Rôle de l’enzyme PAS kinase dans la régulation du facteur de transcription PDX-1 dans la cellule bêta pancréatique.

Le diabète de type 2 (DT2) se caractérise par une production insuffisante d'insuline par le pancréas ainsi qu'une résistance des tissus périphériques à l'action de l'insuline. Dans les cellules bêta pancréatiques, le glucose stimule la production de l'insuline en induisant la transcription de son gène et la traduction ainsi que la sécrétion de sa protéine. Paradoxalement, une exposition prolongée et simultanée de ces cellules à de hautes concentrations de glucose en présence d'acides gras conduit à la détérioration de la fonction bêta pancréatique et au développement du DT2. Toutefois, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets du glucose ne sont que partiellement connus. L'objectif du travail décrit dans cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de la régulation de la transcription du gène de l'insuline. PDX-1 (de l’anglais pour pancreatic and duodenal homeobox 1) est un facteur de transcription majeur et essentiel tant pour le développement du pancréas que pour le maintien de sa fonction à l'état adulte. En réponse au glucose, PDX-1 se lie au promoteur du gène de l'insuline et induit sa transcription. Ceci est inhibé par l'acide gras palmitate. Dans la première partie des travaux effectués dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié deux mécanismes de régulation de la transcription du gène de l'insuline: le premier via ERK1/2 (de l'anglais pour extracellular-signal-regulated protein kinases 1 and 2) et le second par l’enzyme PASK (pour per-arnt-sim kinase). Nous avons également mis en évidence l'existence d'un troisième mécanisme impliquant l'inhibition de l'expression du facteur de transcription MafA par le palmitate. Nos travaux indiquent que la contribution de la signalisation via PASK est majeure. L'expression de PASK est augmentée par le glucose et inhibée par le palmitate. Sa surexpression dans les cellules MIN6 et les îlots isolés de rats, mime les effets du glucose sur l'expression du gène de l'insuline ainsi que sur l'expression de PDX-1 et prévient les effets délétères du palmitate. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel PASK augmente la stabilité protéique de PDX-1, soit via la phosphorylation et l'inactivation de la protéine kinase GSK3 bêta (de l'anglais pour glycogen synthase kinase 3 beta). Le glucose induit la translocation de PDX-1 du cytoplasme vers le noyau, ce qui est essentiel à sa liaison au promoteur de ses gènes cibles. L'exclusion nucléaire de PDX-1 a été observée dans plusieurs modèles ex vivo et in vivo de dysfonction de la cellule bêta pancréatique. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons démontré l'importance de l'utilisation de cellules primaires (îlots isolés et dispersés) pour étudier la translocation nucléaire de PDX-1 endogène étant donné que ce mode de régulation est absent dans les lignées insulino-sécrétrices MIN6 et HIT-T15. Ces études nous ont permis d'identifier et de mieux comprendre les mécanismes régulant la transcription du gène de l'insuline via le facteur de transcription PDX-1. Les cibles moléculaires ainsi identifiées pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. Mots-clés : Diabète, îlots de Langerhans, cellule bêta pancréatique, gène de l'insuline, PDX-1, PASK, GSK3 bêta, ERK1/2, PKB, glucose, palmitate.

Rôle des récepteurs Toll-like et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la régulation de l’hepcidine et le développement des hyposidérémies associées à l’inflammation

Le fer est un oligo-élément nécessaire pour le fonctionnement normal de toutes les cellules de l'organisme et joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques. Cependant, le niveau de fer dans le corps doit être bien réglé, sinon la carence en fer entraine des divers états pathologiques tels que l'anémie et la diminution de l’immunité. D'autre part, une surcharge en fer potentialise la multiplication des germes, aggrave l’infection et la formation de radicaux libres ayant des effets toxiques sur les cellules et leurs composants, ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le cancer. L'hepcidine (HAMP), un régulateur négatif de l'absorption du fer, induit la dégradation de la ferroportine (FPN), le seul exportateur connu de fer ce qui réduit sa libération par les macrophages et inhibe son absorption gastro-intestinale. HAMP est synthétisé principalement par les hépatocytes, mais aussi par les macrophages. Cependant, il y a très peu de données sur la façon dont HAMP est régulé au niveau des macrophages. Plus récemment, nous avons constaté que l’induction de l’hepcidin dans le foie par le polysaccharide (LPS) est dépendante de la voie de signalisation médiée par « Toll-like receptor 4 » (TLR4). Grâce au TLR4, le LPS induit l'activation des macrophages qui sécrètent de nombreuses différentes cytokines inflammatoires, y compris Interleukine 6 (IL-6), responsable de l'expression de HAMP hépatique. Dans le premier chapitre de la présente étude, nous avons étudié la régulation de HAMP dans la lignée cellulaire macrophagique RAW264.7 et dans les macrophages péritonéaux murins stimulés par différents ligands des TLRs. Nous avons constaté que TLR2 et TLR4 par l'intermédiaire de la protéine adaptatrice « myeloid differentiation primary response gene 88 » (MyD88) activent l'expression de HAMP dans les cellules RAW264.7 et les macrophages péritonéaux sauvages murins, tandis que cette expression a été supprimée dans les macrophages isolés des souris TLR2-/-, TLR4-déficiente ou MyD88-/-. En outre, nous avons constaté que la production d'IL-6 par les cellules RAW264.7 stimulées avec du LPS a été renforcée par l’ajout des quantités élevées de fer dans le milieu de culture. Au cours de l’inflammation, le niveau de HAMP est fortement augmenté. Ainsi, lorsque l'inflammation persiste, l’expression de HAMP continue à être activée par des cytokines pro-inflammatoires conduisant à une hyposidérémie. Malgré que cette dernière soit considérée comme une défense de l'hôte pour priver les micro-organismes de fer, celle ci cause un développement d'anémies nommées anémies des maladies chroniques. Ainsi, dans le deuxième chapitre de la présente étude, nous avons étudié l'implication des TLRs et leurs protéines adaptatrices MyD88 et TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) dans le développement des hyposidérémies. En utilisant des souris déficientes en MyD88 et TRIF, nous avons montré que les voies de signalisations MyD88 et TRIF sont essentielles pour l’induction de HAMP par le LPS. Malgré l'absence de HAMP, les souris déficientes ont été capables de développer une hyposidérémie, mais la réponse des souris déficientes en MyD88 a été très légère, ce qui indique l'exigence de cette protéine pour assurer une réponse maximale au LPS. En outre, nous avons constaté que la signalisation MyD88 est nécessaire pour le stockage du fer au niveau de la rate, ainsi que l'induction de lipocaline 2 (LCN2), qui est une protéine impliquée dans la fixation du fer pour limiter la croissance bactérienne. Indépendamment de MyD88 ou TRIF, l'activation de TLR4 et TLR3 a conduit, au niveau de la rate, à une diminution rapide de l’expression de FPN et du « Human hemochromatosis protein » (HFE) qui est une protéine qui limite la séquestration du fer cellulaire à partir de la circulation. Cependant, malgré cette baisse d’expression, le manque de la signalisation MyD88 a altéré de manière significative la réponse hyposidérémique. En établissant le rôle des TLRs et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la diminution du taux du fer sérique au cours de la réponse inflammatoire, nous avons remarqué qu’en réponse au surcharge en fer les souris déficientes en MyD88 accumulent de manière significative plus de fer hépatique par rapport aux souris sauvages, et cela indépendamment des TLRs. Ainsi, dans le troisième chapitre de la présente étude, nous avons étudié le phénotype observé chez les souris déficientes en MyD88. Nous avons trouvé que l'expression de HAMP chez ces souris a été plus faible que celle des souris de type sauvage. Pour cela, nous avons exploré la signalisation à travers la voie du « Bone Morphogenetic Proteins 6 » (BMP6) qui est considérée comme étant la voie fondamentale de la régulation de HAMP en réponse aux concentrations du fer intracellulaires et extracellulaires et nous avons trouvé que l'expression protéique de Smad4, un régulateur positif de l'expression de HAMP, est significativement plus faible chez les souris MyD88-/- par rapport aux souris sauvages. En outre, on a montré que MyD88 interagit avec « mothers against decapentaplegic, Drosophila, homolog 4 » (Smad4) et que cette interaction est essentielle pour l’induction de HAMP à travers la voie BMP6. En conclusion, notre étude montre que l'expression de HAMP dans les macrophages est régulée principalement par TLR2 et TLR4 à travers la voie MyD88 et que l'accumulation du fer dans les macrophages peut affecter les niveaux des cytokines pro-inflammatoires. En outre, nos analyses démontrent que le développement d’hyposidérémie en réponse au LPS se produit par l'intermédiaire d’un mécanisme dépendant de MyD88 qui est dissociée de la production de cytokines et de HAMP. En plus, nos recherches montrent que MyD88 est nécessaire pour l'expression de Smad4 et cela pour garantir une réponse optimale à travers la signalisation BMP6, conduisant ainsi à une expression adéquate de HAMP. Enfin, la protéine MyD88 joue un rôle crucial dans, la régulation de HAMP au niveau des macrophages, la diminution du taux du fer sérique en réponse au LPS et le maintien de l'homéostasie du fer.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Les modes de conceptualisation métaphorique en neuroanatomie : étude de la description anatomique du cervelet et de la moelle spinale

La présente étude s’inscrit dans une lignée de travaux de recherche en traductologie réalisés dans un cadre de sémantique cognitive et visant à dégager les modes de conceptualisation métaphorique dans les domaines de spécialité, et plus précisément dans les sciences biomédicales. Notre étude se concentre sur les modes de conceptualisation métaphorique utilisés en neuroanatomie en français, en anglais et en allemand, dans une perspective d’application à la traduction. Nous nous penchons plus spécifiquement sur la description anatomique de deux structures du système nerveux central : la moelle spinale et le cervelet. Notre objectif est de repérer et de caractériser les indices de conceptualisation métaphorique (ICM). Notre méthode s'appuie sur un corpus trilingue de textes de référence traitant de ces structures et fait appel à une annotation sémantique en langage XML, ce qui autorise une interrogation des corpus annotés au moyen du langage XQuery. Nous mettons en évidence que les ICM jouent un rôle prédominant dans la phraséologie et les dénominations propres à la description anatomique du système nerveux, comme c'est le cas en biologie cellulaire et en anatomie des muscles, des nerfs périphériques et des vaisseaux sanguins. Sous l’angle lexical, il faut distinguer les ICM prédicatifs, les ICM non prédicatifs ainsi que les ICM quasi prédicatifs. La plupart des modes de conceptualisation métaphorique préalablement repérés en biologie cellulaire et en anatomie sont également présents dans le domaine plus spécifique de la neuroanatomie. Certains ICM et modes de conceptualisation sont toutefois spécifiques à des éléments des régions étudiées. Par ailleurs, les modes de conceptualisation métaphorique en français, en anglais et en allemand sont semblables, mais sont exprimés par des réseaux lexicaux d'ICM dont la richesse varie. De plus, la composition nominale étant une des caractéristiques de l'allemand, la forme linguistique des ICM présente des caractéristiques spécifiques. Nos résultats mettent en évidence la richesse métaphorique de la neuroanatomie. Cohérents avec les résultats des études antérieures, ils enrichissent cependant la typologie des ICM et soulignent la complexité, sur les plans lexical et cognitif, de la métaphore conceptuelle.

Pro-inflammatory and angiogenic activities of VEGF and angiopoietins in murine sponge/Matrigel model

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel.

Comparative costs and outcomes of traumatic brain injury from biking accidents with or without helmet use

Contexte: Évaluer les déterminants de maladies évitables et leurs coûts est nécessaire dans le contexte d’assurance maladie universelle. Le moment d’évaluer les impacts des traumatismes crâniocérébraux (TCC) survenus lors d’accidents de vélo est idéal vu la popularité récente du cyclisme au Québec. Objectifs: Comparer les caractéristiques démographiques et médicales, ainsi que les coûts sociétaux qu’engendrent les TCC de cyclistes portant ou non un casque. Méthodologie: Étude rétrospective de 128 cyclistes avec TCC admis à l’Hôpital Général de Montréal entre 2007 et 2011. Les variables indépendantes sont sociodémographiques, cliniques et le port du casque. Les variables dépendantes sont la durée de séjour, l’échelle GOS-E, l’échelle ISS, l’orientation au congé, les décès et les coûts à la société. Résultats: Le groupe portant un casque était plus vieux, plus éduqué, retraité et marié; au niveau médical, ils avaient des TCCs moins sévères à l’imagerie, des hospitalisations aux soins intensifs plus courtes et moins de neurochirurgies. Les coûts médians à la société pour les TCC isolés de cyclistes avec casque étaient significativement moindres. Conclusion: Dans cette étude, le port du casque semblait prévenir certaines complications des TCC et permettait de faire économiser de l’argent à l’état. Le port de casque est recommandé.

Étude de l'oligomérisation et de la fonction de canaux ioniques par spectroscopie de fluorescence et fluorométrie en voltage imposé

La fonction des canaux ioniques est finement régulée par des changements structuraux de sites clés contrôlant l’ouverture du pore. Ces modulations structurales découlent de l’interaction du canal avec l’environnement local, puisque certains domaines peuvent être suffisamment sensibles à des propriétés physico-chimiques spécifiques. Les mouvements engendrés dans la structure sont notamment perceptibles fonctionnellement lorsque le canal ouvre un passage à certains ions, générant ainsi un courant ionique mesurable selon le potentiel électrochimique. Une description détaillée de ces relations structure-fonction est cependant difficile à obtenir à partir de mesures sur des ensembles de canaux identiques, puisque les fluctuations et les distributions de différentes propriétés individuelles demeurent cachées dans une moyenne. Pour distinguer ces propriétés, des mesures à l’échelle de la molécule unique sont nécessaires. Le but principal de la présente thèse est d’étudier la structure et les mécanismes moléculaires de canaux ioniques par mesures de spectroscopie de fluorescence à l’échelle de la molécule unique. Les études sont particulièrement dirigées vers le développement de nouvelles méthodes ou leur amélioration. Une classe de toxine formeuse de pores a servi de premier modèle d’étude. La fluorescence à l’échelle de la molécule unique a aussi été utilisée pour l’étude d’un récepteur glutamate, d’un récepteur à la glycine et d’un canal potassique procaryote. Le premier volet porte sur l’étude de la stœchiométrie par mesures de photoblanchiment en temps résolu. Cette méthode permet de déterminer directement le nombre de monomères fluorescents dans un complexe isolé par le décompte des sauts discrets de fluorescence suivant les événements de photoblanchiment. Nous présentons ici la première description, à notre connaissance, de l’assemblage dynamique d’une protéine membranaire dans un environnement lipidique. La toxine monomérique purifiée Cry1Aa s’assemble à d’autres monomères selon la concentration et sature en conformation tétramérique. Un programme automatique est ensuite développé pour déterminer la stœchiométrie de protéines membranaires fusionnées à GFP et exprimées à la surface de cellules mammifères. Bien que ce système d’expression soit approprié pour l’étude de protéines d’origine mammifère, le bruit de fluorescence y est particulièrement important et augmente significativement le risque d’erreur dans le décompte manuel des monomères fluorescents. La méthode présentée permet une analyse rapide et automatique basée sur des critères fixes. L’algorithme chargé d’effectuer le décompte des monomères fluorescents a été optimisé à partir de simulations et ajuste ses paramètres de détection automatiquement selon la trace de fluorescence. La composition de deux canaux ioniques a été vérifiée avec succès par ce programme. Finalement, la fluorescence à l’échelle de la molécule unique est mesurée conjointement au courant ionique de canaux potassiques KcsA avec un système de fluorométrie en voltage imposé. Ces enregistrements combinés permettent de décrire la fonction de canaux ioniques simultanément à leur position et densité alors qu’ils diffusent dans une membrane lipidique dont la composition est choisie. Nous avons observé le regroupement de canaux KcsA pour différentes compositions lipidiques. Ce regroupement ne paraît pas être causé par des interactions protéine-protéine, mais plutôt par des microdomaines induits par la forme des canaux reconstitués dans la membrane. Il semble que des canaux regroupés puissent ensuite devenir couplés, se traduisant en ouvertures et fermetures simultanées où les niveaux de conductance sont un multiple de la conductance « normale » d’un canal isolé. De plus, contrairement à ce qui est actuellement suggéré, KcsA ne requiert pas de phospholipide chargé négativement pour sa fonction. Plusieurs mesures indiquent plutôt que des lipides de forme conique dans la phase cristalline liquide sont suffisants pour permettre l’ouverture de canaux KcsA isolés. Des canaux regroupés peuvent quant à eux surmonter la barrière d’énergie pour s’ouvrir de manière coopérative dans des lipides non chargés de forme cylindrique.

Modulation de l'expression de Sirt-1 induite par l'endothéline-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires

Au cours des maladies cardiovasculaires (MCV), il peut se produire divers problèmes de santé, telle que l’insuffisance cardiaque ou encore l’HTA. Ces phénomènes se caractérisent, entre autres, par une augmentation de synthèse d’endotheline-1 (ET-1), un neuropeptide synthétisé par les cellules endothéliales ayant un effet vasoconstricteur sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Ainsi, la surexpression de ce vasopeptide, mène à terme, au maintien de l’HTA aggravée des sujets, précédée ou concomitante à l’athérosclérose ou à la resténose, cliniquement illustrées par une prolifération et une migration anormale des CMLV de la media vers l’intima des vaisseaux sanguins. Parallèlement, il a été observé que la protéine sirtuine-1 (Sirt-1), membre de la famille des protéines histones déacétylases (HDAC), présente des propriétés anti-athérosclérotiques par sa capacité d’atténuer la prolifération et la migration des CMLV. Des travaux récents ont aussi montré qu’au cours de l’HTA la protéine Sirt-1 est faiblement exprimée dans les CMLV. Son implication dans le développement des pathologies vasculaires semble apparente, mais des études demeurent nécessaires pour décrire son rôle exact dans la pathogenèse des MCV. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’observer la variation d’expression de Sirt-1 dans les CMLV, isolées de l’aorte ascendante de rat, en réponse à l’ET-1. On a remarqué qu’une heure de stimulation des CMLV avec l’ET-1 induit une diminution de l’expression de Sirt-1 via l’activation des récepteurs ETA. Ces résultats suggèrent que la capacité d’ET-1 à atténuer l’expression de Sirt-1 serait un éventuel mécanisme d’action avec des effets favorisant les MCV.

Effet de la galanine sur le système nerveux cardiaque intrinsèque.‎

Les neurones cholinergiques et adrénergiques efférents du système nerveux cardiaque ‎intrinsèque (SNCI) sont impliqués dans la régulation de la fonction cardiaque chronotrope. ‎La galanine, peptide présent et libéré dans les terminaisons nerveuses cardiaques, est capable ‎de diminuer la libération de l’acétylcholine. Notre hypothèse est d’étudier la possibilité que ‎la galanine puisse agir comme un peptide neuromodulateur inhibiteur dans les neurones du ‎SNCI chez le rat. Les oreillettes et les tissus associés du SNCI sont isolés à partir de rats ‎Sprague-Dawley et perfusés en vitro. Les valeurs de la fréquence auriculaire mesurées d’un ‎battement à l’autre sont tirées à partir d’un enregistrement bipolaire auriculaire. La perfusion ‎de la nicotine en forme de bolus (avec des concentrations dans le bain de 20-250 µm) a ‎induit des réponses biphasiques composées d’une réponse chronotrope négative au début ‎suivie d’une réponse chronotrope positive. Au cours de la superfusion de la galanine ‎‎(170 nM), les réponses chronotropes positives à la nicotine sont réduites chez 12/14 ‎préparations (contrôle : 21,35 ± 17,4 à galanine : 5,46 ± 8,0 bpm, n = 14, p = 0,02), tandis que ‎les réponses chronotropes négatives sont réduites chez 8 /14 préparations et affichent une ‎tendance générale vers la réduction (contrôle : -16,09 ± 14,7, galanine : -12,53 ± 13,2 bpm). ‎On peut conclure que la galanine agit comme un peptide neuromodulateur inhibiteur dans les ‎SNCI chez le rat, en modifiant de préférence la stimulation nicotinique de neurones ‎adrénergiques.‎

The inflammatory role of angiogenic growth factors : a neutrophil perspective

De par sa présence dans tous les vaisseaux sanguins, l'endothélium joue un rôle clef dans le processus d’hémostase, tant par sa libération de facteurs anticoagulants que par ses changements protéiques qui permettent à l’organisme de déclencher la réparation tissulaire. La fonction anticoagulante de l’endothélium peut être mise en défaut en cas d’atteinte de son intégrité, entrainant la formation de thrombus, le rejet précoce de greffes ou encore l’induction de l’athérosclérose. L’intégrité de l’endothélium est donc capitale pour la prévention de nombreuses maladies cardiovasculaires. Chez l’adulte, les cellules endothéliales (CE), normalement quiescentes, sont rapidement activées en cas d’hypoxie ou d’inflammation, leur permettant ainsi d’amorcer le processus angiogénique comme suit: Tout d’abord, l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire permet l’extravasation des protéines plasmatiques. Ensuite, la dégradation de la lame basale par des métalloprotéases permet aux CE de se détacher, de proliférer, de migrer et de s’organiser pour former l’ébauche du futur vaisseau. La dernière étape consiste en la maturation du vaisseau, c’est-à-dire son recouvrement par des cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses et les péricytes. Ces processus sont régulés par de nombreux facteurs angiogéniques tels que les membres de la famille Notch, du vascular endothelial growth factor (VEGF), du fibroblast growth factor (FGF), des angiopoïétines, et des matrix metalloproteases (MMP). L’angiogenèse pathologique, soit une insuffisance ou un excès de vascularisation, est impliquée dans les blessures chroniques, les accidents cardiovasculaires, les pathologies coronariennes artérielles, les pathologies tumorales, l’arthrite rhumatoïde, la rétinopathie diabétique, l’athérosclérose, le psoriasis et l’asthme. Ces pathologies sont souvent issues d’une dérégulation de l’activité endothéliale, fréquemment observée conjointement à l’expression continue de molécules d’adhésion leucocytaires, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire, et aux anomalies de la vasoréactivité. L’activation non-contrôlée de l’endothélium entraîne ainsi une inflammation chronique et la formation de structures vasculaires anarchiques. Les premiers leucocytes à répondre à l’appel inflammatoire sont les neutrophiles. Equippées d’une panoplie de produits antibactériens puissants mais aussi nocifs pour les tissus qui les entourent, ces cellules polylobées participent à chaque étape du processus inflammatoire, depuis l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire jusqu’à la résolution. En effet, grâce à leurs récepteurs, les neutrophiles détectent et interprètent les signaux biochimiques présents dans la circulation et à la surface de l’endothélium, et libèrent aussi leurs propres médiateurs tels le VEGF, les MMP, et l’interleukine-8 (IL-8), dont les effets sont à la fois paracrines et autocrines. Existent-ils d’autres modulateurs typiques de la fonction endothéliale capables d’influencer le comportement des neutrophiles? En effet, notre laboratoire a démontré que chez l’humain, une stimulation directe aux angiopoïétines incitait les neutrophiles à adhérer aux CE, à migrer, à synthétiser et à relâcher l’IL-8, voire même à vivre plus longtemps. La présence du récepteur des angiopoïétines, Tie2, à la surface des neutrophiles laisse présager que la famille possèderait d’autres fonctions leucocytaires encore non-identifiées. Par ailleurs, dans un modèle classique de l’angiogenèse in vivo (matrigel), nous avons observé que sous l’effet du FGF1 et 2, les ébauches des nouveaux vaisseaux étaient parfois accompagnées d’une infiltration de cellules granulocytaires. Ainsi, en partant de ces observations, l’objectif de nos études (présentées ci-après) était d’approfondir nos connaissances sur la relation entre neutrophiles et facteurs angiogéniques, notamment les FGF et les angiopoïétines. Par tests in vitro, nous avons confirmé que les neutrophiles humains exprimaient plusieurs récepteurs du FGF (FGFR1-4) d’une façon hétérogène, et qu’ils migraient vers un gradient des ligands FGF1 et 2. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation inflammatoires activées par les ligands FGF1, FGF2, Ang1 et Ang2. Grâce à une stratégie génique ciblant 84 gènes inflammatoires, nous avons identifié plusieurs cibles d’intérêt touchées par Ang1, dont certains membres de la famille de l’IL-1, alors qu’aucun des gènes testés n’avait changé de façon significative sous l’effet des FGF ou d’Ang2. Suite à des cinétiques approfondies, nous avons démontré qu’Ang1 stimulait la transcription de l’ARN messager de l’IL-1β, et augmentait simultanément la quantité de protéine immature (pro-IL-1β; inactive) et clivée (IL-1β « mature »; active). En parallèle, Ang1 augmentait la sécrétion de l’antagoniste naturel de l’IL-1β, l’IL-1RA, sans pour autant stimuler la relâche de l’IL-1β. A l’instar des endotoxines bactériennes dont les effets liés à l’IL-1 dépendaient de la kinase p38, ceux d’Ang1 découlaient presque entièrement des voies de signalisation du p42/44.

Strategies for revascularizing the ischemic retina

Les rétinopathies ischémiques (RI) sont la cause majeure de cécité chez les personnes âgées de moins de 65 ans. Il existe deux types de RIs soit la rétinopathie du prématuré (ROP) ainsi que la rétinopathie diabétique (RD). Les RIs sont décrites en deux phases soit la phase de vasooblitération, marquée par une perte importante de vaisseaux sanguins, et une phase de néovascularisation secondaire à lʼischémie menant à une croissance pathologique de vaisseaux. Cette seconde phase peut générer des complications cliniques telles quʼun oedème dans lʼhumeur vitré ainsi que le détachement de la rétine chez les patients déjà atteints dʼune RI. Les traitements approuvés pour les RIs visent à réduire la formation des vaisseaux pathologiques ou lʼoedème; mais ceux-ci malheureusement ne règlent pas les problèmes sous-jacents tels que la perte vasculaire et lʼischémie. La rétine est un tissu hautement vascularisé qui contribue à lʼirrigation et à lʼhoméostasie des neurones. Lʼinteraction neurovasculaire, comprenant de neurones, vaisseaux et cellules gliales, contribue au maintien de cette homéostasie. Durant le développement, les neurones et les cellules gliales jouent un rôle important dans la vascularisation de la rétine en sécrétant des facteurs qui stimulent l'angiogenèse. Cependant, nos connaissances sur lʼinteraction neurovasculaire dans les RIs sont limitées. En identifiant les interactions importantes entre les cellules composant cette unité neurovasculaire dans la rétine, nous pourrons viser des cibles qui engendreront une revascularisation seine afin de diminuer les signes pathologiques chez les patients atteints dʼune RI. Les travaux présentés dans cette thèse visent à mieux expliquer cette interaction neurovasculaire en soulignant des concepts importants propres aux RIs. En utilisant un modèle de rétinopathie induite par lʼoxygène chez la souris, qui reproduit les caractéristiques importantes de la ROP (et en certaines instances, la RD), nous identifions quelques molécules clés jouant un rôle significatif dans les RIs soit la sémaphorine 3A (sema3A), lʼIL-1β, ainsi que le récepteur PAR2. Nos résultats démontrent que Sema3A, sécrétée par les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) durant une ischémie, empêche la revascularisation normale et que cette expression est induite par lʼIL-1β provenant des microglies activées. En bloquant Sema3A directement ou via lʼinhibition de lʼIL- 1β, nous remarquons une revascularisation seine ainsi quʼune diminution importante des vaisseaux pathologiques. Cela nous indique que Sema3A est impliquée dans la guidance vasculaire et quʼelle contribue à la pathogenèse des RIs. Lʼactivation de façon exogène de PAR2, identifié aussi comme régulateur du récepteur de lʼIL-1β (IL- 1RI) sur les CGRs, se traduit par une diminution séquentielle de lʼIL-1RI et de Sema3A ce qui mène également à une revascularisation seine. En conclusion, ces travaux soulignent lʼimportance de lʼinteraction neurovasculaire ainsi que la guidance vasculaire dans les RIs. Ils renforcent lʼimportance de la communication entre neurone, vaisseau et microglie dans la pathogenèse des RIs. Finalement, nous identifions quelques molécules clés qui pourront servir comme cibles afin de lutter contre lʼischémie qui cause des problèmes vasculaires chez les patients atteints dʼune RI.

Réduction d'expansion volumique au cours de la gestation : conséquence sur la circulation utéro-placentaire.

La grossesse est caractérisée par une augmentation du volume circulant maternel et du débit sanguin afin de subvenir aux besoins croissants du foetus. En diminuant l'expansion volumique maternelle, nous avons développé un modèle de restriction de croissance intra-utérine (RCIU) chez la rate dans lequel on observe une diminution du diamètre des artères utérines arquées ainsi qu'une diminution de la réponse à l'angiotensine II. Nous avons émis l'hypothèse que comparativement aux rates normales, les vaisseaux utérins des rates RCIU présentent une dysfonction des mécanismes de relaxation dépendant de l'endothélium lors de la réponse à des agents vasoactifs. Notre objectif était de caractériser l'influence de l'endothélium sur la régulation de la réactivité des artères utérines radiales dans notre modèle RCIU. À l'aide d'un myographe pressurisé, des courbes de concentration-réponse à des agents vasoactifs (Phényléphrine (Pe), Carbachol (Cbc) et Nitroprussiate de sodium (SNP)) ont été effectuées, en présence ou en absence d'inhibiteurs des voies principales de la relaxation dépendante de l'endothélium (monoxyde d'azote (NO), prostacycline (PGI2) et facteurs hyperpolarisants dépendant de l'endothélium (EDHF)). Nous avons ainsi démontré que les artères utérines radiales des rates RCIU ont un diamètre plus petit que celles des rates contrôles. Une utilisation plus grande du NO dans la réponse dilatatrice au Cbc a été observée chez les rates RCIU. De plus, l'inhibition de la voie de l'EDHF par l'ajout de KCl aux inhibiteurs de la voie du NO (L-NAME) et des PGI2 (Ibuprofène) bloque presque complètement la relaxation au Cbc chez les deux groupes. En conclusion, dans les artères utérines radiales des deux groupes, il y a une participation importante de l'EDHF lors de la dilatation au Cbc. De plus, dans notre modèle RCIU, la voie du NO est activée, probablement afin de compenser la diminution du diamètre des artères et la réduction de la perfusion utérine.

Effets de facteurs pédoclimatiques sur la composition et l’anatomie du bois de cinq cultivars de saule destinés aux biocarburants

En 2011, cinq (5) cultivars de saules ont été sélectionnés pour leur rendement en biomasse. Ils ont été plantés sur quatre sites de la province du Québec et ont été maintenus selon le protocole de la culture intensive sur courtes rotations (CICR) afin de déterminer leur potentiel pour la bioénergie dans des environnements contrastés. La composition et l’anatomie du bois de ces cultivars ont été caractérisées et comparés en fonction des conditions environnementales caractéristiques de chaque site. La hauteur et le diamètre à la base des plantes diffèrent selon les sites. Ainsi, les cultivars répondent de façon spécifique aux conditions pédoclimatiques dans lesquelles ils sont cultivés. L’effet de l’environnement n’a pas été mis en évidence sur la teneur en lignine des cultivars. Cependant, un effet génotypique a pu être constaté soulignant l’importance de la sélectivité des cultivars. La densité du bois a étonnamment conservé la même hiérarchie génotypique entre les sites. À l’opposé, l’anatomie du bois présente des différences notamment au niveau des caractéristiques des fibres et des vaisseaux. Une forte teneur en polyphénols ainsi que des fibres moins larges et des vaisseaux plus nombreux ont été observés sur le site dont le bois est le plus dense supposant l’effet probable d’un stress abiotique. De plus, deux fois plus de fibres gélatineuses, fibres riches en cellulose, ont été identifiées sur ce site montrant un intérêt pour la production de bioéthanol.

La culture matérielle de l’Auguste (1761) et le rapatriement de l’élite coloniale au sein de l’État moderne.

Ce mémoire porte sur l’étude de la culture matérielle de l’Auguste, un navire de cartel ayant fait naufrage en 1761 au nord-est de l’île du Cap-Breton, en Nouvelle-Écosse. La date de 1759 marque la conquête de la Nouvelle-France par l’Angleterre. La France perd donc un important territoire. À la suite de la capitulation de Montréal en 1760, un Régime militaire temporaire anglais est mis en place et entraîne le départ de plusieurs membres des classes dirigeantes de la colonie vers la France. Leur rapatriement est effectué au moyen de navires de cartel, c’est-à-dire des vaisseaux voyageant sous drapeau blanc et transportant des « prisonniers », leur famille et leurs avoirs. L’Auguste, un navire marchand d’appartenance britannique, est réquisitionné à Québec comme navire de cartel à l’automne 1761. Un mois après son départ, le navire s’échoue dans la baie d’Aspy et fait naufrage en emportant à la mort la majorité des passagers. Plus de deux siècles après ces événements tragiques, un partenariat entre Parcs Canada et des plongeurs locaux a mené à la réalisation de deux campagnes de fouilles archéologiques à la fin des années 1970 mettant au jour une collection de plus de quatre mille artefacts. L’analyse de cette culture matérielle comprend notamment la mise en contexte de l’histoire et de la découverte du navire et un classement des artefacts selon des catégories fonctionnelles liées à l’archéologie maritime. Les différents niveaux analytiques mènent ultimement à l’intégration des données archéologiques dans la compréhension du rapatriement des élites au sein de l’État moderne et à l’établissement de liens intéressants entre les familles nanties de la colonie et certains artisans de Nouvelle-France. L’étude de l’Auguste a finalement permis de mettre en lumière la fonction de cartel du navire et d’établir et l’organisation maritime d’un voyage transatlantique pour le transport de passagers.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.