Effects of quetiapine on anhedonia induced by withdrawal from chronic amphetamine administration

Contexte: L’anhédonie, un état caractérisé par une capacité réduite d’éprouver du plaisir. Des études cliniques récentes montrent qu’un médicament antipsychotique atypique, la quétiapine, est bénéfique pour le traitement de la toxicomanie qui est supposé d’atténuer les symptômes de sevrage associés à l’usage abusif des drogues psychotropes. Le but de la présente étude était d’étudier les effets de l'administration aiguë de quétiapine sur la récompense chez des animaux en état de sevrage après un traitement chronique avec l’amphétamine. Notre hypothese est que la quetiapine va diminuer l’anhedonie causer par le sevrage. Méthodes: Les expériences ont été effectuées avec des rats mâles de la souche Sprague-Dawley entraînés à produire une réponse opérante pour obtenir une courte stimulation électrique au niveau de l'hypothalamus latéral. Des mesures du seuil de récompense ont été déterminées chez différents groupes de rats avant et pendant quatre jours après le traitement avec des doses croissantes (1 à 10 mg/kg, ip toutes les 8 heures) de d-amphétamine sulfate, ou de son véhicule, au moyen de la méthode du déplacement de la courbe. L’effet de deux doses de quétiapine a été testé 24 h après le sevrage chez des animaux traités avec l’amphétamine ou le véhicule. Résultats: Les animaux traités avec l’amphétamine ont montré une augmentation de 25% du seuil de récompense 24 h après la dernière injection, un effet qui a diminué progressivement entre le jour 1 et le jour 4, mais qui est resté significativement plus élevé en comparaison de celui du groupe contrôle. La quétiapine administrée à 2 et 10 mg/kg pendant la phase de sevrage (à 24 h) a produit une augmentation respective de 10 % et 25 % du seuil de recompense; le meme augmentation du seuil a été observe chez les animaux traitées avec le véhicule. Un augmentation de 25 % du seuil de recompense a aussi été observés chez les animaux en état de sevrage à l'amphétamine. Un test avec une faible dose d’amphétamine (1 mg/kg) avant et après le sevrage a révélé une légère tolérance à l’effet amplificateur de cette drogue sur la récompense, un phénomène qui pourrait expliquer l’effet différent de la quétiapine chez les animaux traités avec le véhicule et ceux traités avec l’amphétamine. Conclusions: Ces résultats reproduisent ceux des études précédentes montrant que la quétiapine produit une légère atténuation de la récompense. Ils montrent également que le sevrage à l’amphétamine engendre un léger état d'anhédonie et que dans cet état, une dose élevée de quetiapine et non pas une dose faible accentue l’état émotionnel négatif. Ils suggèrent qu’un traitement à faibles doses de quétiapine des symptômes de sevrage chez le toxicomane devrait ni aggraver ni améliorer son état émotionnel.

Détermination des effets de l'administration des probiotiques sur l'attachement d'Escherichia Coli Entérotoxinogène F4 et l'expression de cytokines chez le porcelet sevré

Les diarrhées post-sevrages causées par des infections à Escherichia coli entérotoxinogène positif pour le fimbriae F4 (ETEC F4), entraînent des pertes économiques importantes chez les producteurs de porc. Depuis quelques années, l’utilisation de probiotiques, comme additif alimentaire pour prévenir ce type d’infection entérique et réduire les traitements aux antimicrobiens, suscite un intérêt grandissant en production porcine. Le but du présent travail est de déterminer l’influence de l’administration des probiotiques Pediococcus acidilactici (PA) et Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) sur la colonisation et l’attachement des ETEC F4, l’accumulation de fluide intestinal et l’expression de cytokines dans l’iléon de porcelets sevrés. Dès la naissance, différentes portées de porcelets ont été affectées aux traitements suivants : PA, SCB, PA + SCB, témoin et témoin avec antibiotiques (ATB). Une dose quotidienne de probiotiques (1 × 109 UFC) a été administrée aux porcelets des groupes probiotiques durant la lactation et après le sevrage. Sept jours après le sevrage, à 28 jours d’âge, des porcelets positifs pour le récepteur intestinal spécifique pour F4 ont été infectés oralement avec une souche ETEC F4. Les porcelets ont été euthanasiés 24 heures après l’infection (jour 29) et différents échantillons intestinaux ont été prélevés. Chez les porcelets recevant des probiotiques, l’attachement des ETEC F4 à la muqueuse iléale était significativement diminué chez les groupes PA ou SCB en comparaison avec le groupe ATB. Finalement, l’expression de cytokines intestinales était plus élevée chez les porcs du groupe PA + SCB en comparaison avec les porcelets témoins. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que l’administration de probiotiques pourrait être une alternative pour limiter les infections à ETEC F4 chez le porc.

Effet de chaperones pharmacologiques sur les formes mutantes du récepteur mélanocortine de type 4 responsables de l'obésité morbide précoce

Le récepteur mélanocortine de type 4 (MC4R) est un récepteur couplé aux protéines G impliqué dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Quatre-vingt pour cent des mutants du MC4R reliés à l’obésité morbide précoce (OMP) sont retenus à l’intérieur de la cellule. Le système de contrôle de qualité (SCQ) est probablement responsable de cette rétention, par la reconnaissance d’une conformation inadéquate des mutants. Le rétablissement de l’expression à la surface cellulaire et de la fonctionnalité de ces mutants est donc d’intérêt thérapeutique. Dans cette optique, des composés lipophiles spécifiques pour le MC4R ont été sélectionnés sur la base de leur sélectivité. Nous avons démontré qu’ils agissent à titre de chaperone pharmacologique (CP) en rétablissant l’expression à la surface cellulaire et la fonctionnalité des récepteurs mutants S58C et R165W, et qu’ils favorisent leur N-glycosylation complexe (maturation). Le suivi par BRET du site d’action des CP du MC4R suggère une action en aval de l’interaction calnexine-MC4R. De manière générale, une CP peut avoir un effet différent selon le mutant traité en induisant des conformations distinctes du récepteur plus ou moins aptes à se dissocier du SCQ et à activer la voie de signalisation, et un mutant peut répondre différemment selon la CP utilisée par des différences d’affinité pour le ligand, la CP et les effecteurs. Une meilleure compréhension du mode d’action des CP pourrait aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques non seulement pour l’OMP, mais aussi pour d’autres maladies conformationnelles causées par le mauvais repliement de protéines.

Rôle du dimère Gbetagamma dans l’organisation des systèmes de signalisation cellulaire

Selon le modèle classique, le signal reçu par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) se propage suite à des interactions transitoires et aléatoires entre les RCPGs, les protéines G et leurs effecteurs. Par les techniques de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), de complémentation bimoléculaire de protéines fluorescentes (BiFC) et de co-immunoprécipitation, nous avons observé que les récepteurs, les protéines G et les effecteurs forment un complexe stable, avant et après l’activation des récepteurs. L’interaction entre l’effecteur Kir3 et le dimère Gbetagamma se produit initialement au réticulum endoplasmique et est sensible à un agoniste liposoluble des récepteurs beta2-adrénergiques. Bien que peu de spécificité pour les nombreux isoformes des sous-unités Gbetagamma ait été observée pour l’activation du canal Kir3, les interactions précoces au RE sont plus sensibles aux différentes combinaisons de Gbetagamma présentes. En plus de son rôle dans la régulation des effecteurs, le dimère Gbetagamma peut interagir avec de nombreuses protéines possédant des localisations cellulaires autres que la membrane plasmique. Nous avons identifié une nouvelle classe de protéines interagissant avec la sous-unité Gbeta, autant en système de surexpression que dans des extraits de cerveaux de rats, soit les protéines FosB et cFos, qui forment le complexe de transcription AP-1, suite à leur dimérisation avec les protéines de la famille des Jun. La coexpression du dimère Gbetagamma réduit l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1 induit par le phorbol 12-,myristate 13-acetate (PMA), sans toutefois interférer avec la formation du complexe Fos/Jun ou son interaction avec l’ADN. Toutefois, le dimère Gbetagamma colocalise au noyau avec le complexe AP-1 et recrute les protéines histones déacétylases (HDAC) afin d’inhiber l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1.

The importance of the Hedgehog signaling pathway at the level of the blood-brain barrier

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales.

Étude des interactions entre les cellules progénitrices endothéliales et l’adiponectine

L’adiponectine, une adipokine aux niveaux plasmatiques inversement associés aux composantes du syndrome métabolique, protège contre l’athérosclérose et réduit les risques d’infarctus du myocarde. Les cellules progénitrices endothéliales (EPCs) jouent un rôle dans la réparation vasculaire et leur nombre est réduit chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires. Nous croyons que les effets de l’adiponectine peuvent s’expliquer entre autres via ses interactions avec les EPCs. Trois sous-population d’EPCs, isolées du sang de donneurs sains, ont été caractérisées par immunophénotypage par cytométrie en flux. L’expression des récepteurs de l’adiponectine, AdipoR1, AdipoR2 et H-cadherin par les EPCs et les cellules endothéliales a été évaluée par qPCR. Les effets de l’adiponectine sur la migration et l’apoptose des EPCs et sur l’apoptose des HUVECs ont été étudiés. L’expression de l’élastase des neutrophiles par les EPCs et son activité ont été testées. Les résultats de qPCR montrent que l’AdipoR1 est plus fortement exprimé que l’AdipoR2 alors qu’H-cadhérine n’est pas détectable dans les EPCs. Les EPCs précoces expriment aussi l’élastase. L’expression d’AdipoR1 a été confirmée par immunobuvardage. L’adiponectine augmente de façon significative la survie de deux sous-populations d’EPCs, mais pas celle des HUVECs, en condition de privation de sérum. L’activité de l’élastase a été confirmée dans le milieu conditionné par les EPCs. Les EPCs expriment les récepteurs de l’adiponectine et l’élastase. L’adiponectine protège les EPCs contre l’apoptose et pourrait augmenter leur capacité de réparation vasculaire. L’activité élastase des EPCs pourrait moduler localement l’activité de l’adiponectine par la génération de sa forme globulaire.

Rôle de la molécule CD47 sur le lymphocyte T dans la régulation de la réponse immunitaire

L’importance respective des lymphocytes T régulateurs naturels générés dans le thymus ou induits en périphérie dans la régulation immunitaire et la résolution de l’inflammation est désormais bien établie. Nous avons contribué à mettre en évidence une nouvelle voie d’induction de lymphocytes T régulateurs périphériques à partir de cellules T humaines CD4+CD25- naïves et mémoires. Nous avons montré que l’engagement de la molécule ubiquitaire transmembranaire CD47 sur la cellule T par un anticorps monoclonal ou par le peptide 4N1K (peptide dérivé du domaine carboxy-terminal de la thrombospondine-1 et spécifique du site de liaison à CD47) induisait des lymphocytes T CD4+ régulateurs exerçant une fonction suppressive sur les lymphocytes T effecteurs. Les propriétés suppressives induites par la thrombospondine-1 confortent les fonctions anti-inflammatoires de cette protéine de la matrice extracellulaire. L’inhibition exercée par les lymphocytes T régulateurs induits dépend du contact intercellulaire entre les cellules T régulatrices et leurs cibles, et est indépendante du TGF-. Nos résultats démontrent également le rôle de CD47 sur le lymphocyte T CD4+ dans la réponse immunitaire spécifique de l’antigène in vivo. En effet, les souris BALB/c déficientes pour CD47 présentent un biais de la sécrétion d’anticorps et de cytokines de type Th1, alors que les souris BALB/c sont décrites comme exprimant un profil de production de cytokines de type Th2. Nos travaux mettent en évidence le rôle de CD47 dans l’inhibition du développement d’une réponse cellulaire et humorale de type Th1 in vivo, confirmant de précédentes études in vitro réalisées avec des cellules T CD4+ humaines. Nous présentons également le rôle inhibiteur de l’engagement de CD28 in vitro sur la différenciation en cellules Th17 des lymphocytes T CD4+ naïfs isolés de souris BALB/c. Le mécanisme proposé est dépendant de la production de l’IL-2 et de l’IFN- et indépendant de la présence de lymphocytes T régulateurs. Notre étude du rôle de deux molécules transmembranaires CD47 et CD28 exprimées sur la cellule T CD4+, contribue à une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la tolérance immunologique, la résolution de l’inflammation et la différenciation des cellules T "helper" CD4+.

Regulation of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT expression and activity in testicular cholesterol metabolism in mink and in mouse following experimental genetic deletion

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule.

Modulation de l’expression du récepteur B1 des kinines par l’angiotensine II et l’endothéline-1 dans des cellules musculaires lisses vasculaires

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension.

Caractérisation du risque associé au virus de l'hépatite E chez le porc

Dans cette étude, la bile d’un porc canadien naturellement infecté par une souche du virus de l’hépatite E (VHE) a été utilisée afin d’inoculer deux groupes de porcelets. Dans l’étude précoce (E), 4 porcelets âgés de 4 semaines et exempts de pathogènes spécifiques (SPF), ont été suivis jusqu’à 14 jours post-inoculation (pi). Dans l’étude tardive (L), 9 porcelets ont été suivis à chaque semaine jusqu’à l’abattage, soit 120 jours pi. À la nécropsie, la présence du VHE a été évaluée dans différents organes à 7, 14 et 120 jours pi. Des porcelets témoins (E=2 et L=3) ont été inoculés par de la bile exempte de VHE. Le virus a persisté chez certains animaux jusqu’à 84 à 105 jours pi dans le sérum malgré la présence d’anticorps IgG anti-VHE dans le sang, suggérant une virémie prolongée. L’excrétion virale dans les fèces s’est étalée également sur une période de 105 jours pi chez certains animaux. De plus, la détection de l’ARN viral dans les organes évalués s’est révélée presque nulle à l’âge d’abattage à l’exception de quelques vésicules biliaires, alors qu’on retrouvait l’ARN viral dans plusieurs organes à 7 et 14 jours pi. Pour évaluer la distribution du VHE chez les porcs commerciaux du Québec, un échantillonnage de porcs de trois abattoirs a été réalisé. Environ 100 échantillons de sang, fèces, foies et bile provenant des mêmes animaux en processus d’abattage ont été prélevés dans chacun des abattoirs, sur des porcs destinés à la consommation humaine. La détection de l’ARN viral et des anticorps du VHE a été réalisée à l’aide d’une RT-PCR nichée et d’un test ELISA adapté pour déceler les anticorps porcins anti-VHE. Chez les porcs d’abattoir, 12,9 % des échantillons de bile contenaient de l’ARN viral du VHE, alors que la détection virale était moindre dans les autres organes. Une séroprévalence en IgG de 26,0 % a été obtenue pour les sérums porcins analysés. Une analyse phylogénétique des différentes souches isolées pendant l’étude a démontré qu’elles sont du génotype 3. Ces données indiquent une exposition potentielle des travailleurs de l’industrie porcine au VHE porcin, notamment par les fèces, le sang et les organes et également pour les consommateurs par le biais des foies.

The Na+/H+ exchanger Nhx1 of Saccharomyces cerevisiae is essential to limit drug toxicity

Nhx1 est un antiport vacuolaire de Na+/H+ chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nhx1 joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie ionique du cytoplasme de la cellule. En effet, la mutation du gène NHX1 chez la levure nhx1Δ entraîne une perte de l’homéostasie cellulaire quand les cellules sont cultivées dans un milieu de faible osmolarité. Ce travail rapporte pour la première fois, et contrairement à la cellule parentale, que la mutation du gène NHX1 a pour effet une sensibilité du mutant nhx1Δ à une variété des drogues et des agents cationiques et anioniques lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu riche. En outre, dans ces conditions de culture, aucune sensibilité n’a été observée chez le mutant nhx1Δ quand les cellules sont traitées avec différentes concentrations de sel. Nous avons aussi démontré que la sensibilité du mutant nhx1Δ aux différents agents ainsi que la sécrétion de l’enzyme carboxypeptidase Y observé chez ce mutant n’ont pas été restauré lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux avec différents pH ou avec différentes concentrations de sel. Enfin, une analyse génétique a révélé que le mutant nhx1Δ montre un phénotype distinct d’autres mutants qui ont un défaut dans le trafic entre le compartiment pré-vacuolaire et l’appareil de Golgi quand ces cellules sont traitées avec différents agents. Cette analyse prouve que la sensibilité de nhx1Δ aux différents agents n’est pas liée au trafic entre le compartiment pré-vacuolaire et l’appareil de Golgi.

Étude du dysfonctionnement du compartiment des cellules B chez des patients à différents stades d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH)

Les anomalies phénotypiques et fonctionnelles des lymphocytes B (LB) sont typiques d'une infection au VIH et se traduisent principalement par une activation polyclonale, une perte de la mémoire immunitaire ainsi qu'une réponse humorale déficiente et des phénomènes auto-immunitaires souvent précurseurs de lymphomes B. Ces anomalies se retrouvent principalement chez les patients lors de la phase chronique de la maladie et semblent être reliées en partie au niveau de la charge virale ainsi qu'à un compartiment de lymphocytes T CD4+ altéré. Cependant, quoique controversé, des éléments d’activation polyclonale ont également été observés chez les non-progresseurs à long terme (LTNPs) qui présentent une charge virale faible et un compartiment T CD4+ semblable aux individus séronégatifs. Ainsi, les objectifs principaux de cette étude sont 1) d’établir une chronologie des anomalies du compartiment des cellules B chez des individus infectés par le VIH qui ont une progression différente de la maladie (PHI normaux, rapides, sains et LTNP). 2) corréler les niveaux sériques du stimulateur de lymphocytes B (BLyS), un facteur de croissance des cellules B, avec les phénotypes observés chez ces mêmes patients. L’hyperglobulinémie, les niveaux sériques de BLyS et d’auto-anticorps ont été mesuré longitudinalement chez une cohorte d’individus en primo-infection (PHI) avec des progressions différentes de la maladie (rapides et normaux), LTNP et sujets sains. Nos résultats démontrent que l’activation polyclonale des LB survient indépendamment de la vitesse de progression et persiste chez les LTNP ou malgré une thérapie antirétrovirale efficace chez les progresseurs rapides. Des niveaux élevés de BLyS dans le sérum des progresseurs rapides corrèlent avec des fréquences altérées de monocytes et cellules dendritiques, suggérant un rôle de celles-ci dans l’atteinte du compartiment des cellules B.

Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and resporatory syndrome virus replication

Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une des maladies les plus dévastatrices économiquement pour l'industrie mondiale du porc. L'agent étiologique du SRRP est le virus du SRRP (VSRRP) lequel est connu pour avoir une spécificité d'hôte très restreinte et pour sa transmission par voie aerosol. Les antigènes et les ARN du VSRRP ont été trouvés dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire de porcs infectés par le virus. L’interaction entre les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et le VSRRP a été démontrée comme jouant un rôle important dans l’infection causée par le virus. Malgré cela, l’interaction prenant place entre les cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin et le virus ne devrait pas être négligée. Jusqu’à présent, la réplication du VSRRP in vitro dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin n’a pas été conduite avec succès et les tentatives pour le faire ont échoué. Une nouvelle lignée de cellules épithéliales de poumon de porc (SJPL) est maintenant disponible et sera utilisée dans cette étude afin de déterminer si elle est permissive à la réplication du VSRRP et si elle peut être un modèle approprié pour l’étude de la pathogénèse virale du VSRRP. L’expérimentation a démontré que cette nouvelle lignée cellulaire était permissive à l’infection et à la réplication du VSRRP. Afin de corroborer ces résultats, la cinétique de réplication du virus à été effectuée avec les cellules MARC-145 et SJPL. Aucune différence significative dans la production virale totale n’a été trouvée entre les deux lignées cellulaires. Les cellules SJPL ont permis la réplication de plusieurs souches Nord-Américaines du VSRRP, quoiqu’elles sont légèrement moins efficaces que les cellules MARC-145 pour l’isolement du virus. De plus, les cellules SJPL sont phénotypiquement différentes des cellules MARC-145. Plus précisément, les cellules SJPL sont plus sensibles à l’activation par le VSRRP des pro-caspases 3/7 et plusieurs inducteurs apoptotiques. Elles ont également montré de 8 à 16 fois plus de sensibilité à l’effet antiviral causé par l’IFN-α sur la réplication du virus contrairement aux cellules MARC-145. Ces résultats démontrent que les cellules SJPL pourraient représenter un substitut intéressant aux cellules MARC-145 pour la production d’antigènes pour un vaccin anti-VSRRP. Également, dû à leurs origines (poumon de l’hôte naturel), elles pourraient s’avérer être un modèle in vitro plus approprié pour l’étude de la pathogénèse du VSRRP.

Caractérisation moléculaire de la modulation spatio-temporelle des fonctions du phagosome

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées.

Étude des voies d’apprêtement des antigènes viraux menant à la présentation antigénique par les CMH de classe I

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies.