199 resultados para Foie, tumeur maligne
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Le dveloppement sexuel est un processus complexe qui dpend de nombreux gnes, une mutation pouvant entraner un dveloppement sexuel anormal. Par ailleurs, des anomalies chromosomiques peuvent avoir des rpercussions importantes sur la dtermination gonadique, surtout lorsqu'il s'agit du chromosome Y puisqu'il porte le gne cl du dveloppement sexuel masculin. Premirement, nous avons identifi par cytogntique molculaire le point de cassure chez 5 patients avec une translocation X;Y et 10 patients avec un chromosome Y isodicentrique. Nous avons ainsi dmontr que certaines rgions sont plus risque d'tre remanies, notamment lorsqu'elles contiennent des palindromes ou d'autres squences rptes. Nous avons galement tabli une relation entre la distance sparant le centromre et le point de cassure et l'instabilit des chromosomes Y isodicentriques lors des divisions cellulaires. Deuximement, nous avons tudi en cytogntique les gonades de 22 patients avec un chromosome Y normal ou remani et prsentant un dveloppement sexuel anormal. Nous avons mis en vidence la perte du chromosome Y remani dans une majorit de cellules gonadiques des 10 patients tudis, expliquant leur phnotype sexuel anormal. Cependant, chez 11 des 12 patients avec un chromosome Y normal, aucun mosacisme expliquant clairement leur dtermination gonadique anormale n'a t retrouv. Finalement, nous avons analys par immunohistochimie les gonades dysgnsiques de 30 patients avec une anomalie du dveloppement sexuel et un chromosome Y normal ou remani. Nos travaux ont montr la prsence de cellules germinales immatures au sein de cordons sexuels primitifs sous forme de tissu gonadique indiffrenci dans 15 gonades, dont 9 ont volu en tumeur gonadique. Dans 13 autres gonades, ces cellules germinales immatures avaient disparues par apoptose. Dans l'ensemble, notre recherche met en vidence la susceptibilit du chromosome Y subir des remaniements et tre instable lors des divisions cellulaires, et indique que le mosacisme peut avoir des rpercussions sur la dtermination gonadique. Nos travaux montrent galement que le tissu gonadique indiffrenci peut voluer vers deux entits, une tumeur gonadique ou une bandelette suite l'apoptose des cellules germinales, mettant en lumire la ncessit d'analyser le tissu gonadique des patients XY avec dysgnsie gonadique dont les gonades sont laisses en place.
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Limmunothrapie tumorale mdiation cellulaire est un traitement qui utilise le systme immunitaire des patients afin dinduire une rponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette rponse est produite suite la reconnaissance des antignes par les T CD8+. Ces cibles sont appeles antignes tumoraux (TAA) et dfinies comme des protines exprimes par les cellules cancreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifi Dickkopf-1 (DKK1), une protine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothrapie mdiation cellulaire efficace requiert lidentification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothrapie pourrait galement tre amliores par laugmentation de la puissance daction anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spcifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractrisation de lexpression de DKK1 dans les cancers communs et la dtermination de son immunognicit afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints dun cancer commun, vers un phnotype moins diffrenti afin daugmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractris lexpression de DKK1 dans le cancer du sein et dans dautres cancers communs. Le profil dexpression de DKK1 a t tudi par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignes cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. Lexpression de DKK1 a aussi t tudie dans des chantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant dun cancer du sein exprimaient DKK1. La moiti des tumeurs DKK1(+) tait triple ngative, donc pas de rcepteurs dstrogne et de progestrone et tait Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilits de traitements trs restreintes). De plus, 50% des chantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectues dans le cancer du poumon ont t, par la suite, corrobores par d'autres groupes qui ont montr une corrlation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Aprs avoir confirme lexpression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons valu limmunognicit de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectu des stimulations in vitro de cellules mononucles du sang priphrique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s dun cancer du sein ou du poumon avec des peptides drivs de DKK1 pouvant tre prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont t identifis et isols. Par essai multiplex et cytomtrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalit dun ces clones T CD8+ spcifiques DKK1 a t tudie et a rvle un profil effecteur, renforant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans lensemble, les rsultats obtenus dans cette premire partie de thse suggrent une possible utilisation de DKK1 en immunothrapie contre les cancers communs, attribuable son expression dans ces cancers et la possibilit de faire prolifrer des T CD8+ effecteurs spcifiques DKK1 partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thse, je dcrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints dun cancer commun, afin daugmenter la force et la dure de leurs fonctions anti-tumorales. Il a t dmontr que des lymphocytes moins diffrentis sont capables dune rponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons bas ce projet sur lutilisation dun inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur confrer un phnotype moins diffrenti, partageant des caractristiques de la cellule nave et de la cellule mmoire. Des cultures de T CD8+, spcifiques des antignes viraux, en prsence de linhibiteur ont permis daugmenter la scrtion dinterfron (IFN)- et leur activit cytotoxique. Ces rsultats indiquent un effet de lactivation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportes pour la premire fois chez les T CD8+ humains et suggrent une nouvelle stratgie, applicables limmunothrapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activit anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont men la ralisation dune tape trs importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la dmonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux drivs dorganes importants. Ces travaux ont galement men la dmonstration de limmunognicit de DKK1, par lidentification dun peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, ltude de la polyfonctionnalit des T CD8+ spcifiques DKK1 a rvle un profil effecteur favorable pour lobtention dune rponse anti-tumorale efficace. Ces dcouvertes pourraient servir llaboration dune stratgie dimmunothrapie mdiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, ltude phnotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donn lieu lobservation dun phnotype encore jamais rapport chez lhumain, confrant aux T CD8+ un aspect moins diffrenti avec des caractristiques propre un phnotype mmoire. Ces rsultats sont pertinents dans lamlioration de limmunothrapie du cancer, passant par laugmentation de la persistance des lymphocytes. En rsum, les rsultats prsents dans cette thse de doctorat fournissent des vidences indniables quant la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothrapie mdiation cellulaire des cancers communs. Ces rsultats fournissent galement des preuves quant la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par lactivation de la voie de la voie de Wnt, afin de gnrer des lymphocytes mdiateurs plus efficaces pour ce type de thrapie.
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Il y a 4 isoforme de p38 : , , , and . MK5, l'origine identifi comme tant un rgulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour tre active par la protine kinase p38 (qui est un mitogne activ par la protine kinase, MAPK). Cette dernire est implique dans les mcanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est galement active par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien quelles soient fortement exprimes dans le coeur, le rle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par consquent, nous avons tudi l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) induisant un surcharge chronique de pression chez les souris htrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a t augment chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'chocardiographie de la trans-thoracique dmontre que la surcharge de pression a altr la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observ moins de dpt de collagne, valu par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Paralllement, le niveau de lARNm de collagne type1 alpha-1 a t significativement diminu dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De mme, ERK3, mais pas ERK5 ni p38, co-IP avec MK5 dans les 2 modles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, lajout exognique de GST-MK5 a abaiss ERK4 et p38, mais pas ERK3 dans les lystes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38 ne dmontrent aucune co-IP avec MK5. Ces donnes suggrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38, est capable dinteragir avec, et rguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entirement avec ERK3 et par consquent MK5 nest pas disponible pour lier les protines exogniques. Les souris htrozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont galement dmontr une rduction ou une absence de collagne et une faible expression dARNm du collagne type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces rsultats dmontrent un important rle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons galement dmontr 5 variant d'pissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une dltion de 6 paires de base dans lexon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des diffrents variant d'pissage a t vrifie par PCR en temps rel (qPCR). Bien que lexpression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant tait tissu-spcifique (coeur, rein, pancras, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant dpissage varie pendant la surcharge de pression et le dveloppement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqu que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situ au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimules. Suite une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors quune petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'pissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rle exact oblige des recherches supplmentaires. Except lisoforme , toutes les isoformes de p38 sont exprimes dans le coeur et la forme est considre comme tant l'isoforme dominante. Lanalyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont dmontr que p38 et p38 sont les deux isoformes prdominantes alors que p38 et p38 sont exprimes aux mmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a dmontr que p38 et p38 se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite la surcharge par TAC, p38 s'est accumul dans noyau tandis que la distribution de p38 est demeure inchange. Ainsi, l'abondance de p38 et sa translocalisation nuclaire suite la surcharge de pression indique un rle potentiel dans l'expression gnique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en vidence pour la premire fois un rle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38 avec p38, et la localisation diffrentielle de p38 pendant la surcharge aigu ou chronique de pression suggrent diffrents rles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque.
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Lhpatite autoimmune (HAI) est une maladie grave affectant le foie et prsentant un haut taux de mortalit lorsque non traite. Les traitements disponibles sont efficaces, mais de graves effets secondaires leur sont associs. Ces effets secondaires sont gnralement le rsultat d'une forte immunosuppression et dautres sont spcifiques chaque mdicament. Aucune immunothrapie spcifique nest prsentement disponible pour le traitement de lHAI. Rcemment, un modle murin dHAI a t dvelopp dans notre laboratoire par xnoimmunisation des souris C57BL/6 avec les antignes humains de l'HAI de type 2. Ce modle prsente la plupart des caractristiques biochimiques et cliniques retrouves chez les patients atteints d'HAI de type 2. Dans cette tude, nous avons value lefficacit de deux types de traitement pour lHAI de type 2 laide de notre modle murin. Dans un premier temps, lanticorps anti-CD3 a t tudi en prophylaxie et en traitement. Nous avons montr quune posologie de 5g danti-CD3 i.v. par jour pendant 5 jours conscutifs induit une rmission chez les souris avec HAI de type 2 tablie (traitement). Cette rmission est caractrise par une normalisation des niveaux dalanine aminotransfrase et une diminution significative de linflammation hpatique. Cette rmission semble tre associe une dpltion partielle et transitoire des lymphocytes T CD3+ dans la priphrie et une augmentation des lymphocytes T rgulateurs CD4+, CD25+ et Foxp3+ dans le foie. La mme posologie lorsquelle est applique en prophylaxie na pas russi prvenir lapparition de lHAI de type 2. La deuxime voie de traitement consiste en ladministration par voie intranasale dun forte dose de formiminotransfrase cyclodsaminase murin (mFTCD), un autoantigne reconnu dans lHAI de type 2. Une administration en prophylaxie par voie intranasale de 100g de mFTCD par jour durant 3 jours conscutifs arrive prvenir lHAI de type 2 en diminuant linflammation hpatique au bout de deux semaines post-traitement.
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Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent au tournant de ce sicle la principale cause de mortalit dans le monde. Parmi les facteurs de risque, lhypercholestrolmie et lobsit abdominale sont directement lies au dveloppement prcoce de lathrosclrose. Lhypercholestrolmie familiale, communment associe une dficience des rcepteurs des lipoprotines de basse densit (LDLR), est connue comme cause de maladie prcoce dathrosclrose et de calcification aortique chez lhumain. La subtilisine convertase proprotine/kexine du type 9 (PCSK9), membre de la famille des proprotines convertases, est trouve indirectement associe aux MCV par son implication dans la dgradation du LDLR. Chez l'humain, des mutations du gne PCSK9 conduisent soit une hypercholestrolmie familiale, soit une hypocholestrolmie, selon que la mutation entrane un gain ou une perte de fonction, respectivement. Il demeure incertain si les individus porteurs de mutations causant un gain de fonction de la PCSK9 dvelopperont une calcification aortique ou si des mutations entranant une perte de fonction provoqueront une obsit abdominale. Dans cette tude, nous avons examin : 1) leffet dune surexpression de PCSK9 dans le foie de souris sur la calcification aortique ; 2) les consquences dune dficience en PCSK9 (Pcsk9 KO), mimant une inhibition pharmacologique, sur le tissu graisseux. Nous avons utilis un modle de souris transgnique (Tg) surexprimant le cDNA de PCSK9 de souris dans les hpatocytes de souris et dmontrons par tomographie calcule quune calcification survient de faon moins tendue chez les souris PCSK9 Tg que chez les souris dficientes en LDLR. Alors que le PCSK9 Tg et la dficience en LDLR causaient tous deux une hypercholestrolmie familiale, les niveaux seuls de cholestrol circulant ne parvenaient pas prdire le degr de calcification aortique. Dans une seconde tude, nous utilisions des souris gntiquement manipules dpourvues de PSCK9 et dmontrons que laccumulation de graisses viscrales (adipogense) apparat rgule par la PCSK9 circulante. Ainsi, en labsence de PCSK9, ladipogense viscrale augmente vraisemblablement par rgulation post-traductionnelle des rcepteurs lipoprotines de trs basse densit (VLDLR) dans le tissu adipeux. Ces deux modles mettent en vidence un quilibre dynamique de la PCSK9 dans des voies mtaboliques diffrentes, ralisant un lment cl dans la sant cardiovasculaire. Par consquent, les essais dinvestigations et daltrations biologiques de la PCSK9 devraient tre pris en compte dans un modle animal valide utilisant une mthode sensible et en portant une attention prudente aux effets secondaires de toute intervention.
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Le dveloppement du systme nerveux central (SNC) chez les vertbrs est un processus d'une extrme complexit qui ncessite une orchestration molculaire trs prcise. Certains gnes exprims trs tt lors du dveloppement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gnes, on retrouve le facteur de transcription Lim homodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex crbral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume rduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) d une dficience en rythrocytes matures. L'objectif principal de cette thse est de caractriser le rle molculaire de Lhx2 dans le dveloppement des yeux et du cortex crbral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription homodomaine exprim dans la portion antrieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le dveloppement de l'oeil dbute par une vagination bilatrale de cette rgion. Nous dmontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premires tapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retarde dans la plaque neurale antrieure. Au stade de la formation de la vsicule optique, l'absence de Lhx2 empche l'activation de Six6 (un facteur de transcription galement essentiel au dveloppement de l'il). Nous dmontrons que Lhx2 et Pax6 cooprent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gne essentiel pour la dtermination de l'identit rtinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour tablir l'identit rtinienne dfinitive et promouvoir la prolifration cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprim dans le tlencphale, rgion qui donnera naissance au cortex crbral. L'absence de Lhx2 entrane une diminution de la prolifration des cellules prognitrices neurales dans cette rgion e12.5. Nous dmontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules prognitrices neurales (cellules de glie radiale) se diffrencient prmaturment en cellules prognitrices intermdiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phnotypes sont corrls une baisse d'activit de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprim dans le tlencphale. De plus, Lhx2 et des co-rpresseurs s'associent la chromatine de la rgion promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex crbral en dveloppement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifration des cellules prognitrices neurales.
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Les patients atteints de la maladie de Tangier prsentent des niveaux trs bas de lipoprotines de haute densit (HDL), un facteur de risque pour le dveloppement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre lathrosclrose puisquelles effecturent le transport rebours du cholestrol des tissus priphriques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est cause par des mutations dans le gne du transporteur ATP-binding cassette A1 (ABCA1). Le modle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de lapolipoprotine A-I (apoA-I), la composante protique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discodales. Un dfaut dans la lipidation de lapoA-I par lABCA1 abolit la biognse des HDL. Nous avons voulu tudier les sites dinteraction de lABCA1 avec son ligand (lapoA-I), les voies de biognse impliques, et limplication des pr--HDL dans lefflux du cholestrol par la voie de lABCA1. Dabord, nous avons utilis un systme de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de dterminer les sites de liaison cellulaires de lapoA-I, leurs localisations et limplication de lABCA1. Nous avons trouv que la majorit de lapoA-I nest pas associe lABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, tait la membrane plasmique. Ensuite, Une tude plus dtaille examinait les voies de lipidation de lapoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montr que la lipidation de lapoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies diffrentes cintiquement. Finalement, nous avons montr que les pr--HDL effluent aussi (efficacement que lapoA-I) le cholestrol par la voie de lABCA1. Ces observations runies dmontrent que 1) la majorit de lapoA-I sest trouv non-associe lABCA1; 2) deux tiers de lapoA-I sassocient a la membrane plasmique; 3) la lipidation de lapoA-I se fait en partie la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1.
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La tumeur des cellules de la granulosa (GCT) reprsente 5% des cas de cancers ovariens chez la femme. Bien que considres comme peu malignes, la mort survient dans 80% des cas suite une recrudescence de la maladie. En dpit de ces statistiques sinistres, peu dtudes ont t portes sur ce type de cancer. Le premier objectif de cette tude consistait lucider les mcanismes molculaires causant les GCT en dmontrant limplication de la voie de signalisation PI3K/AKT dans leur tiologie. Pour ce faire, nous avons employ la technologie Cre-Lox afin de cibler le gne Pten (antagoniste de cette voie) spcifiquement dans les cellules de la granulosa chez la souris. Ces souris (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) ont occasionnellement dvelopp des GCT, soutenant notre hypothse de limportance de la voie PI3K/AKT dans leur tiologie. La voie WNT/CTNNB1 est une autre voie de signalisation qui a rcemment t implique dans le dveloppement des GCT. Dans le cadre de ce projet, nous avons galement test lexistence possible dune synergie fonctionnelle entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le dveloppement de la maladie. Pour ce faire, nous avons cr le modle transgnique Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+, chez lequel les cellules de la granulosa prsentant non seulement une dsinhibition de la voie PI3K/AKT, mais aussi une suractivation de la voie WNT/CTNNB1. Tel que prdit, les souris Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ ont dvelopp une forme de GCT beaucoup plus agressive que celle observe chez les femelles Ptenflox/flox;Amhr2cre/+. Spcifiquement, le dveloppement des tumeurs se dclenchait plus tt, leur croissance tait beaucoup plus rapide, nous avons pu observer des mtastases pulmonaires et la dissmination des cellules tumorales dans la cavit pritonale, et la maladie tait invariablement fatale avant lge de 8 semaines. Le modle Ptenflox/flox;Ctnnb1flox (ex3)/+;Amhr2cre/+ a donc servi dmontrer l'existence d'une synergie entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le dveloppement de la GCT. De faon inattendue, les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ ont aussi prsent un phnotype de sous-fertilit qui ntait pas dorigine ovarienne. Il a rcemment t dmontr que la souche Amhr2cre dirige lexpression de Cre non seulement aux cellules de la granulosa, mais aussi au stroma utrin et au myomtre. Le second objectif de ce travail tait donc de dmontrer si et comment le phnotype dinfertilit chez les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ pouvait dcouler dun dfaut utrin. Lors de l'implantation, les cellules du stroma utrin se diffrencient en cellules dciduelles pour former la dcidua maternelle (DM), qui se rgresse ensuite par apoptose afin de faciliter linvasion des cellules trophoblastiques. De plus, la DM, en collaboration avec le tissu foetal, recrute des uNKs dont le rle est de remodeler les artres spirales pour augmenter lapport sanguin maternel vers le foetus en dveloppement. Nous avons pu dmontrer que l'utrus des femelles gestantes Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ prsentait une DM anormalement rsistante l'apoptose, moins de uNKs et des artres spirales non-remodeles. Par consquent, linvasion des cellules du trophoblaste tait restreinte, compromettant le dveloppement et la survie de l'embryon. Nous avons donc tabli pour la premire fois limportance de Pten lors de la dcidualisation et de linvasion du trophoblaste.
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Ldme crbral est une complication associe lencphalopathie hpatique (EH) lors dune insuffisance hpatique chronique (cirrhose du foie). Prsentement, lorigine de sa pathogense, vasognique (rupture de la barrire hmato-encphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale dions), na pas encore t dtermine. Il a t dmontr que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du ct luminal des microvaisseaux sanguins crbraux (CMV) joue un rle dans le dveloppement de ldme crbral dans des modles dischmie o la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, attnue ldme crbral. Deux modles dEH ont t utiliss pour cette tude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui prsente lhyperammonimie chronique, ldme crbral et le stress oxydatif systmique ; ii) lanastomose portocave (PCA) qui prsente de lhyperammonimie chronique seulement. Les buts du projet taient de: i) dfinir lorigine du dveloppement de ldme chez les rats BDL en tudiant lextravasation de macromolcules, les jonctions serres et lactivation des mtalloprotinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de lhyperammonimie chronique indpendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) valuer le rle de lhyperammonimie et du stress oxydatif et iv) tudier le rle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogense de ldme crbral. Les rsultats du projet dmontrent que ldme est dorigine cytotoxique chez les rats BDL et que lintgrit de la BHE est conserve chez les rats PCA malgr lhyperammonimie. Lexpression gnique du NKCC1 est associe ldme mais pas son expression protique et sa phosphorylation. Enfin, ltude dmontre que lhyperammonimie et le stress oxydatif indpendant ne jouent pas un rle dans la pathogense de ldme mais suggre quils y aient un effet synergique.
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Le cancer pithlial de lovaire (CO) est le cancer gyncologique le plus ltal. Le CO de type sreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqu tardivement et associ un mauvais pronostic. Le CO avanc, surtout trait par chimiothrapie, va devenir chimiorsistant chez la majorit des patientes traites. Bien que des lignes cellulaires du CO aient t drives partir de tumeurs solides et dascites de patientes ayant ou non subi une chimiothrapie, aucune des lignes cellulaires du CO provenant dune mme patiente avant et aprs ses traitements de chimiothrapie nont t tablies prcdemment. Notre laboratoire est le premier dvelopper de telles lignes cellulaires. Nos nouvelles lignes cellulaires sont drives de trois patientes diffrentes (1369, 2295 et 3133) et classes selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou lascite (OV). Nous avons donc caractris ces nouvelles lignes de cellules pr-chimiothrapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothrapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractris les niveaux dexpression de marqueurs pithliaux typiques de kratines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer lorigine pithliale et ovarienne des cellules. Nous avons galement analys le niveau dexpression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CO. Cependant, il ne semble pas y avoir dexpression diffrentielle vidente de ces marqueurs entre les lignes pr-chimiothrapie et post-chimiothrapie. Plus encore, nous avons tudi plusieurs caractristiques tumorigniques des lignes cellulaires, dont la prolifration cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacit former des sphrodes en 3D (par la mthode des gouttelettes inverses), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xnogreffes sous-cutanes). En gnral, il ne semble pas y avoir de diffrences claires entre les cellules pr-chimiothrapie et post-chimiothrapie au niveau du comportement cellulaire, lexception du fait quaucune des lignes post-chimiothrapie semblent tre en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement certaines lignes post-chimiothrapie. Nos rsultats pourront servir mieux comprendre les diffrents mcanismes rgissant les tumeurs malignes du CO de type sreux et mieux comprendre la progression de la maladie travers les diffrents traitements, ce qui nous permettra dacqurir des informations essentielles pour mieux valuer et traiter diffrentes patientes.
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HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue. We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells. Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells. Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ". During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53. Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis. Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival.
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Les mlanomes malins (MM) constituent le deuxime type de cancer le plus frquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi quun des rares cancers dont lincidence augmente annuellement. moins que les MM ne soient exciss temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est trs rfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que lexposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits gnotoxiques, est une dterminante majeure dans lacquisition de MM. cet effet, la rparation par excision de nuclotides (NER) est la ligne de dfense principale contre le dveloppement des mlanomes puisquelle est la voie de rparation prpondrante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgr cela, la contribution potentielle de dfauts de la NER au dveloppement des MM dans la population normale nest toujours pas bien tablie. Notre laboratoire a prcdemment dvelopp une mthode base sur la cytomtrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette mthode a dj mise en vidence quune dficience de lactivit de la protine ATR peut mener une dficience de la NER exclusive la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons dmontr que plusieurs lignes cellulaires cancreuses modles comportent une dficience en NER en phase S, suggrant quune telle dficience puisse caractriser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une dficience en NER en phase S pouvait tre associe une proportion significative de mlanomes et si le tout pouvait tre attribuable une diminution de lactivit dATR. Nos objectifs ont donc t de : (i) mesurer lefficacit de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mlanocytes primaires, (ii) vrifier si le niveau dactivit dATR corrle avec lefficacit de la NER en phase S dans les lignes de MM et (iii) voir si un gne frquemment mut dans les mlanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait cooprer avec ATR pour rguler la NER en phase S dans les mlanomes. Nous avons dmontr que 13 lignes de MM sur 16 ont une capacit grandement diminue rparer les photoproduits induits par UV spcifiquement en phase S. De plus, cette dficience corrle fortement avec une rduction de lactivation dATR et, dans plusieurs lignes de MM, avec une phosphorylation dAkt plus importante. Lutilisation dARN interfrent ou dun inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus daugmenter la phosphorylation dAkt, de rduire la rparation des photoproduits et lactivation dATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) lexpression ectopique de la protine PTEN sauvage dans des lignes dficientes en PTEN (mais pas dune protine PTEN sans activit phosphatase) ou (ii) linhibition pharmacologique dAkt a permis daugmenter la rparation en phase S ainsi que lactivation dATR. En somme, cette tude dmontre quune signalisation dATR dpendante de PTEN/Akt amenant une rparation dficiente des photoproduits gnomiques causs par les UV en phase S peut tre dterminante dans le dveloppement des mlanomes induits par UV.
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Les mcanismes cellulaires anti-prolifratifs, lesquels comprennent lapoptose, aussi appele la mort cellulaire programme, larrt transitoire du cycle cellulaire et la snescence, permettent la cellule de prvenir, en rponse diffrents stress, laccumulation de mutations pouvant conduire une prolifration incontrle et, ventuellement, au dveloppement dune tumeur. La rgulation de ces diffrents mcanismes requiert lactivation de protines appeles des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et lactivation conduit une hausse de lexpression de gnes directement impliqus dans larrt de la prolifration. Au cours des dernires annes, lensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en vidence la complexit de sa fonction, de mme que la multitude de voies de signalisation et de protines avec lesquelles il coopre pour maintenir lintgrit du gnome. De ce fait, ltude des mcanismes dactivation de p53 est de mise pour la comprhension de sa rgulation et, ventuellement, pour la prvention et llaboration de nouvelles stratgies de traitement contre le cancer. Lobjet de cette thse est la mise en vidence dun mcanisme dactivation de p53 et de la snescence par la protine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mcanisme implique une interaction directe entre les deux protines, plus prcisment entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit galement, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage lADN de faon faciliter la phosphorylation de p53 en srine 15. Ainsi, en interagissant la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue la stabilisation et lactivation de p53. En accord avec ce modle, linhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend diminuer le nombre de cellules snescentes suite lexpression de loncogne ca-STAT5A et rduire laccumulation nuclaire de p53 dans ces cellules. De la mme faon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifn-/- sont moins susceptibles dentrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifn+/+, suite une exposition des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de lexpression des gnes cibles de p53, ce qui dmontre que SOCS1 est implique dans lactivation de p53 in vivo. Cette thse a galement pour but de mettre en vidence limplication de SOCS1 dans lactivation dautres facteurs de transcription et, par le fait mme, de dmontrer quelle peut agir comme un rgulateur plus gnral de la transcription. Une tude approfondie de linteraction entre SOCS1 et p53 a permis de dmontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides amins 36-67) est suffisant pour linteraction. Plus prcisment, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phnylalanine 54 (F54) sont les principaux rsidus impliqus. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit lidentification dun motif conserv dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus dun domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces rsultats, SOCS1 est en mesure dinteragir avec chacune des deux protines. Ainsi, la capacit de SOCS1 dinteragir et de rguler lactivit de p53 peut stendre dautres facteurs de transcription. En terminant, le mcanisme prsent dans cette thse contribue la comprhension de la rgulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en vidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle tait jusqualors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rle pour SOCS1 permet dexpliquer de quelle manire une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut dclencher la snescence ou lapoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse rguler diffrents facteurs de transcription permet de la qualifier de rgulateur gnral des facteurs de transcription composs dun domaine de transactivation acide.
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Les lymphocytes B et T sont issus de cellules prognitrices lymphodes de la moelle osseuse qui se diffrencient grce laction de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont linterleukine-7 (IL-7)/IL-7 rcepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprim par les cellules lymphodes et contrle leur croissance et leur diffrenciation. Cette rgulation transcriptionnelle peut tre coordonne par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet tait de comprendre les mcanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le dveloppement des lymphocytes B et T. Pour raliser ce projet, des souris dficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris allles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empche linteraction avec Miz-1, ont t gnres. La caractrisation des souris Miz 1POZ a dmontr que linactivation de Miz-1 perturbe le dveloppement des lymphocytes B et T aux stades prcoces de leur diffrenciation qui dpend de lIL-7. Lanalyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montr que ces cellules surexpriment la protine inhibitrice SOCS1 qui empche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la rgulation la hausse de la protine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrle son activit. En plus de contrler laxe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spcifiquement aux stades prcoces du dveloppement afin dassurer la survie des progniteurs B et T, Miz-1 rgule laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux ncessaires pour la diffrenciation des cellules immatures. La caractrisation des souris c-MycV394D a montr, quant elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indpendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un dfaut de diffrenciation additionnel au niveau de la -slection, tape o les signaux initis par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifration et la diffrenciation des thymocytes en stades plus matures. cette tape du dveloppement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble tre requise pour contrler le niveau dactivation de la voie p53, induite lors du processus de rarrangement V(D)J du TCR. Lexpression de gnes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du rgulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est rgule la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un dbalancement pro-apoptotique qui empche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut tre rtablie ce stade de diffrenciation en assurant une coordination adquate entre les signaux initis par lintroduction dun TCR transgnique et dun transgne codant pour la protine Bcl-2. En conclusion, ces tudes ont montr que Miz-1 intervient deux niveaux du dveloppement lymphode: lun prcoce en contrlant la signalisation induite par lIL-7 dans les cellules B et T, en plus de laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et lautre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. tant donn que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets plusieurs rondes de prolifration, ces tudes serviront mieux comprendre limplication des rgulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la gnration des signaux ncessaires la diffrenciation non aberrante et la survie des ces cellules. Enfin, les modles exprimentaux, souris dficientes ou allles mutantes, utiliss pour ce travail permettront de mieux dfinir les bases molculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de rvler les mcanismes conduisant au lymphome.
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CONTEXTE: L'inefficacit de captation des acides gras libres (AGL) par le tissu adipeux blanc (TAB) est connue pour favoriser la rsistance l'insuline (RI) dans les tissus priphriques, mais dans le foie, elle favorise galement la production accrue de lipoprotines contenant l'apolipoprotine B100 (lipoprotines apoB). Nous avons rcemment dmontr que les femmes post-mnopauses obses avec un nombre lev de lipoprotines apoB jeun (apoB plasmatique > 1,2 g/L) avaient plus de RI que les femmes avec un taux dapoB normal. Notre objectif tait donc d'examiner si l'inefficacit de captation des AGL pourrait tre un mcanisme expliquant la RI, in vivo dans cette population. HYPOTHSES: Les femmes mnopauses en surpoids/obses avec un taux dapoB lev ont moins d'efficacit capter les AGL par le TAB que les femmes avec un taux dapoB faible. MTHODES/RSULTATS: L'efficacit de captation des AGL a t examine dans 22 femmes non diabtiques en surpoids/obses. La population a t spare selon la mdiane dapoB (0.9 g/L) en 2 groupes; les femmes ayant un taux dapoB infrieur vs suprieur la mdiane (N=11/groupe). L'efficacit de captation des AGL par le TAB a t indirectement value en suivant le sort d'un repas riche en gras (0.0162g 13C-trioline/g de matires grasses, 66% de gras, 47g gras/m2 surface corporelle) marqu au 13C-trioline, sur 6h en circulation ([13C]TG et [13C]AGL plasmatiques) et en oxydation (13CO2 dans lair expir [AE]). Lenrichissement en 13C des chantillons dAE et du plasma a t mesur par spectromtrie de masse pour ratio isotopique. Les femmes ayant un apoB lev avaient une clairance plasmatique totale postprandiale des TG (p <0,05) rduite sans diminuer de la clairance plasmatique totale des AGL, par rapport aux femmes ayant un faible taux dapoB. Cependant, en examinant le sort du 13C-trioline, les femmes ayant un apoB lev avait une rduction de la clairance des [13C]TG plasmatiques (44,78 M vs 7,81 M; p <0,05) et des [13C]AGL plasmatiques (2,64 uM vs 0,06 uM; p <0,05) 6h, sans aucune diffrence en % rcupr de 13C-trioline dans le CO2 de lAE. Ces donnes suggrent que les femmes ayant un taux dapoB lev ont une rduction postprandiale de la clairance et de la captation de 13Ctrioline par le TAB. CONCLUSION: La captation inefficace des AGL par le TAB des femmes post-mnopauses en surpoids et obses avec un surplus dapoB peut tre un mcanisme sousjacent la RI chez ces sujets.
