fonction pour MK5 dans le contrle de lentre en mitose en rponse des stress de la rplication. Ces rsultats dmontrent pour la premire fois limplication de ces protines au cours de la transition G2/M. Nos travaux tablissent de nouvelles pistes dtudes pour mieux comprendre les rles encore peu dfinis des kinases ERK3/4-MK5.
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Linteraction dun ligand avec un rcepteur sept domaines transmembranaires (7TMR) coupl aux protines G, mne ladoption de diffrentes conformations par le rcepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer lactivation diffrentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et lactivit du rcepteur nest pas tout fait claire. Selon les modles classiques pharmacologiques, comme le modle du complexe ternaire, il nexiste quun nombre limit de conformations quun rcepteur peut adopter. Afin dtablir un lien entre la structure et la fonction des rcepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le rcepteur de chimiokine CXCR4 comme rcepteur modle. Ce dernier, est une cible thrapeutique prometteuse, impliqu dans lentre du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissmination de mtastases cancreuses. Grce au transfert dnergie par rsonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons dtecter les changements conformationnels des homodimres constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En consquence, nous avons mesur les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacit des mutants activer la protine Galphai est altre suite au traitement avec lagoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altrent la conformation du rcepteur ltat basal ainsi que la rponse conformationnelle induite suite au traitement avec lagoniste SDF-1, lagoniste partiel AMD3100 ou lagoniste inverse TC14012. Ainsi, diffrentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu une activation similaire de la protine G, ce qui implique une flexibilit des rcepteurs actifs qui ne peut pas tre explique par le modle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). galement, nous nous sommes intresss au rcepteur de chimiokine CCR2, exprim la surface des cellules immunitaires. Il joue un rle important dans linflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que lasthme. CCR2 forme des homodimres constitutifs et possde diffrents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a t suggre. Nous avons tudi le lien entre les conformations et les activations deffecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothse est que les diffrents ligands naturels induisent diffrentes conformations du rcepteur menant diffrentes fonctions. Nous montrons que les rponses de CCR2 aux diffrents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systmes que nous avons tudis. Ainsi, labsence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le mme rcepteur, ne rsulterait pas de mcanismes complexes de rgulation in vivo, mais ferait partie de leurs proprits pharmacologiques intrinsques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intresss au rcepteur de chimiokine CXCR7. Rcemment identifi, CXCR7 est le deuxime rcepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a t considre comme tant capable dinteragir uniquement avec le rcepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possdent un patron dexpression semblable dans les tissus. Nous avons valu leffet de lAMD3100, ligand synthtique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos rsultats montrent quAMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 CXCR7. Grce au BRET, nous montrons aussi quAMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et quil est un modulateur allostrique positif de la liaison de SDF-1 CXCR7. Aussi, nous montrons pour la premire fois le recrutement de la beta-arrestine 2 CXCR7 en rponse un agoniste. LAMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposs, ce qui appelle la prudence lors de lutilisation de cette molcule pour ltude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amnent des vidences quil existe plusieurs conformations actives des rcepteurs et appuient les modles de structure-activit des rcepteurs qui prennent en considration leur flexibilit conformationnelle.
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Lobjectif central de cette thse de Doctorat tait dinvestiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent prcocement au cours de la phase compense du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rle causal dans la progression vers linsuffisance cardiaque. Nos travaux antrieurs, raliss laide dun modle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montr quau cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries dveloppaient une vulnrabilit louverture du pore de permabilit transitionnelle (PTP : un lment cl de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci tait observable au stade compens du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observes dans le cur insuffisant. Ces rsultats nous ont amens suggrer que la vulnrabilit louverture du PTP pourrait constituer un mcanisme prcoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans ltude 1 de cette thse, nous avons tent de tester cette hypothse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de trs nettes diffrences au niveau de la propension dvelopper linsuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos tudes in vitro sur organelles isoles et in situ sur lorgane entier ont permis de confirmer que, dans le cur ACF, les mitochondries dveloppent une vulnrabilit louverture du PTP et lactivation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsquexposes des stress pertinents la pathologie (surcharge calcique, ischmie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD dmontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononc et une progression prcoce vers linsuffisance cardiaque, aucune diffrence ntait observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggrant quelles ne sont pas lorigine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, tout le moins en rponse la surcharge volumique. Nous avons par la suite dtermin, laide des mmes approches exprimentales, si cette vulnrabilit mitochondriale tait observable dans une cardiopathie dtiologie diffrente, plus spcifiquement celle qui est associe la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie gntique cause par une mutation de la protine dystrophine. Nos tudes menes (tudes 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie nont rvl aucune diffrence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modle dACF, les mitochondries dans le cur de souris mdx taient significativement plus vulnrables louverture du PTP lorsque soumises une I-R (tude 2). Par ailleurs, nous avons dmontr que ladministration aigu de sildnafil aux souris mdx induisait une abolition de louverture du PTP et de ses consquences signaltiques, une diminution marque du dommage tissulaire et une meilleure rcupration fonctionnelle la suite de lI-R (tude 3). Nous avons ensuite test chez la souris mdx ladministration aigu de SS31, un peptide anti-oxydant cibl aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur na t observ, suggrant que le tamponnement des radicaux libres est dune utilit limite si les perturbations de lhomostasie calcique typiques cette pathologie ne sont pas traites simultanment (tude 4). Globalement, les travaux effectus au cours de cette thse dmontrent que la vulnrabilit louverture du PTP constitue une dysfonction prcoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques dtiologies diffrentes. Par ailleurs, ces travaux suggrent des stratgies dintervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont lefficacit pour la prvention de linsuffisance cardiaque demande tre tablie.
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Les protines DOCK180 et ELMO cooprent ensemble biochimiquement et gntiquement afin dactiver la GTPase Rac1 lors de plusieurs vnements biologiques. Toutefois, le rle que jouent ces protines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous mettons lhypothse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour lintgration de la signalisation de Rac plutt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de faon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protine dchafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans lobjectif n 1, nous dmontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site dinteraction principal entre cette protine et DOCK180. De plus, nous dmontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 nest pas ncessaire pour lactivation de Rac, mais est plutt essentielle pour faciliter la rorganisation du cytosquelette induite par lactivation de Rac en aval de Dock180. Ces rsultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans lobjectif n 2, nous avons dcouvert lexistence dune homologie structurelle entre ELMO et un module dautorgulation de la formine Dia1, et avons identifi trois nouveaux domaines dans la protine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De faon analogue Dia1, nous avons dcouvert que ELMO ltat basal est autoinhib grce des intractions intramolculaires. Nous proposons que ltat dactivation des protines ELMO est rgul de faon similaire aux formines de la famille Dia, cest--dire grce des interactions avec dautres protines. Dans lobjectif n 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possde une double spcificit pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons dcouvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos rsultats nous permettent de supposer que dautres GTPases pourraient tre impliques dans lactivation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu ltat basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibe. Bien que le mcanisme dactivation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons dcouvert que, lorsquil y a stimulation cellulaire, certaines GTPases lies au GTP peuvent intragir avec le domaine RBD de ELMO pour relcher les contacts intramolculaires et/ou localiser le complexe la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir dancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de lactivation et de la signalisation de Rac.
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Lubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont trs peu dhomologie de squence, mais partagent des similarits remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme lUb et la majorit des autres Ubls, UFM1 se lie de faon covalente ses substrats par lintermdiaire dune cascade enzymatique. Il est de plus en plus frquemment rapport que les protines Ubls sont impliques dans des maladies humaines. Le gne Ufm1 est surexprim chez des souris de type MCP dveloppant une ischmie myocardique et dans les lots de Langerhans de patients atteints du diabte de type 2. UFM1 et ses enzymes spcifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservs chez les mtazoaires et les plantes suggrant un rle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modle animal le plus simple utilis en biologie. Sa morphologie, ses phnotypes visibles et ses lignes cellulaires ont t dcrits de faon dtaille. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gnes sur la longvit. Ce modle nous permet de facilement manipuler lexpression du gne Ufm1 et de mieux connatre ses fonctions. En diminuant lexpression du gne ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de lARN interfrence par alimentation, nous navons observ aucun problme morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possdaient un nombre de progniture normal. Cependant, les vers sauvage exposs lARNi dufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrles et ce, de faon indpendante de la voie de signalisation de linsuline/IGF. Chez le C. elegans la longvit et la rsistance au stress cellulaire sont intimement lies. Nous navons remarqu aucun effet dufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress prototoxique. Il est galement ncessaire au maintien de lintgrit neuronale au cours du vieillissement des animaux. Lensemble de nos donnes nous renseigne sur les fonctions putatives du gne Ufm1.
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Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rle crucial dans lorganisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus rcemment, le rle des centrosomes dans la rgulation de lentre en mitose a t mis en vidence. Les centrosomes semblent galement contribuer lactivation du point de contrle en G2/M en rponse aux lsions de lADN en servant de point de rencontre pour les rgulateurs du cycle cellulaire et les gnes de rponse aux dommages lADN. Lamplification du nombre de centrosomes est une caractristique des cellules tumorales mais de faon intressante, elle constitue aussi une rponse des cellules aux dommages lADN. Les mcanismes qui rgulent lhomostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rle des centrosomes dans la rgulation du point de contrle en G2/M en rponse aux dommages lADN, le recrutement et/ou lactivation au niveau des centrosomes des kinases impliques dans les voies de signalisation de ce point de contrle ont t tudis par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos rsultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En rponse lactivation du point de contrle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqus dans la rgulation de ce point de contrle, une analyse comparative des protomes de centrosomes purifis a galement t ralise par spectromtrie de masse. Pour tudier plus particulirement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons dvelopper des outils molculaires qui serviront dterminer le rle de la sous population de CHK2 localise aux centrosomes 1) dans la rgulation de lentre en mitose au cours dun cycle normal 2) dans lactivation et la stabilit du point de contrle en G2/M en rponse aux lsions lADN et 3) dans lhomostasie et la dynamiques des centrosomes en rponse aux dommages lADN. Cette tude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la rponse cellulaire au stress gnotoxiques anti-cancereux et de rvler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2.
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Le diabte auto-immun rsulte de la destruction des cellules bta pancratiques scrtrices dinsuline par les lymphocytes T du systme immunitaire. Il sensuit une dficience hormonale qui peut tre comble par des injections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, toutefois il demeure ce jour impossible de gurir les patients atteints de la maladie. De faon gnrale, un systme immunitaire sain reconnat une multitude dantignes diffrents et assure ainsi notre dfense lgard de diffrents pathognes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons gntiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent sactiver de faon aberrante suite la reconnaissance dantignes provenant du soi. Cest ce bris de tolrance qui mne au dveloppement de pathologies auto-immunes telles que le diabte auto-immun. Afin de limiter lauto-immunit, des mcanismes de slection stricts permettent dliminer la majorit des lymphocytes T prsentant une forte affinit envers des antignes du soi lors de leur dveloppement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes russissent toutefois chapper lapoptose et migrent en priphrie afin dy circuler en qute dun antigne spcifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mcanismes priphriques assurent le maintien de la tolrance immunitaire en faisant obstacle lactivation et la prolifration des lymphocytes T auto-ractifs. Lune des avenues afin dinhiber le dveloppement de rponses immunitaires aberrantes est la gnration de lymphocytes T rgulateurs. Ces cellules, dorigine thymique ou priphrique, peuvent arborer diffrents phnotypes et agissent via de multiples mcanismes afin dinactiver et/ou liminer les cellules impliques dans lapparition de pathologies auto-immunes. Lutilisation de modles murins transgniques a permis la mise en vidence dune population peu caractrise de lymphocytes T au potentiel rgulateur. En effet, la proportion de ces cellules T nexprimant pas les corcepteurs CD4 et CD8 (double ngatives, DN) a t inversement corrle la prdisposition lauto-immunit chez ces ii souris. Lobjectif principal de cette thse est de dmontrer la fonction immuno-rgulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs gntiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observ que les lymphocytes T DN exercent une activit cytotoxique lgard des lymphocytes B de faon spcifique lantigne, via la libration de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons tabli quun unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin dinhiber le dveloppement du diabte auto-immun chez des htes transgniques prdisposs la maladie. Le recours des souris dficientes pour lexpression du gne CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prdisposition au diabte auto-immun Idd13, qui contient le gne Sirp, a t identifi pour son rle dans la rgulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse gntique a rvl que dautres intervalles gntiques sont impliqus dans le contrle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situ en rgion proximale du chromosome 12 a t valid grce la cration de souris congniques. Grce aux rsultats prsents dans cette thse, notre comprhension de la biologie ainsi que de la rgulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la cration de thrapies cellulaires novatrices permettant de prvenir et de gurir diverses pathologies auto-immunes.
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Candida albicans est une levure pathogne qui, ltat commensal, colonise les muqueuses de la cavit orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systmiques svres. C. albicans a la capacit de se dvelopper sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouves chez lhte (temprature de 37C, pH neutre, prsence de srum) induisent la transition levure--hyphe (i.e. morphogense ou filamentation). Cette transition morphologique contribue la pathognicit de C. albicans, du fait que des souches prsentant un dfaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogense est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le dveloppement dantifongiques. En effet, il a dj t dmontr que linhibition de la transition levure--hyphe attnuait la virulence de C. albicans lors dinfections systmiques. Par ailleurs, des tudes ont dmontr que de nombreuses molcules pouvaient moduler la morphogense. Parmi ces molcules, certains acides gras, dont lacide linolique conjugu (CLA), inhibent la formation dhyphes. Ainsi, le CLA possderait des proprits thrapeutiques, du fait quil interfre avec un dterminant de pathognicit de C. albicans. Par contre, avant dvaluer son potentiel thrapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel dtudier son mode daction. Ce projet vise caractriser lactivit anti-filamentation des acides gras et du CLA et dterminer le mcanisme par lequel ces molcules inhibent la morphogense chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont t effectues afin dobtenir le profil transcriptionnel de la rponse de C. albicans au CLA. Lacide gras a entran une baisse des niveaux dexpression de gnes encodant des protines hyphes-spcifiques et des rgulateurs de morphogense, dont RAS1. Ce gne code pour la GTPase Ras1p, une protine membranaire de signalisation qui joue un rle important dans la transition levure--hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirm que le CLA inhibait linduction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement caus une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entran sa dlocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit lactivation de la voie de signalisation Ras1p-dpendante, inhibant ainsi la morphogense. Il est possible que le CLA altre la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en vidence le mode daction du CLA. Le potentiel thrapeutique du CLA pourrait maintenant tre valu dans un contexte dinfection, permettant ainsi de vrifier quune telle approche constitue vritablement une stratgie pour le traitement des candidoses.
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Des tudes de liaison et dassociation gntiques ont permis didentifier certains des facteurs de risque gntiques aux maladies inflammatoires de lintestin (MII) dans la rgion chromosomique 3p21. Dans cette rgion, le polymorphisme nuclotidique simple (SNP) codant non-synonyme du gne MST1, rs3197999, encodant pour la mutation R689C, a t associ et rpliqu la fois la colite ulcreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC). Un autre SNP, corrl des SNP codants non-synonymes du gne MST1R, a galement t associ la MC. Afin de dterminer si dautres variantes des gnes MST1 et MST1R sont associs la CU, nous avons test pour association des SNP de ces gnes. Seul un proxy de R689C a montr un signal dassociation significatif aux MII, ce qui suggre que R689C est la variante causale aux MII dans le gne MST1. En cherchant dterminer si la rgion 3p21 contenait plusieurs signaux dassociation mutuellement indpendants, trois SNP ont t identifis comme possible facteurs de risque indpendants, et ont t gnotyps dans des cas de CU et de MC et des tmoins, puis nos rsultats dassociation ont t combins ceux provenant de trois autres cohortes indpendantes. Les trois SNP, R689C (MST1), rs6802890 et rs7629936 (CDHR4), sont associs aux MII, mais une tude dassociation conditionnelle suggre quil existe en fait deux signaux dassociation mutuellement indpendants dans la rgion 3p21. Le signal principal provient de R689C, une mutation de la protine MSP. Cette protine a un rle dans linflammation chez les macrophages murins, et la migration, la cicatrisation et la survie chez les cellules pithliales. Dans cette tude, le rle de la MSP a t investigu dans des modles de macrophages humains et de cellules pithliales de clon, et seule la phosphorylation dAKT, un acteur dans la voie de signalisation de la survie cellulaire, a t module par la MSP dans nos modles. Ce projet a donc permis dapporter des connaissances sur les facteurs de risques gntiques aux MII dans la rgion 3p21, en identifiant 2 signaux dassociation indpendants, et en nous informant sur le rle de MST1, duquel provient le signal dassociation principal, chez les cellules humaines.
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Rsum Langiogense est lun des processus les plus importants pour le maintien de lhomostasie de loxygne dans les tissus. Le facteur de croissance de lendothlium vasculaire, VEGF, joue un rle primordial dans la rponse angiognique. Ce facteur de croissance mne lactivation du rcepteur de type 2 du facteur de croissance de lendothlium vasculaire, VEGFR-2. Suite une activation du VEGFR-2, plusieurs cascades de signalisation sont actives dans les cellules endothliales. Afin dattnuer cette signalisation, le VEGFR-2 est multi-ubiquitin sur des rsidus lysine et de cette manire, il est amen aux voies de dgradation, principalement dans les lysosomes. Cette ubiquitination est induite par lassociation de lubiquitine ligase (E3) c-Cbl un rsidu tyrosine phosphoryl du domaine C-terminal du rcepteur. Dans cette tude, nous avons identifi la tyrosine 1319 comme tant ncessaire pour lassociation de c-Cbl au VEGFR-2 et son ubiquitination. Nos rsultats dmontrent aussi que dans des cellules endothliales aortiques bovines, BAEC, la surexpression du rcepteur mutant Y1319F ralentit la dgradation du VEGFR-2 et induit une activation plus forte et prolonge de la synthtase endothliale du monoxyde dazote (eNOS). Ces rsultats nous permettent de mieux comprendre le droulement de la rgulation de la signalisation du VEGFR-2 au niveau intracellulaire. Mots-cls: [Angiogense, VEGFR-2, VEGF, c-Cbl, Ubiquitination, Tyrosine 1319, Dgradation]
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Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifie des familles de protines localises la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux lintrieur des cellules. Dintenses recherches effectues au cours des trente dernires annes ont men lidentification de dizaines de protines interagissant avec les RCPGs et contrlant la signalisation, la dsensibilisation, linternalisation et la dgradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus rgulant lactivit des rcepteurs partir de la membrane plasmique, les mcanismes molculaires contrlant la biosynthse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu la surface cellulaire sont trs peu caractriss. Une meilleure comprhension de ces processus ncessite lidentification de la machinerie protique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protomique bas sur le transfert dnergie de rsonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure dinteractions protiques dans les cellules vivantes, a men lidentification de plusieurs nouvelles protines localises dans la voie de scrtion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protines tant localises dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthse, du repliement adquat et du transport la membrane plasmique des rcepteurs, il est trs probable quelles soient impliques dans le contrle de lexpression des RCPGs la surface cellulaire. La caractrisation de lhomologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intracteur des RCPGs identifi dans le crible, a dmontr que cette protine localise dans les compartiments prcoces de la voie de scrtion (RE et ERGIC) interagit de faon slective avec les RCPGs. De plus, la suppression de lexpression endogne de cette protine pralablement non-caractrise, diminue le transport la membrane plasmique dun rcepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement lexport des RCPGs du RE. Ceci est support par lobservation que la surexpression de CNIH4 de faibles niveaux favorise la maturation dun rcepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons galement pu dmontrer que CNIH4 est associe la protine Sec23, une des composantes de lenveloppe des vsicules COPII qui sont responsables du transport des protines du RE vers le Golgi, suggrant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des rcepteurs dans ces vsicules. La surexpression de CNIH4 de trs hauts niveaux provoque galement la rtention intracellulaire des rcepteurs. Cet effet dominant ngatif pourrait tre caus par la titration dun autre facteur dexport des RCPGs. Une deuxime tude a permis de rvler que la protine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intracteur des RCPGs galement identifi dans le crible, interagit slectivement avec les rcepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protine aux fonctions prcdemment inconnues, rtablit le transport normal dun rcepteur en prsence de CNIH4 surexprime. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacit de CNIH4 augmenter la maturation dun rcepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggrant que ces deux protines forment un complexe rgulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thse, de nouvelles protines interagissant avec les RCPGs et contrlant leur expression la membrane plasmique ont donc t identifies, permettant une meilleure comprhension des mcanismes rgulant le transport des rcepteurs du RE la surface cellulaire.
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Les polymorphonuclaires neutrophiles (PMNs) reprsentent une arme primordiale dans la dfense contre divers agents pathognes; notamment les bactries, les champignons, les cellules tumorales de mme que les cellules infectes par des virus. Cependant, certaines pathologies relies linflammation chronique soulvent limplication des neutrophiles notamment dans larthrite rhumatode. La rponse inflammatoire persistante gnre par lactivation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite la scrtion non contrle de leurs produits cytotoxiques. Mme si lactivation chronique des neutrophiles est nfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait savrer un bon outil en cas de neutropnie, comme cest souvent le cas les patients ayant reu des traitements de chimiothrapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mcanisme daction impliqu dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isols par Lagraoui (1999), le milieu conditionn concentr (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% 9.5 vs 68% 2.5, p<0.01). Suivant le squenage du MCC paralllement au facteur semi-pur actif, deux protines ont t identifies la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : lalbumine et la ftuine. Notre projet vise donc comparer les effets de lalbumine et de la ftuine ceux du GM-CSF dans loptique dune thrapie alternative au GM-CSF en tant quadjuvant de chimiothrapie. La prsence dalbumine, de ftuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubs 24 heures avec la Mutamycin induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport la Mutamycin (Ctrl : 43% 10; A : 74% 3; F : (82% 6 et GM : 74% 7; p<0.01). Leffet de lalbumine dpend de la voie de la kinase PI3 mais galement celle la kinase ERK, alors que celle de la ftuine dpend de la kinase PI3. Similairement lEPO, lalbumine et la ftuine supporte la diffrentiation des HSCs en prcurseurs rythrocytaires de type BFU-E. Dans un modle murin de chiomioprotection, lalbumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrle des leukocytes de la rate (66 8 x106c/ml vs 81 16 x106c/ml) et du sang (3.6 0.4 x106c/ml vs 5.7 2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, lalbumine et la ftuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalit et mcansimes daction. Cependant, vu leur manque de spcificit, lapplication thrapeutique en tant quadjuvant de chiomiothrapie de lalbumine et la ftuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dgnratives et les vnements ischmiques pourraient savrer de bonnes cibles thrapeutiques, principalement pour lalbumine.
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La voie de la polarit planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrle le processus morphogntique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogense. La signalisation du PCP a t rcemment associe avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protine centrale de la voie PCP, exprime dans la ligne primitive et le msoderme pendant l'embryogense de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mne des mouvements de CE fautifs chez le poisson zbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre tude, nous avons investigu le rle de PRICKLE1 dans l'tiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-squenage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathognique des mutations ainsi identifies a t valu par des mthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un systme poisson zbre. Nous avons identifi dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides amins conservs. Ces mutations ont t prdites in silico daffecter la fonction de la protine et sont absentes dans une large cohorte de contrles de mme origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gne prickle1a de type sauvage chez lembryon de poisson zbre a dmontr quune mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens ngatif le phnotype du dfaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre tude dmontre que PK1 peut agir comme facteur prdisposant pour les ATN chez lhumain et largit encore plus nos connaissances sur le rle des gnes de la PCP dans la pathogense de ces malformations.
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La rgulation de lapoptose est importante dans le maintient de lhomostasie cellulaire et lintgrit du matriel gntique. Lapoptose est un mcanisme cellulaire qui limine les cellules endommages. Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies gntiques. La drgulation des gnes codants pour des composantes de la voie intrinsque de lapoptose est frquemment observe chez divers types de cancers, incluant la leucmie. Nous proposons que des polymorphismes fonctionnels localiss dans la rgion rgulatrice (rSNP) des gnes impliqus dans la voie dapoptose intrinsque auraient un impact significatif dans loncogense en modifiant le taux dexpression de ces gnes. Dans cette tude, nous avons valid, laide dune combinaison dapproches in silico et in vitro, limpact fonctionnel de la variabilit gntique sous la forme dhaplotypes (rHAPs), au niveau du promoteur proximal, de 11 gnes codant pour des composantes de la voie intrinsque de lapoptose. Pour ce faire, nous avons sous-clon les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le gne rapporteur lucifrase (pGL3b). Ces constructions furent utilises dans des essais de transfections transitoires dans 3 lignes cellulaires (Hela, Jeg3 et Jurkat). Nous avons observ quau moins 2 rHAPs influencent significativement lactivit transcriptionelle de faon allle spcifique. Ces rHAPs sont associs aux gnes YWHAB et YWHAQ. Les analyses de retard sur gel dlectrophorse (EMSA) ont permis didentifier 2 sites de liaison ADN-protine diffrentielles dans les rHAPs du gne YWHAB. La variabilit du niveau dexpression des gnes tudis pourrait contribuer la susceptibilit interindividuelle de dvelopper un cancer, tel que la leucmie de lenfant.
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Doctorat ralis en cotutelle avec le laboratoire de Franois Payre au Centre de Biologie du Dveloppement Toulouse, France (Universit de Toulouse III - Paul Sabatier)
