La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.

Étude de la fonction de la protéine RPAP4 et de son association avec l’ARN polymérase II

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante.

Mécanismes de résistance aux inhibiteurs de CCR5

Le travail décrit dans ce manuscrit vise à caractériser les voies de résistance aux inhibiteurs de CCR5. Lors d’une première étape, nous avons développé un test phénotypique clonal nous permettant d’une part d’identifier le tropisme viral et d’autre part de mesurer la résistance aux inhibiteurs des CCR5. Des virus à tropisme R5 ou X4 représentant aussi peu que 0,4% d’un mélange de populations virales sont détectables par ce test, démontrant ainsi sa sensibilité. De plus, grâce à son approche clonale, cette technique permet de différencier les virus à tropisme double de populations virales mixtes. Par la suite, nous avons étudié l’impact des mutations dans les régions variables de la protéine gp120 de l’enveloppe du virus VIH-1 sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5. Pour ce faire, nous avons généré des virus résistants par passage des isolats CC1/85 et BAL, en présence de concentrations sous-inhibitrices de maraviroc (MVC) et vicriviroc (VCV). Après quelques passages du virus CC1/85 en présence de MVC, certaines sont apparues dans differentes régions de la gp120. Par la suite, nous avons sélectionné trois mutations dans les domaines variables de la gp 120, V169M en V2, L317W en V3 et I408T en V4 pour construire des virus contenant des mutations simples, doubles et triples afin d’évaluer la contribution des mutations individuelles ou combinées au phénotype de résistance. Nous avons déterminé la sensibilité de chaque mutant à MVC et VCV, le pourcentage d’infectivité et le tropisme viral par rapport au phénotype sauvage. Tous les mutants ont conservé le tropisme R5 et ont montré une diminution d’infectivité par rapport au contrôle. Nos résultats ont montré que les mutants qui portent des mutations en V4 (I408T) ont eu le plus d'impact sur la susceptibilité au MVC. Finalement, nous avons voulu évaluer l’activité antivirale d’un nouvel inhibiteur de CCR5, VCH-286 avec d’autres inhibiteurs de CCR5 tels que MVC et VVC ainsi que ses interactions avec des médicaments représentatifs de différentes classes d’antirétroviraux ARV employés en clinique pour traiter le HIV/SIDA., afin d’évaluer si ces médicaments pourraient être utilisés dans un même régime thérapeutique. Nous avons tout d’abord évalué indépendamment l’activité antivirale des trois inhibiteurs de CCR5 : VCH-286, MVC et VVC. Par la suite nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec MVC et VVC. Finalement nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec d’autres médicaments antirétroviraux. Ces études ont montré que VCH-286 est un inhibiteur puissant de CCR5 avec une activité antivirale in vitro de l’ordre du nanomolaire et des interactions médicamenteuses favorables avec la majorité des ARV tels que les inhibiteurs de transcriptase inverse, de protéase, d’intégrase, et de fusion employés en clinique pour traiter le VIH/SIDA et des interactions allant de synergie à l'antagonisme avec les inhibiteurs de CCR5. Nos résultats montrent que la plasticité de l’enveloppe virale du VIH-1 a des répercussions sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5, le tropisme et la possible utilisation de ces molécules en combinaison avec d’autres molécules appartenant à la même classe.

Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

Phosphorylation et régulation de l’E3 ubiquitine ligase MDM2 par la protéine kinase RSK dans les mélanomes

La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) régule une variété de protéines intracellulaires qui jouent un rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire. La régulation inappropriée de cette voie de signalisation conduit au développement de nombreux cancers comme le mélanome, qui est caractérisé par des mutations activatrices au niveau des gènes NRAS et BRAF. La protéine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire n’est pas bien compris. RSK a été montrée pour participer à la résistance des mélanomes aux chimiothérapies, mais le mécanisme moléculaire reste encore à élucider. Nous montrons à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique que MDM2 est phosphorylée en réponse à des agonistes et des mutations oncogéniques activant spécifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des méthodes in vitro et in vivo, nous avons constaté que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Sérines 166 et 186, ce qui suggère que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagénèse dirigée envers ces sites nous indique que ces résidus régulent l’ubiquitination de MDM2, suggérant que RSK régule la stabilité de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observé que l’inhibition de RSK conduit à une augmentation du niveau protéique de p53 après un dommage à l’ADN dans les cellules de mélanomes. En conclusion, nos travaux suggèrent un rôle important de la protéine kinase RSK dans la régulation de MDM2 et de sa cible, p53. L’étude de ces mécanismes moléculaires aidera à mieux définir le rôle de RSK dans la croissance tumorale, mais également dans la résistance aux agents chimiothérapeutiques.

Détection de mouvement par modèle biologique de fusion de donnée inspiré de la rétine humaine

Ce mémoire s'intéresse à la détection de mouvement dans une séquence d'images acquises à l'aide d'une caméra fixe. Dans ce problème, la difficulté vient du fait que les mouvements récurrents ou non significatifs de la scène tels que les oscillations d'une branche, l'ombre d'un objet ou les remous d'une surface d'eau doivent être ignorés et classés comme appartenant aux régions statiques de la scène. La plupart des méthodes de détection de mouvement utilisées à ce jour reposent en fait sur le principe bas-niveau de la modélisation puis la soustraction de l'arrière-plan. Ces méthodes sont simples et rapides mais aussi limitées dans les cas où l'arrière-plan est complexe ou bruité (neige, pluie, ombres, etc.). Cette recherche consiste à proposer une technique d'amélioration de ces algorithmes dont l'idée principale est d'exploiter et mimer deux caractéristiques essentielles du système de vision humain. Pour assurer une vision nette de l’objet (qu’il soit fixe ou mobile) puis l'analyser et l'identifier, l'œil ne parcourt pas la scène de façon continue, mais opère par une série de ``balayages'' ou de saccades autour (des points caractéristiques) de l'objet en question. Pour chaque fixation pendant laquelle l'œil reste relativement immobile, l'image est projetée au niveau de la rétine puis interprétée en coordonnées log polaires dont le centre est l'endroit fixé par l'oeil. Les traitements bas-niveau de détection de mouvement doivent donc s'opérer sur cette image transformée qui est centrée pour un point (de vue) particulier de la scène. L'étape suivante (intégration trans-saccadique du Système Visuel Humain (SVH)) consiste ensuite à combiner ces détections de mouvement obtenues pour les différents centres de cette transformée pour fusionner les différentes interprétations visuelles obtenues selon ses différents points de vue.

Les cellules endothéliales peuvent acquérir un phénotype mésenchymateux associé avec l’expression de la protéine nestine dans un modèle d’hypertrophie cardiaque et de fibrose réactive

L’hypertrophie cardiaque représente la réponse primaire du cœur dans le but d’améliorer la fonction cardiaque qui est compromise suite à un accident ischémique ou une surcharge hémodynamique. Cependant, l’hypertrophie cardiaque a pour conséquence pathologique la fibrose réactive, qui est caractérisée par la synthèse incontrôlée et le dépôt du collagène par les myofibroblastes. Ainsi, l’accumulation accrue du collagène dans le cœur hypertrophié mène à l’augmentation de la rigidité cardiaque et la détérioration progressive de la fonction contractile du cœur. Plusieurs études ont démontré que la protéine nestine, appartenant à la famille des filaments intermédiaires, est ré-exprimée dans les myofibroblastes durant la fibrose réparative et est impliquée dans la prolifération cellulaire. Basée sur ces observations, cette étude teste l’hypothèse selon laquelle nestine est induite dans les myofibroblastes suivant le développement de la fibrose réactive dans le cœur des rats ayant subi une constriction aortique supra-rénale. Deux semaines suivant une constriction aortique supra-rénale chez le rat, un patron d’hypertrophie concentrique cardiaque a été observé et associé avec une réponse de fibrose réactive caractérisée par le dépôt accru de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire de nombreux vaisseaux sanguins cardiaques. De plus, les niveaux de la protéine nestine sont augmentés significativement dans les cœurs des rats hypertrophiés, et ce, de façon corrélative avec la pression artérielle moyenne et la pression systolique du ventricule gauche. Les techniques d’immunofluorescences ont révélé une apparition accrue des cellules immunoréactives à nestine, qui présentent un phénotype mésenchymateux caractérisé par la co-expression de collagène dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire des cœurs hypertrophiés. Ces données suggèrent que les fibroblastes résidents peuvent exprimer la protéine nestine ou que l’expression de nestine est induite en réponse aux facteurs pro-fibrotiques impliqués dans la fibrose réactive. En effet, l’exposition des myofibroblastes normaux et des myofibroblastes isolés des cœurs hypertrophiés à l’AII, TGF-B1 et EGF augmente significativement l’expression de la protéine nestine, tandis que l’expression de l’α-SMA demeure inchangée. De plus, de manière prédominante dans le cœur hypertrophié, des cellules non-vasculaires CD31(+) ont été détectées dans le tissu interstitiel et la région péri-vasculaire. Ces cellules co-expriment nestine et collagène suggérant une transition des cellules endothéliales vers un phénotype mésenchymateux. Finalement, la protéine nestine, sous sa forme filamenteuse, a été détectée dans les cellules endothéliales de l’artère coronaire humaine et leur exposition au TGF-B1, induit l’expression de collagène. En revanche, l’expression de collagène a été détectée dans les cellules microvasculaires de rats CD31(+), alors que l’expression de nestine est absente. En réponse aux traitements de TGF-B1 et EGF, l’expression de nestine, sous sa forme non-filamenteuse, est détectée dans les cellules microvasculaires de rats. Collectivement, ces données supportent la prémisse selon laquelle la réponse de fibrose réactive dans les cœurs hypertrophiés, suite à une constriction aortique supra-rénale, est attribuée en partie à l’augmentation de l’apparition des cellules mésenchymateuses positives à l’expression de nestine qui proviennent des fibroblastes résidents du ventricule. De plus, les données in vivo et in vitro suggèrent que les cellules endothéliales déplacées représentent une source additionnelle des cellules mésenchymateuses nestine(+) dans le cœur hypertrophié et contribuent au développement de la fibrose réactive. Cibler la protéine nestine peut représenter une approche thérapeutique afin d’atténuer la réponse de fibrose réactive indépendamment de l’origine des cellules mésenchymateuses.

Effets cellulaires de l’activation de ligases de l’ubiquitine par la protéine lysosomale LITAF

LITAF (lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha factor), une protéine lysosomale, possède deux motifs PPXY capables d’interagir avec les domaines WW d’un sous-groupe spécifique de trois ligases de l’ubiquitine. Ces ligases sont impliquées dans l’ubiquitylation ainsi que la dégradation de diverses protéines cellulaires aux lysosomes et aux protéasomes. Les travaux menés dans le cadre de cette étude visaient à démontrer que LITAF active ces ligases et à déterminer les conséquences de cette activation sur les substrats de ces ligases. Pour y parvenir, des expériences d’ubiquitylation in vivo et in vitro ont été menées en présence de LITAF ainsi que des ligases et des substrats appropriés. L’activation des ligases a été mesurée par leur taux d’autoubiquitylation et celle de leurs substrats par leur taux d’ubiquitylation et de dégradation. Les résultats obtenus montrent que l’activité des ligases est augmentée en présence de LITAF et que l’ubiquitylation et la dégradation des substrats de ces ligases sont partiellement augmentées. LITAF semble donc jouer un rôle de régulateur des ligases de l’ubiquitine. L’importance de ces résultats réside dans le fait que l'expression et la localisation intracellulaire de LITAF sont affectées dans plusieurs pathologies. Nos résultats amènent un éclairage nouveau sur le rôle physiologique de cette protéine et pourraient expliquer en partie comment l'altération de l'expression de LITAF affecte l'équilibre cellulaire.

Étude du rôle des régions variables 4 et 5 dans les changements de conformation de la gp120 du VIH-1

Le VIH infecte les cellules par fusion de sa membrane avec la membrane de la cellule cible. Cette fusion est effectuée par les glycoprotéines de l'enveloppe (Env) qui sont synthétisées en tant que précurseur, gp160, qui est ensuite clivé en gp120 et gp41. La protéine gp41 est la partie transmembranaire du complexe de l'enveloppe et l’ancre à la particule virale alors que la gp120 assure la liaison au récepteur cellulaire CD4 et corécepteur CCR5 ou CXCR4. Ces interactions successives induisent des changements de conformation d’Env qui alimentent le processus d'entrée du virus conduisant finalement à l'insertion du peptide de fusion de la gp41 dans la membrane de la cellule cible. La sous-unité extérieure gp120 contient cinq régions variables (V1 à V5), dont trois (V1, V2 et V3) étant capables d’empêcher l’adoption spontanée de la conformation liée à CD4. Cependant, le rôle de régions variables V4 et V5 vis-à-vis de ces changements de conformation reste inconnu. Pour étudier leur effet, des mutants de l'isolat primaire de clade B YU2, comprenant une délétion de la V5 ou une mutation au niveau de tous les sites potentiels de N-glycosylation de la V4 (PNGS), ont été générés. L'effet des mutations sur la conformation des glycoprotéines d'enveloppe a été analysé par immunoprécipitation et résonance de plasmon de surface avec des anticorps dont la liaison dépend de la conformation adopté par la gp120. Ni le retrait des PNGS de la V4 ni la délétion de V5 n’a affecté les changements conformationnels d’Env tels que mesurés par ces techniques, ce qui suggère que les régions variables V1, V2 et V3 sont les principaux acteurs dans la prévention de l’adoption de la conformation lié de CD4 d’Env.

Multimodal image fusion of anatomical structures for diagnosis, therapy planning and assistance

This paper provides an overview of work done in recent years by our research group to fuse multimodal images of the trunk of patients with Adolescent Idiopathic Scoliosis (AIS) treated at Sainte-Justine University Hospital Center (CHU). We first describe our surface acquisition system and introduce a set of clinical measurements (indices) based on the trunk's external shape, to quantify its degree of asymmetry. We then describe our 3D reconstruction system of the spine and rib cage from biplanar radiographs and present our methodology for multimodal fusion of MRI, X-ray and external surface images of the trunk We finally present a physical model of the human trunk including bone and soft tissue for the simulation of the surgical outcome on the external trunk shape in AIS.

The plant ovule omics : an integrative approach for pollen−pistil interactions and pollen tube guidance studies in solanaceous species

Chez les plantes à fleurs, l’ovaire est l’organe reproducteur femelle et il interagit de façon importante avec les gamètes mâles durant la croissance, le guidage, la réception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamètes. Le processus débute lorsque de nombreux gènes de l’ovule sont activés à longue distance lors de la réception du pollen sur le stigmate. Afin d’explorer les signaux provenant de l’ovule ayant un impact important sur les interactions pollen–pistil, particulièrement les molécules sécrétées impliquées dans la signalisation espècespécifique, l’expression génique des ovules sous forme d’ARNm ainsi et la sécrétion protéique ont été étudiées chez Solanum chacoense, une espèce diploïde de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup d’hybridation interspécifique avec d’autres espèces sympathiques de solanacées, facilitant ainsi grandement l’étude des interactions pollen–ovule de façon espècespécifique ainsi que leur évolution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions différentes ont été comparés: des ovules matures de type sauvage, des ovules légèrement immatures, récoltés deux jours avant l’anthèse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un séquençage d’ARN à haut débit a d’abord été effectué sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de générer un assemblage de référence comprenant 33852 séquences codantes. D’autres séquençages ont été effectués sur les trois conditions d’ovules et sur les feuilles afin de faire une analyse d’expression différentielle des gènes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gènes sont réprimés dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gènes, étaient également sous-exprimés dans les ovules légèrement immatures, suggérant un rôle spécifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de développent FG6 à FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux légèrement immatures ne sont capables d’attirer les tubes polliniques lors d’essais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gènes sont des peptides riches en cystéines (CRPs). En utilisant un transcriptome assemblé de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse d’orthologie a été effectuée sur ces CRPs, révélant une grande variabilité et une évolution rapide chez les solanacées. De nouveaux motifs de cystéine uniques à cette famille ont également été découverts. En comparant avec des études similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulièrement en en ce qui a trait à la catégorisation fonctionnelle des gènes et de la similarité entre les gènes orthologues. De plus,même si la glycosylation n’est pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le maïs, des extraits d’ovules glycosylés de S. chacoense sont capables d’augmenter la capacité de guidage de 18%. Cette étude est donc la première à montrer une corrélation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par l’ovule. En complément à l’approche transcriptomique, une approche protéomique portant sur les protéine sécrétées par l’ovule (le secrétome) a été utilisée afin d’identifier des protéines impliquées dans l’interaction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats d’ovules matures (capables d’attirer le tube pollinique) et d’ovules immatures (incapables d’attirer le tube pollinique) ont été récoltés en utilisant une nouvelle méthode d’extraction par gravité permettant de réduire efficacement les contaminants cytosoliques à moins de 1% de l’échantillon. Un total de 305 protéines sécrétées par les ovules (OSPs) ont été identifiées par spectrométrie de masse, parmi lesquelles 58% étaient spécifiques aux ovules lorsque comparées avec des données de protéines sécrétées par des tissus végétatifs. De plus, la sécrétion de 128 OSPs est augmentée dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protéines sont donc considérées en tant que candidates potentiellement impliquées dans la maturation tardive de l’ovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette étude a également montré que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de sécrétion de 44% du sécrétome total de l’ovule. De façon surprenante, la grande majorité (83%) de ces protéines n’est pas régulée au niveau de l’ARN, soulignant ainsi l’importance de cette approche dans l’étude du guidage du tube pollinique comme complément essentiel aux études transcriptomiques. Parmi tous les signaux sécrétés par l’ovule et reliés au guidage, obtenus à partir des approches transcriptomiques et protéomiques décrites ci-haut, nous avons spécifiquement évalué l’implication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par l’ovule chez S. chacoense, vu l’implication de ce type de protéine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez d’autres espèces. Au total, 28 CRPs étaient présentes dans les ovules capables d’attirer le tube pollinique tout en étant absentes dans les ovules incapables de l’attirer, et ce, soit au niveau de l’ARNm et/ou au niveau du sécrétome. De celles-ci, 17 CRPs ont été exprimées dans un système bactérien et purifiées en quantité suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats d’ovules ont été utilisés avec succès pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprimés dans les bactéries n’ont quant à eux pas été capables d’attirer les tubes polliniques. Comme l’utilisation de systèmes d’expression hétérologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activité des protéines, les candidats restants seront de nouveau exprimés, cette fois dans un système de levure ainsi que dans un système végétal pour produire les peptides sécrétés. Ceux-ci seront ensuite utilisés lors d’essais fonctionnels pour évaluer leur capacité à guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanacées comme S. chacoense.

Rôles de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans l'angiogenèse, la perméabilité vasculaire et la progression tumorale

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale.

Les effets du dalcetrapib, un inhibiteur de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP), sur la structure et la fonction des lipoprotéines de haute densité (HDL) dans l’étude dal-PLAQUE2

Introduction : Le dalcetrapib, inhibiteur de la glycoprotéine hydrophobe de transfert des esters de cholestérol (CETP), a été étudié dans le cadre de l’essai clinique de phase II dal-PLAQUE2 (DP2). L’objectif principal est d’étudier l’effet du dalcetrapib après 1 an de traitement sur la structure et la fonction des HDL dans une sous-population de la cohorte DP2. Méthode : Les sujets de la cohorte DP2 ayant une série de mesures de cIMT et des échantillons de plasma et sérum au baseline et à 1 an de traitement furent sélectionnés (379 sujets: 193 du groupe placebo (PCB) et 186 du groupe dalcetrapib (DAL)). Des données biochimiques prédéterminées, le profil des concentrations et tailles des sous-classes de HDL et LDL en résonance magnétique nucléaire (RMN) et 2 mesures de capacité d’efflux de cholestérol (CEC) du sérum ont été explorées. Les données statistiques furent obtenues en comparant les changements à un an à partir du « baseline » avec un ANOVA ou ANCOVA. La procédure normalisée de fonctionnement d’essai d’efflux de cholestérol permet de calculer l’efflux fractionnel (en %) de 3H-cholestérol des lignées cellulaires BHK-ABCA1 (fibroblastes) et J774 (macrophages, voie ABCA1) et HepG2 (hépatocytes, voie SR-BI), vers les échantillons sériques de la cohorte DP2. Résultats : Pour la biochimie plasmatique, un effet combiné des changements d’activité de CETP dans les 2 groupes a causé une réduction de 30% dans le groupe DAL. Après 1 an de traitement dans le groupe DAL, la valeur de HDL-C a augmenté de 35,5% (p < 0,001) et l’apoA-I a augmenté de 14,0% (p < 0,001). Au profil RMN, dans le groupe DAL après 1 an de traitement, il y a augmentation de la taille des HDL-P (5,2%; p < 0,001), des grosses particules HDL (68,7%; p < 0,001) et des grosses particules LDL (37,5%; p < 0,01). Les petites particules HDL sont diminuées (-9,1%; p < 0,001). Il n’y a aucune différence significative de mesure de cIMT entre les deux groupes après 1 an de traitement. Pour la CEC, il y a augmentation significative par la voie du SR-BI et une augmentation via la voie ABCA1 dans le groupe DAL après 1 an de traitement. Conclusion : Après un an de traitement au dalcetrapib, on note une hausse de HDL-C, des résultats plutôt neutres au niveau du profil lipidique par RMN et une CEC augmentée mais trop faible pour affecter la valeur de cIMT chez les échantillons testés.