Validation et conditionnement d'un test PAMPA amélioré pour l'évaluation de la perméabilité membranaire de médicaments.

Les tests PAMPA et les tests Caco-2 sont des essais in vitro de l’évaluation de la perméabilité intestinale des médicaments. Ils sont réalisés lors de la phase de découverte du médicament. Les tests PAMPA ne sont pas biologiquement représentatifs de la paroi intestinale, mais ils sont rapides et peu coûteux. Les tests Caco-2 nécessitent plus de 21 jours pour la culture cellulaire et des installations spécifiques sont requises. Ils sont constitués d’une monocouche d’entérocytes à confluence et donc plus biologiquement représentatifs. Il y a un besoin pour le développement d’un essai qui est biologiquement représentatif de la membrane intestinale humaine, rapide et peu coûteux. Le premier but de ce projet était de développer une méthode analytique qui permettrait l’évaluation simultanée de huit médicaments témoins utilisés pour la validation de l’essai de perméabilité. Le deuxième but de ce projet était donc d’améliorer la membrane des tests PAMPA pour proposer un nouveau test : le néoPAMPA. Contrairement au test PAMPA traditionnel, cette membrane est constituée de trois composantes : (1) un filtre poreux qui agit à titre de support, (2) un coussin polydopamine chargé négativement qui sert d’ancrage et qui assure la fluidité de la bicouche et (3) une bicouche lipidique formée par fusion de vésicules. Une méthode analytique HPLC-MS/MS a été validée selon les spécifications de la FDA et de la EMA. Cette méthode a permis de quantifier simultanément les huit médicaments standards utilisés pour le test néoPAMPA. Le test PAMPA traditionnel a été mis en place à titre d’essai control. Les coefficients de perméabilité mesurés pour les huit médicaments au travers de la membrane PAMPA comparaient favorablement aux résultats de la littérature. Les composantes de la membrane néoPAMPA ont été optimisées. Les conditions optimales retenues étaient les filtres de polycarbonate hydrophile ayant des pores de 15 nm, les plaques Costar 12 puits comme dispositif des tests de perméabilité, une bicouche lipidique composée de 70 % DOPC et de 30 % cholestérol cationique ainsi qu’une déposition des liposomes en présence de 150 mM NaCl suivi d’un équilibre d’1 h en présence d’une solution saturée en DOPC. Les stabilités de la cassette de médicaments et des liposomes sont insuffisantes pour le conditionnement commercial des membranes néoPAMPA. Les différentes optimisations réalisées ont permis d’améliorer la membrane néoPAMPA sans toutefois la rendre fonctionnelle. La membrane néoPAMPA n’est toujours pas en mesure de discriminer des molécules en fonction de leur perméabilité attendue.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

Étude de la fonction de la protéine RPAP4 et de son association avec l’ARN polymérase II

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante.

Conception et évaluation d’un nouveau système de transfection ciblée, basé sur l’utilisation du système E/Kcoil

Actuellement le polyéthylènimine (PEI) est l’agent de transfection transitoire le plus utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par les cellules de mammifères. Il permet la condensation de l’ADN plasmidique (ADNp) en formant spontanément des nanoparticules positives appelées polyplexes, lui procurant la possibilité de s’attacher sur la membrane cellulaire afin d’être internalisé, ainsi qu’une protection face aux nucléases intracellulaires. Cependant, alors que les polyplexes s’attachent sur la quasi-totalité des cellules seulement 5 à 10 % de l’ADNp internalisé atteint leur noyau, ce qui indique que la majorité des polyplexes ne participent pas à l’expression du transgène. Ceci contraste avec l’efficacité des vecteurs viraux où une seule particule virale par cellule peut être suffisante. Les virus ont évolués afin d’exploiter les voies d’internalisation et de routage cellulaire pour exprimer efficacement leur matériel génétique. Nous avons donc supposé que l’exploitation des voies d’internalisation et de routage cellulaire d’un récepteur pourrait, de façon similaire à plusieurs virus, permettre d’optimiser le processus de transfection en réduisant les quantités d’ADNp et d’agent de transfection nécessaires. Une alternative au PEI pour transfecter les cellules de mammifèreest l’utilisation de protéines possédant un domaine de liaison à l’ADNp. Toutefois, leur utilisation reste marginale à cause de la grande quantité requise pour atteindre l’expression du transgène. Dans cette étude, nous avons utilisé le système E/Kcoil afin de cibler un récepteur membranaire dans le but de délivrer l’ADNp dans des cellules de mammifères. Le Ecoil et le Kcoil sont des heptapeptides répétés qui peuvent interagir ensemble avec une grande affinité et spécificité afin de former des structures coiled-coil. Nous avons fusionné le Ecoil avec des protéines capables d’interagir avec l’ADNp et le Kcoil avec un récepteur membranaire que nous avons surexprimé dans les cellules HEK293 de manière stable. Nous avons découvert que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire permettait l’attachement ciblé sur les cellules par l’intermédiaire du système E/Kcoil. Nous démontrons dans cette étude comment utiliser le système E/Kcoil et une protéine interagissant avec l’ADNp pour délivrer un transgène de manière ciblée. Cette nouvelle méthode de transfection permet de réduire les quantités de protéines nécessaires pour l’expression du transgène.

Phosphorylation et régulation de l’E3 ubiquitine ligase MDM2 par la protéine kinase RSK dans les mélanomes

La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) régule une variété de protéines intracellulaires qui jouent un rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire. La régulation inappropriée de cette voie de signalisation conduit au développement de nombreux cancers comme le mélanome, qui est caractérisé par des mutations activatrices au niveau des gènes NRAS et BRAF. La protéine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire n’est pas bien compris. RSK a été montrée pour participer à la résistance des mélanomes aux chimiothérapies, mais le mécanisme moléculaire reste encore à élucider. Nous montrons à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique que MDM2 est phosphorylée en réponse à des agonistes et des mutations oncogéniques activant spécifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des méthodes in vitro et in vivo, nous avons constaté que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Sérines 166 et 186, ce qui suggère que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagénèse dirigée envers ces sites nous indique que ces résidus régulent l’ubiquitination de MDM2, suggérant que RSK régule la stabilité de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observé que l’inhibition de RSK conduit à une augmentation du niveau protéique de p53 après un dommage à l’ADN dans les cellules de mélanomes. En conclusion, nos travaux suggèrent un rôle important de la protéine kinase RSK dans la régulation de MDM2 et de sa cible, p53. L’étude de ces mécanismes moléculaires aidera à mieux définir le rôle de RSK dans la croissance tumorale, mais également dans la résistance aux agents chimiothérapeutiques.

Les cellules endothéliales peuvent acquérir un phénotype mésenchymateux associé avec l’expression de la protéine nestine dans un modèle d’hypertrophie cardiaque et de fibrose réactive

L’hypertrophie cardiaque représente la réponse primaire du cœur dans le but d’améliorer la fonction cardiaque qui est compromise suite à un accident ischémique ou une surcharge hémodynamique. Cependant, l’hypertrophie cardiaque a pour conséquence pathologique la fibrose réactive, qui est caractérisée par la synthèse incontrôlée et le dépôt du collagène par les myofibroblastes. Ainsi, l’accumulation accrue du collagène dans le cœur hypertrophié mène à l’augmentation de la rigidité cardiaque et la détérioration progressive de la fonction contractile du cœur. Plusieurs études ont démontré que la protéine nestine, appartenant à la famille des filaments intermédiaires, est ré-exprimée dans les myofibroblastes durant la fibrose réparative et est impliquée dans la prolifération cellulaire. Basée sur ces observations, cette étude teste l’hypothèse selon laquelle nestine est induite dans les myofibroblastes suivant le développement de la fibrose réactive dans le cœur des rats ayant subi une constriction aortique supra-rénale. Deux semaines suivant une constriction aortique supra-rénale chez le rat, un patron d’hypertrophie concentrique cardiaque a été observé et associé avec une réponse de fibrose réactive caractérisée par le dépôt accru de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire de nombreux vaisseaux sanguins cardiaques. De plus, les niveaux de la protéine nestine sont augmentés significativement dans les cœurs des rats hypertrophiés, et ce, de façon corrélative avec la pression artérielle moyenne et la pression systolique du ventricule gauche. Les techniques d’immunofluorescences ont révélé une apparition accrue des cellules immunoréactives à nestine, qui présentent un phénotype mésenchymateux caractérisé par la co-expression de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire des cœurs hypertrophiés. Ces données suggèrent que les fibroblastes résidents peuvent exprimer la protéine nestine ou que l’expression de nestine est induite en réponse aux facteurs pro-fibrotiques impliqués dans la fibrose réactive. En effet, l’exposition des myofibroblastes normaux et des myofibroblastes isolés des cœurs hypertrophiés à l’AII, TGF-B1 et EGF augmente significativement l’expression de la protéine nestine, tandis que l’expression de l’α-SMA demeure inchangée. De plus, de manière prédominante dans le cœur hypertrophié, des cellules non-vasculaires CD31(+) ont été détectées dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire. Ces cellules co-expriment nestine et collagène suggérant une transition des cellules endothéliales vers un phénotype mésenchymateux. Finalement, la protéine nestine, sous sa forme filamenteuse, a été détectée dans les cellules endothéliales de l’artère coronaire humaine et leur exposition au TGF-B1, induit l’expression de collagène. En revanche, l’expression de collagène a été détectée dans les cellules microvasculaires de rats CD31(+), alors que l’expression de nestine est absente. En réponse aux traitements de TGF-B1 et EGF, l’expression de nestine, sous sa forme non-filamenteuse, est détectée dans les cellules microvasculaires de rats. Collectivement, ces données supportent la prémisse selon laquelle la réponse de fibrose réactive dans les cœurs hypertrophiés, suite à une constriction aortique supra-rénale, est attribuée en partie à l’augmentation de l’apparition des cellules mésenchymateuses positives à l’expression de nestine qui proviennent des fibroblastes résidents du ventricule. De plus, les données in vivo et in vitro suggèrent que les cellules endothéliales déplacées représentent une source additionnelle des cellules mésenchymateuses nestine(+) dans le cœur hypertrophié et contribuent au développement de la fibrose réactive. Cibler la protéine nestine peut représenter une approche thérapeutique afin d’atténuer la réponse de fibrose réactive indépendamment de l’origine des cellules mésenchymateuses.

Effets cellulaires de l’activation de ligases de l’ubiquitine par la protéine lysosomale LITAF

LITAF (lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha factor), une protéine lysosomale, possède deux motifs PPXY capables d’interagir avec les domaines WW d’un sous-groupe spécifique de trois ligases de l’ubiquitine. Ces ligases sont impliquées dans l’ubiquitylation ainsi que la dégradation de diverses protéines cellulaires aux lysosomes et aux protéasomes. Les travaux menés dans le cadre de cette étude visaient à démontrer que LITAF active ces ligases et à déterminer les conséquences de cette activation sur les substrats de ces ligases. Pour y parvenir, des expériences d’ubiquitylation in vivo et in vitro ont été menées en présence de LITAF ainsi que des ligases et des substrats appropriés. L’activation des ligases a été mesurée par leur taux d’autoubiquitylation et celle de leurs substrats par leur taux d’ubiquitylation et de dégradation. Les résultats obtenus montrent que l’activité des ligases est augmentée en présence de LITAF et que l’ubiquitylation et la dégradation des substrats de ces ligases sont partiellement augmentées. LITAF semble donc jouer un rôle de régulateur des ligases de l’ubiquitine. L’importance de ces résultats réside dans le fait que l'expression et la localisation intracellulaire de LITAF sont affectées dans plusieurs pathologies. Nos résultats amènent un éclairage nouveau sur le rôle physiologique de cette protéine et pourraient expliquer en partie comment l'altération de l'expression de LITAF affecte l'équilibre cellulaire.

Role of Reactive Gliosis and Neuroinflammation in Experimental Glaucoma

Le glaucome est la principale cause de cécité irréversible dans le monde. Chez les patients atteints de cette pathologie, la perte de la vue résulte de la mort sélective des cellules ganglionnaires (CGR) de la rétine ainsi que de la dégénérescence axonale. La pression intraoculaire élevée est considérée le facteur de risque majeur pour le développement de cette maladie. Les thérapies actuelles emploient des traitements pharmacologiques et/ou chirurgicaux pour diminuer la pression oculaire. Néanmoins, la perte du champ visuel continue à progresser, impliquant des mécanismes indépendants de la pression intraoculaire dans la progression de la maladie. Il a été récemment démontré que des facteurs neuroinflammatoires pourraient être impliqués dans le développement du glaucome. Cette réponse est caractérisée par une régulation positive des cytokines pro-inflammatoires, en particulier du facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα). Cependant, le mécanisme par lequel le processus neuroinflammatoire agit sur la mort neuronale reste à clarifier. L’hypothèse principale de ce doctorat propose que les facteurs pro-inflammatoires comme le TNFα et la phosphodiestérase 4 (PDE4) interagissent avec les mécanismes moléculaires de la mort neuronale, favorisant ainsi la survie et la protection des CGRs au cours du glaucome. Dans la première partie de ma thèse, J’ai utilisé un modèle in vivo de glaucome chez des rats Brown Norway pour montrer que l’expression du TNFα est augmentée après l'induction de l'hypertension oculaire. L'hypothèse spécifique de cette étude suggère que les niveaux élevés de TNFα provoquent la mort des CGRs en favorisant l'insertion de récepteurs AMPA perméables au calcium (CP-AMPAR) à la membrane cytoplasmique. Pour tester cette hypothèse, j’ai utilisé un inhibiteur sélectif de la forme soluble du TNFα, le XPro1595. L'administration de cet agent pharmacologique a induit une protection significative des somas et des axones des neurones rétiniens. L'évaluation de la perméabilité au cobalt a montré que le TNFα soluble est impliqué dans l'insertion de CP-AMPAR à la membrane des CGRs lors du glaucome. L’exposition des neurones à une pression oculaire élevée est à l’origine de la hausse de la densité membranaire des CP-AMPARs, grâce à une diminution de l’expression de la sous-unité GluA2. La présence de GluA2 au sein du récepteur ne permet pas l’entrée du calcium à l’intérieur de la cellule. L'administration intraoculaire d’antagonistes spécifiques des CP-AMPARs promeut la protection des somas et des axones des CGRs. Ces résultats montrent que les CP-AMPARs jouent un rôle important dans la pathologie du glaucome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé l'effet neuroprotecteur d’un inhibiteur de la PDE4, l’ibudilast, dans notre modèle de glaucome. L'hypothèse spécifique s’oriente vers une atténuation de la réponse neuroinflammatoire et de la gliose par l’administration d’ibudilast, favorisant ainsi la protection neuronale. Les résultats montrent que dans les rétines glaucomateuses, l’ibudilast diminue la gliose et l'expression de plusieurs facteurs tels que le TNFα, l'interleukine-1β (IL-1β), l’interleukine-6 (IL-6) et le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF). Chez les rats glaucomateux, nous avons observé une expression notable de PDE4A dans les cellules de Müller, qui est en corrélation avec l'accumulation de l’AMP cyclique (AMPc) dans ces cellules après un traitement d’ibudilast. Finalement, nous avons démontré que la protection des CGRs via l’administration d’ibudilast est un mécanisme dépendent de l’AMPc et de la protéine kinase A (PKA). En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse identifient deux mécanismes différents impliqués dans la perte des CGRs au cours du glaucome. Ces mécanismes pourraient fournir des perspectives potentielles pour le développement de nouvelles stratégies de traitement du glaucome.

Développements et applications de méthodes computationnelles pour l'étude de l'agrégation des protéines amyloïdes

Les protéines sont au coeur de la vie. Ce sont d'incroyables nanomachines moléculaires spécialisées et améliorées par des millions d'années d'évolution pour des fonctions bien définies dans la cellule. La structure des protéines, c'est-à-dire l'arrangement tridimensionnel de leurs atomes, est intimement liée à leurs fonctions. L'absence apparente de structure pour certaines protéines est aussi de plus en plus reconnue comme étant tout aussi cruciale. Les protéines amyloïdes en sont un exemple marquant : elles adoptent un ensemble de structures variées difficilement observables expérimentalement qui sont associées à des maladies neurodégénératives. Cette thèse, dans un premier temps, porte sur l'étude structurelle des protéines amyloïdes bêta-amyloïde (Alzheimer) et huntingtine (Huntington) lors de leur processus de repliement et d'auto-assemblage. Les résultats obtenus permettent de décrire avec une résolution atomique les interactions des ensembles structurels de ces deux protéines. Concernant la protéine bêta-amyloïde (AB), nos résultats identifient des différences structurelles significatives entre trois de ses formes physiologiques durant ses premières étapes d'auto-assemblage en environnement aqueux. Nous avons ensuite comparé ces résultats avec ceux obtenus au cours des dernières années par d'autres groupes de recherche avec des protocoles expérimentaux et de simulations variés. Des tendances claires émergent de notre comparaison quant à l'influence de la forme physiologique de AB sur son ensemble structurel durant ses premières étapes d'auto-assemblage. L'identification des propriétés structurelles différentes rationalise l'origine de leurs propriétés d'agrégation distinctes. Par ailleurs, l'identification des propriétés structurelles communes offrent des cibles potentielles pour des agents thérapeutiques empêchant la formation des oligomères responsables de la neurotoxicité. Concernant la protéine huntingtine, nous avons élucidé l'ensemble structurel de sa région fonctionnelle située à son N-terminal en environnement aqueux et membranaire. En accord avec les données expérimentales disponibles, nos résultats sur son repliement en environnement aqueux révèlent les interactions dominantes ainsi que l'influence sur celles-ci des régions adjacentes à la région fonctionnelle. Nous avons aussi caractérisé la stabilité et la croissance de structures nanotubulaires qui sont des candidats potentiels aux chemins d'auto-assemblage de la région amyloïde de huntingtine. Par ailleurs, nous avons également élaboré, avec un groupe d'expérimentateurs, un modèle détaillé illustrant les principales interactions responsables du rôle d'ancre membranaire de la région N-terminal, qui sert à contrôler la localisation de huntingtine dans la cellule. Dans un deuxième temps, cette thèse porte sur le raffinement d'un modèle gros-grain (sOPEP) et sur le développement d'un nouveau modèle tout-atome (aaOPEP) qui sont tous deux basés sur le champ de force gros-grain OPEP, couramment utilisé pour l'étude du repliement des protéines et de l'agrégation des protéines amyloïdes. L'optimisation de ces modèles a été effectuée dans le but d'améliorer les prédictions de novo de la structure de peptides par la méthode PEP-FOLD. Par ailleurs, les modèles OPEP, sOPEP et aaOPEP ont été inclus dans un nouveau code de dynamique moléculaire très flexible afin de grandement simplifier leurs développements futurs.

Rôles de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans l'angiogenèse, la perméabilité vasculaire et la progression tumorale

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale.

Les effets du dalcetrapib, un inhibiteur de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP), sur la structure et la fonction des lipoprotéines de haute densité (HDL) dans l’étude dal-PLAQUE2

Introduction : Le dalcetrapib, inhibiteur de la glycoprotéine hydrophobe de transfert des esters de cholestérol (CETP), a été étudié dans le cadre de l’essai clinique de phase II dal-PLAQUE2 (DP2). L’objectif principal est d’étudier l’effet du dalcetrapib après 1 an de traitement sur la structure et la fonction des HDL dans une sous-population de la cohorte DP2. Méthode : Les sujets de la cohorte DP2 ayant une série de mesures de cIMT et des échantillons de plasma et sérum au baseline et à 1 an de traitement furent sélectionnés (379 sujets: 193 du groupe placebo (PCB) et 186 du groupe dalcetrapib (DAL)). Des données biochimiques prédéterminées, le profil des concentrations et tailles des sous-classes de HDL et LDL en résonance magnétique nucléaire (RMN) et 2 mesures de capacité d’efflux de cholestérol (CEC) du sérum ont été explorées. Les données statistiques furent obtenues en comparant les changements à un an à partir du « baseline » avec un ANOVA ou ANCOVA. La procédure normalisée de fonctionnement d’essai d’efflux de cholestérol permet de calculer l’efflux fractionnel (en %) de 3H-cholestérol des lignées cellulaires BHK-ABCA1 (fibroblastes) et J774 (macrophages, voie ABCA1) et HepG2 (hépatocytes, voie SR-BI), vers les échantillons sériques de la cohorte DP2. Résultats : Pour la biochimie plasmatique, un effet combiné des changements d’activité de CETP dans les 2 groupes a causé une réduction de 30% dans le groupe DAL. Après 1 an de traitement dans le groupe DAL, la valeur de HDL-C a augmenté de 35,5% (p < 0,001) et l’apoA-I a augmenté de 14,0% (p < 0,001). Au profil RMN, dans le groupe DAL après 1 an de traitement, il y a augmentation de la taille des HDL-P (5,2%; p < 0,001), des grosses particules HDL (68,7%; p < 0,001) et des grosses particules LDL (37,5%; p < 0,01). Les petites particules HDL sont diminuées (-9,1%; p < 0,001). Il n’y a aucune différence significative de mesure de cIMT entre les deux groupes après 1 an de traitement. Pour la CEC, il y a augmentation significative par la voie du SR-BI et une augmentation via la voie ABCA1 dans le groupe DAL après 1 an de traitement. Conclusion : Après un an de traitement au dalcetrapib, on note une hausse de HDL-C, des résultats plutôt neutres au niveau du profil lipidique par RMN et une CEC augmentée mais trop faible pour affecter la valeur de cIMT chez les échantillons testés.

Étude des mécanismes d’extraction lipidique par le peptide mélittine et la protéine BSP1

Les peptides et protéines extracteurs de lipides (PEL) se lient aux membranes lipidiques puis en extraient des lipides en formant de plus petits auto-assemblages, un phénomène qui peut aller jusqu'à la fragmentation des membranes. Dans la nature, cette extraction se produit sur une gamme de cellules et entraîne des conséquences variées, comme la modification de la composition de la membrane et la mort de la cellule. Cette thèse se penche sur l’extraction lipidique, ou fragmentation, induite par le peptide mélittine et la protéine Binder-of-SPerm 1 (BSP1) sur des membranes lipidiques modèles. Pour ce faire, des liposomes de différentes compositions sont préparés et incubés avec la mélittine ou la BSP1. L'association aux membranes est déterminée par la fluorescence intrinsèque des PEL, tandis que l'extraction est caractérisée par une plateforme analytique combinant des tests colorimétriques et des analyses en chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LCMS). La mélittine fait partie des peptides antimicrobiens cationiques, un groupe de PEL très répandu chez les organismes vivants. Ces peptides sont intéressants du point du vue médical étant donné leur mode d’action qui vise directement les lipides des membranes. Plusieurs de ceux-ci agissent sur les membranes des bactéries selon le mécanisme dit « en tapis », par lequel ils s’adsorbent à leur surface, forment des pores et ultimement causent leur fragmentation. Dans cette thèse, la mélittine est utilisée comme peptide modèle afin d’étudier le mécanisme par lequel les peptides antimicrobiens cationiques fragmentent les membranes. Les résultats montrent que la fragmentation des membranes de phosphatidylcholines (PC) est réduite par une déméthylation graduelle de leur groupement ammonium. L'analyse du matériel fragmenté révèle que les PC sont préférentiellement extraites des membranes, dû à un enrichissement local en PC autour de la mélittine à l'intérieur de la membrane. De plus, un analogue de la mélittine, dont la majorité des résidus cationiques sont neutralisés, est utilisé pour évaluer le rôle du caractère cationique de la mélittine native. La neutralisation augmente l'affinité du peptide pour les membranes neutres et anioniques, réduit la fragmentation des membranes neutres et augmente la fragmentation des membranes anioniques. Malgré les interactions électrostatiques entre le peptide cationique et les lipides anioniques, aucune spécificité lipidique n'est observée dans l'extraction. La BSP1 est la protéine la plus abondante du liquide séminal bovin et constitue un autre exemple de PEL naturel important. Elle se mélange aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et extrait des lipides de leur membrane, notamment le cholestérol et les phosphatidylcholines. Cette étape cruciale modifie la composition lipidique de la membrane du spermatozoïde, ce qui faciliterait par la suite la fécondation de l’ovule. Cependant, le contact prolongé de la protéine avec les spermatozoïdes endommagerait la semence. Cette thèse cherche donc à approfondir notre compréhension de ce délicat phénomène en étudiant le mécanisme moléculaire par lequel la protéine fragmente les membranes lipidiques. Les résultats des présents travaux permettent de proposer un mécanisme d’extraction lipidique en 3 étapes : 1) L'association à l’interface des membranes; 2) La relocalisation de l’interface vers le cœur lipidique; 3) La fragmentation des membranes. La BSP1 se lie directement à deux PC à l'interface; une quantité suffisante de PC dans les membranes est nécessaire pour permettre l'association et la fragmentation. Cette liaison spécifique ne mène généralement pas à une extraction lipidique sélective. L'impact des insaturations des chaînes lipidiques, de la présence de lysophosphatidylcholines, de phosphatidyléthanolamine, de cholestérol et de lipides anioniques est également évalué. Les présentes observations soulignent la complexe relation entre l'affinité d'un PEL pour une membrane et le niveau de fragmentation qu'il induit. L'importance de la relocalisation des PEL de l'interface vers le cœur hydrophobe des membranes pour permettre leur fragmentation est réitérée. Cette fragmentation semble s'accompagner d'une extraction lipidique préférentielle seulement lorsqu'une séparation de phase est induite au niveau de la membrane, nonobstant les interactions spécifiques PEL-lipide. Les prévalences des structures amphiphiles chez certains PEL, ainsi que de la fragmentation en auto-assemblages discoïdaux sont discutées. Finalement, le rôle des interactions électrostatiques entre les peptides antimicrobiens cationiques et les membranes bactériennes anioniques est nuancé : les résidus chargés diminueraient l'association des peptides aux membranes neutres suite à l'augmentation de leur énergie de solvatation.

"Procalcitonine et protéine C-réactive comme marqueurs des infections bactériennes : une revue systématique et une méta-analyse"

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle de l'endogline et de la protéine kinase c-tak1 dans le cancer de la prostate

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle de la protéine kinase C dans la désensibilisation hétérologue des récepteurs [bêta]₁-et [bêta]₂-adrénergiques

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.