220 resultados para Hydrogénase NAD-dépendante


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Les rétinoïdes sont utilisés dans le traitement d’une variété de tumeurs malignes et lésions précancéreuses. Leurs effets dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs solides tel que le cancer du sein ont été étudiés extensivement. Cependant, les bénéfices dans le cancer du sein restent à date peu clairs. Ceci est probablement du à l’hétérogénéité des tumeurs mammaires et la réponse très variable aux effets antiprolifératifs de l’acide rétinoïque. Dans les lignées cellulaires cancéreuses mammaires, la réponse l’AR est fortement corrélée au niveau d’expression du récepteur aux estrogènes alpha (ERα), qui régule l’expression du gène qui encode le récepteur à l’acide rétinoïque alpha, RARA. Malgré cela, certaines lignées cellulaires ER-négatives, comme la lignée HER2-positive SK-BR-3, ont été décrites comme étant sensibles à l’AR. Dans le Chapter 2: de cette thèse, nous avons étudié les mécanismes de la signalisation ER-dépendante et ER-indépendante dans les cellules cancéreuses mammaires. Nous avons utilisé des lignées ER-négatives et ER-positives pour démontrer qu’une partie de la réponse à l’AR est indépendante de la signalisation par ER. Nous avons identifié plusieurs gènes cibles primaires de l’AR qui ont des effets similaires à l’AR quand ils sont surexprimés dans des cellules mammaires cancéreuses. Cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes complexes qui mènent à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires. Dans le Chapitre 3, nous avons regardé plus en détails la signalisation ER-indépendante par l’AR dans des cellules ayant une amplification des gènes HER2 et RARA et nous avons identifié une synergie entre l’AR et le Herceptin dans ces cellules. Nous proposons que les gènes FOXO jouent une rôle dans cette synergie. Les cellules SK BR 3, ayant une coamplification HER2/RARA, pourraient représenter une classe de tumeurs qui pourraient bénéficier d’un traitement avec des rétinoïdes, en augmentent la réponse au Herceptin et potentiellement en réduisant la résistance au Herceptin. En conclusion, les données présentées dans cette thèse aident à mieux comprendre les mécanismes menant à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires et fournissent une application potentielle pour l’utilisation de l’AR dans le traitement du cancer du sein.

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Les sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) sont de petits peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance à partir de l’hypophyse via leur liaison au récepteur de la ghréline GHS-R1a. Le GHRP hexaréline a été utilisé afin d’étudier la distribution tissulaire de GHS-R1a et son effet GH-indépendant. Ainsi, par cette approche, il a été déterminé que l’hexaréline était capable de se lier à un deuxième récepteur identifié comme étant le récepteur scavenger CD36. Ce récepteur possède une multitude de ligands dont les particules oxLDL et les acides gras à longue chaîne. CD36 est généralement reconnu pour son rôle dans l’athérogénèse et sa contribution à la formation de cellules spumeuses suite à l’internalisation des oxLDL dans les macrophages/monocytes. Auparavant, nous avions démontré que le traitement des macrophages avec l’hexaréline menait à l’activation de PPARƔ via sa liaison à GHS-R1a, mais aussi à CD36. De plus, une cascade d’activation impliquant LXRα et les transporteurs ABC provoquait également une augmentation de l’efflux du cholestérol. Une stimulation de la voie du transport inverse du cholestérol vers les particules HDL entraînait donc une diminution de l’engorgement des macrophages de lipides et la formation de cellules spumeuses. Puisque CD36 est exprimé dans de multiples tissus et qu’il est également responsable du captage des acides gras à longue chaîne, nous avons voulu étudier l’impact de l’hexaréline uniquement à travers sa liaison à CD36. Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation du métabolisme des lipides par CD36, nous avons choisi des types cellulaires jouant un rôle important dans l’homéostasie lipidique n’exprimant pas GHS-R1a, soient les adipocytes et les hépatocytes. L’ensemble de mes travaux démontre qu’en réponse à son interaction avec l’hexaréline, CD36 a le potentiel de réduire le contenu lipidique des adipocytes et des hépatocytes. Dans les cellules adipeuses, l'hexaréline augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la mobilisation et l’oxydation des acides gras, et induit également l’expression des marqueurs thermogéniques PGC-1α et UCP-1. De même, hexaréline augmente l’expression des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale, un effet accompagné de changements morphologiques des mitochondries; des caractéristiques observées dans les types cellulaires ayant une grande capacité oxydative. Ces résultats démontrent que les adipocytes blancs traités avec hexaréline ont la capacité de se transformer en un phénotype similaire aux adipocytes bruns ayant l’habileté de brûler les acides gras plutôt que de les emmagasiner. Cet effet est également observé dans les tissus adipeux de souris et est dépendant de la présence de CD36. Dans les hépatocytes, nous avons démontré le potentiel de CD36 à moduler le métabolisme du cholestérol. En réponse au traitement des cellules avec hexaréline, une phosphorylation rapide de LKB1 et de l’AMPK est suivie d’une phosphorylation inhibitrice de l’HMG-CoA réductase (HMGR), l’enzyme clé dans la synthèse du cholestérol. De plus, la liaison d'hexaréline à CD36 provoque le recrutement d’insig-2 à HMGR, l’étape d’engagement dans sa dégradation. La dégradation de HMGR par hexaréline semble être dépendante de l’activité de PPARƔ et de l’AMPK. Dans le but d’élucider le mécanisme d’activation par hexaréline, nous avons démontré d’une part que sa liaison à CD36 provoque une déphosphorylation de Erk soulevant ainsi l’inhibition que celui-ci exerce sur PPARƔ et d’autre part, un recrutement de l’AMPK à PGC-1α expliquant ainsi une partie du mécanisme d’activation de PPARƔ par hexaréline. Les résultats générés dans cette thèse ont permis d’élucider de nouveaux mécanismes d’action de CD36 et d'approfondir nos connaissances de son influence dans la régulation du métabolisme des lipides.

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Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV.

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Ce mémoire est une étude de cas dans le domaine des politiques publiques, et porte sur la lutte à la pauvreté et à l’exclusion sociale en Irlande. L’Irlande a réussi l’exploit de diminuer de façon spectaculaire la pauvreté et l’exclusion sociale durant la décennie 1997-2006 et bien que son développement économique fut sans doute tout aussi spectaculaire, celui-ci n’explique pas entièrement ce résultat, tout comme il ne rend pas compte de l’engagement politique qui a amené le gouvernement irlandais à faire de la réduction de la pauvreté un objectif important. Le mémoire cherche à définir et à identifier les facteurs qui ont contribué à l’émergence de cette orientation politique. Comme il s’agit d’une étude de cas, la démarche de recherche se situe dans l’horizon des méthodes qualitatives. La variable dépendante est donc la conception et la mise en œuvre d’un nouvel ensemble de politiques sociales, centrées sur la réduction de la pauvreté. L’explication proposée met l’accent sur les idées, les intérêts et les institutions.

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Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.

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Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs.

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Ce travail contribue au champ d’études sur l’adoption de politique publique des États américains en étudiant quantitativement leurs réactions à l’enjeu du réchauffement climatique. Suivant l’approche des déterminants internes, des facteurs économiques, politiques et environnementaux sont utilisés pour expliquer la densité réglementaire étatique limitant la production de gaz à effet de serre. La variable dépendante constitue la principale contribution de ce travail puisqu’elle incarne une revue exhaustive des options législatives adoptées par les États américains et les regroupe en six catégories. Les déterminants internes identifiés permettent d’expliquer pourquoi certains États sont des instigateurs ou des retardataires dans le dossier du réchauffement climatique. Les principaux facteurs explicatifs sont la présence d’une population idéologiquement libérale et de groupes d’intérêts environnementaux forts.

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Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

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Malgré les progrès des traitements des cancers du sein, ceux-ci demeurent la seconde cause de mortalité par cancer au Canada. Parmi les gènes associés aux cancers du sein, le récepteur des œstrogènes ERα est exprimé dans plus de 70% des tumeurs mammaires, qui prolifèrent en réponse aux œstrogènes, faisant de lui une cible de choix. ERα est un facteur de transcription ligand-dépendant, liant des éléments de réponse PuGGTCAnnnTGACCPy. Afin d’examiner la capacité des récepteurs nucléaires à reconnaitre de nouveaux motifs ADN, des mutants aux capacités de liaison modifiées ont été générés. Parmi les quatre résidus interagissant avec l’ADN, R211 ne peut pas être modifiée sans perdre complètement la liaison du récepteur à l’ADN. Néanmoins, les mutations combinées de plusieurs acides aminés contactant les bases de l’ERE ont généré des récepteurs capables de reconnaitre de nouveaux motifs, tout en conservant des niveaux de transactivation efficaces. L’utilisation potentielle des récepteurs nucléaires comme outils de thérapie génique hormono-dépendant, repose sur la prédiction des motifs de liaison efficaces. Étant donné son importance dans la carcinogenèse mammaire, ERα est une cible cruciale des thérapies anti-néoplastiques. L’anti-œstrogène total, ICI, induit la dégradation de ERα et l’arrêt de la croissance des cellules tumorales mammaires ERα-positives. De plus, la nouvelle drogue anti-tumorale HDACi, SAHA, module la voie de signalisation des œstrogènes et possède des propriétés prometteuses en association avec d’autres traitements anti-tumoraux. En effet, le co-traitement ICI et SAHA a un impact synergique sur l’inhibition de la prolifération des cellules mammaires tumorales ERα-positives. Cette synergie repose sur la coopération des effets de ICI et SAHA pour réduire les niveaux protéiques de ERα et bloquer la progression du cycle cellulaire via la modulation de la transcription des gènes cibles des œstrogènes. En fait, les fortes doses de HDACis masquent rapidement et complètement la signalisation transcriptionnelle des œstrogènes. De plus, les gènes cibles primaires des œstrogènes, contenant des EREs, présentent la même régulation transcriptionnelle en réponse aux fortes doses de SAHA ou du co-traitement, avec des doses utilisables en clinique de ICI et SAHA. En fait, ICI mime l’impact des fortes doses de SAHA, en dégradant ERα, potentialisant ainsi la répression de la transcription ERE-dépendante par SAHA. Finalement, la synergie des effets de ICI et SAHA pourrait augmenter l’efficacité des traitements des tumeurs mammaires.

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Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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La présente étude avait pour but d’explorer les modulations fonctionnelles putaminales du signal de spectroscopie par résonance magnétique (SRM) combiné du glutamate et de la glutamine (Glx), ainsi que de l’acide γ-aminobutyrique (GABA) en lien avec l’apprentissage d’une séquence motrice. Nous avons émis l’hypothèse que les concentrations de Glx seraient spécifiquement augmentées pendant et après la pratique d’une telle tâche, et ce comparativement à une condition d’exécution motrice simple conçue pour minimiser l’apprentissage. La tâche d’appuis séquentiels des doigts (« finger taping task ») utilisée est connue pour induire un apprentissage moteur évoluant en phases, avec une progression initialement rapide lors de la première session d’entraînement (phase rapide), puis lente lors de sessions subséquentes (phase lente). Cet apprentissage est également conçu comme dépendant de processus « on-line » (pendant la pratique) d’acquisition et « off-line » (entre les périodes de pratique) de consolidation de la trace mnésique de l’habilité motrice. Une grande quantité de données impliquent le système de neurotransmission glutamatergique, principalement par l’action de ses récepteurs N-Méthyl-D-aspartate (NMDAR) et métabotropiques (mGluR), dans une multitude de domaine de la mémoire. Quelques-unes de ces études suggèrent que cette relation s’applique aussi à des mémoires de type motrice ou dépendante du striatum. De plus, certains travaux chez l’animal montrent qu’une hausse des concentrations de glutamate et de glutamine peut être associée à l’acquisition et/ou consolidation d’une trace mnésique. Nos mesures de SRM à 3.0 Tesla, dont la qualité ne s’est avérée satisfaisante que pour le Glx, démontrent qu’une telle modulation des concentrations de Glx est effectivement détectable dans le putamen après la performance d’une tâche motrice. Elles ne nous permettent toutefois pas de dissocier cet effet putativement attribuable à la plasticité du putamen associée à l’apprentissage moteur de séquence, de celui de la simple activation neuronale causée par l’exécution motrice. L’interprétation de l’interaction non significative, montrant une plus grande modulation par la tâche motrice simple, mène cependant à l’hypothèse alternative que la plasticité glutamatergique détectée est potentiellement plus spécifique à la phase lente de l’apprentissage, suggérant qu’une seconde expérience ainsi orientée et utilisant une méthode de SRM plus sensible au Glx aurait donc de meilleures chances d’offrir des résultats concluants.

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Le système dopaminergique (DA) méso-corticolimbique du cerveau, qui prend son origine dans l'aire tegmentaire ventrale (ATV), est fortement impliqué dans les comportements motivés et la toxicomanie. Les drogues d'abus activent ce système et y induisent une plasticité synaptique de longue durée. Les neurones DA de l'ATV reçoivent sur leur arborisation dendritique une grande densité de terminaisons glutamatergiques. Les drogues d'abus induisent une potentialisation à long terme (PLT) de ces contacts glutamatergiques. La PLT est une augmentation prolongée de la transmission synaptique, qui semble sous-tendre la mémoire et l'apprentissage. Les endocannabinoïdes (ECs) sont des neurotransmetteurs qui agissent de façon rétrograde sur des récepteurs présynaptiques (CB1) pour diminuer la libération des neurotransmetteurs comme le glutamate. Les neurones libèrent les ECs à partir de leur compartiment somatodendritique suite à une stimulation des afférences et la dépolarisation membranaire qui s’ensuit. La neurotensine (NT) est un neuropeptide retrouvé de façon abondante dans le système DA du cerveau. Il a été découvert que la NT peut induire la libération des ECs dans le striatum. En faisant appel à une combinaison d’approches immunohistochimique, électrophysiologique et pharmacologique chez la souris, nous avons confirmé dans la première étude de cette thèse la présence des récepteurs CB1 sur les terminaisons glutamatergiques des neurones DA de l'ATV, et avons montré que leur activation induit une diminution de la libération de glutamate. Par ailleurs, nous avons montré que des trains de stimulation peuvent induire la libération des ECs. Nous avons découvert qu'en présence d'un antagoniste des récepteurs CB1, il y a facilitation de l’induction de la PLT. Cette observation suggère que les ECs ont un effet inhibiteur sur l’induction de la PLT, plutôt que sur son expression. Nous avons déterminé que le 2-arachidonoylglycerol (2-AG) est l’EC qui est principalement responsable de cette action inhibitrice. Finalement, la PLT induite en présence d’un antagoniste CB1 est aussi dépendante d'une activation des récepteurs NMDA du glutamate. Les travaux réalisés dans la deuxième étude de cette thèse ont montré que la NT est présente dans une sous-population de terminaisons axonales glutamatergiques dans l’ATV. Une application exogène de NT induit une diminution prolongée de l'amplitude des courants postsynaptiques excitateurs (CPSEs). Cette diminution est bloquée en présence d'un antagoniste non-sélectif des récepteurs à la NT, ainsi qu'en présence d'un antagoniste sélectif pour le récepteur de NT de type 1 (NTS1). Confirmant l’implication d’une production d’ECs, la baisse des CPSEs par la NT a été bloquée en présence d’un antagoniste des récepteurs CB1 ou d’un bloqueur de la synthèse de 2-AG. La chélation du calcium intracellulaire n'empêchait pas l’effet inhibiteur de la NT sur les CPSEs, cependant, l'inhibition des protéines G ou de la phospholipase C a complètement bloqué la dépression synaptique induite par la NT. Par ailleurs, nos travaux ont montré que la nature prolongée de la dépression synaptique induite par la NT exogène s’explique par une libération soutenue des ECs, et non pas à une activation prolongée des NTR. Finalement, notre observation qu’un antagoniste des récepteurs de la NT ne facilite pas l’induction de la PLT, comme le fait un antagoniste du récepteur CB1, suggère que la stimulation répétitive des afférences glutamatergiques nécessaire à l’induction de la PLT n’induit pas de libération des ECs via la libération de NT, nous permettant ainsi de conclure que la sécrétion de NT n'agit pas dans ces conditions comme un facteur de régulation négative de la PLT.

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Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.

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Dans les milieux contaminés par les métaux, les organismes vivants sont exposés à plusieurs d’entre eux en même temps. Les modèles courants de prédiction des effets biologiques des métaux sur les organismes (p. ex., modèle du ligand biotique, BLM ; modèle de l’ion libre, FIAM), sont des modèles d’équilibre chimique qui prévoient, en présence d'un deuxième métal, une diminution de la bioaccumulation du métal d’intérêt et par la suite une atténuation de ses effets. Les biomarqueurs de toxicité, tels que les phytochélatines (PCs), ont été utilisés comme étant un moyen alternatif pour l’évaluation des effets biologiques. Les phytochélatines sont des polypeptides riches en cystéine dont la structure générale est (γ-glu-cys)n-Gly où n varie de 2 à 11. Leur synthèse semble dépendante de la concentration des ions métalliques ainsi que de la durée de l’ exposition de l’organisme, aux métaux. L'objectif de cette étude était donc de déterminer, dans les mélanges binaires de métaux, la possibilité de prédiction de la synthèse des phytochélatines par les modèles d’équilibres chimiques, tel que le BLM. Pour cela, la quantité de phytochélatines produites en réponse d’une exposition aux mélanges binaires : Cd-Ca, Cd-Cu et Cd-Pb a été mesurée tout en surveillant l’effet direct de la compétition par le biais des concentrations de métaux internalisés. En effet, après six heures d’exposition, la bioaccumulation de Cd diminue en présence du Ca et de très fortes concentrations de Pb et de Cu (de l’ordre de 5×10-6 M). Par contre, avec des concentrations modérées de ces deux métaux, le Cd augmente en présence de Cu et ne semble pas affecté par la présence de Pb. Dans le cas de la compétition Cd-Cu, une bonne corrélation a été observée entre la production de PC2, PC3 et PC4 et la quantité des métaux bioaccumulés. Pour la synthèse des phytochélatines et la bioaccumulation, les effets étaient considérés comme synergiques. Dans le cas du Cd-Ca, les quantités de PC3 et PC4 ont diminué avec le métal internalisé (effet antagoniste), mais ce qui était remarquable était la grande quantité de cystéine (GSH) et PC2 qui ont été produites à de fortes concentrations du Ca. Le Pb seul n’a pas induit les PCs. Par conséquent, il n’y avait pas de variation de la quantité de PCs avec la concentration de Pb à laquelle les algues ont été exposées. La détection et la quantification des PCs ont été faites par chromatographie à haute performance couplée d’un détecteur de fluorescence (HPLC-FL). Tandis que les concentrations métalliques intracellulaires ont été analysées par spectroscopie d’absorption atomique (AAS) ou par spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICP-MS).

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Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage.