Développement d’une méthode d’estimation du contenu en glutamine des aliments

Cette étude vise à estimer l’apport en glutamine (Gln) alimentaire chez des athlètes soumis à un protocole de supplémentation en glutamine ainsi qu’à clarifier les informations diffusées au grand public en ce qui concerne les sources alimentaires de glutamine. Des études cliniques ont démontré que la supplémentation en glutamine pouvait réduire la morbidité et la mortalité chez des sujets en phase critique (grands brulés, chirurgie…). Le mécanisme en cause semble impliquer le système immunitaire. Cependant, les études chez les sportifs, dont le système immunitaire a de fortes chances d’être affaibli lors de périodes d’entraînement prolongées impliquant des efforts longs et intenses, n’ont pas été concluantes. Or, ces études négligent systématiquement l’apport alimentaire en glutamine, si bien qu’il est probable que les résultats contradictoires observés puissent en partie être expliqués par les choix alimentaires des sujets. Puisque la méthode conventionnelle de dosage des acides aminés dans les protéines alimentaires transforme la glutamine en glutamate, les tables de composition des aliments présentent la glutamine et le glutamate ensemble sous la dénomination « glutamate » ou « Glu », ce qui a comme conséquence de créer de l’ambiguïté. La dénomination « Glx » devrait être utilisée. Partant de la probabilité qu’un apport en Glx élevé soit un bon indicateur de l’apport en glutamine, nous avons créé un calculateur de Glx et avons évalué l’alimentation de 12 athlètes faisant partie d’une étude de supplémentation en glutamine. Nous avons alors constaté que l’apport en Glx était directement proportionnel à l’apport en protéines, avec 20,64 % ± 1,13 % de l’apport protéique sous forme de Glx. Grâce à quelques données sur la séquence primaire des acides aminés, nous avons pu constater que le rapport Gln/Glx pouvait être très variable d’un type de protéine à l’autre. Alors que le ratio molaire Gln/Glx est de ~95 % pour les α et β-gliadines, il n’est que de ~43 % pour la caséine, de ~36 % pour la β-lactoglobuline, de ~31 % pour l’ovalbumine et de ~28 % pour l’actine. Il est donc possible que certaines protéines puissent présenter des avantages par rapport à d’autres, à quantité égale de Glx.

Regulation of the memory T cell development and islet beta-cell survival by DAPK-related apoptosis-inducing protein kinase 2 (Drak2)

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète.

Étude du polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline chez des espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules en vue de développer des marqueurs moléculaires

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), classés dans le phylum Glomeromycota, ne peuvent pas être facilement identifiés par la morphologie de leurs spores et leurs mycélia à l'intérieur ou à l'extérieur des racines de leurs hôtes. Ce problème fondamental d'identification rend l'étude de leur diversité, en particulier dans leur habitat naturel (sol et racine) extrêmement difficile. Les gènes ribosomaux ont été largement utilisés pour développer des amorces spécifiques et en inférer des arbres phylogénétiques. Cependant, ces gènes sont très polymorphes et existent en plusieurs copies dans le génome des CMA, ce qui complique l’interprétation des résultats. Dans notre étude, nous avons étudié le polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline, présent en faible nombre de copies dans le génome des CMA, afin d’obtenir de nouvelles séquences nucléotidiques pour développer des marqueurs moléculaires. Les gènes β-tubuline amplifiés à partir de l'ADN génomique de cinq espèces du genre Glomus ont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences indique un polymorphisme intraspécifique chez trois espèces de CMA. Deux séquences paralogues très variables ont été nouvellement identifiées chez les G. aggregatum, G. fasciculatum et G. cerebriforme. Aucun polymorphisme n’a été détecté chez les G. clarum et G. etunicatum. Toutes les séquences montrent la présence de deux introns hautement variables. La majorité des substitutions ont été localisées dans les exons et sont synonymes à 90%. La conservation des acides aminés suggère un niveau élevé de sélection négative sur le gène β-tubuline et nous permet de confirmer que les CMA représentent un ancien groupe fongique (400 million d’années). L’analyse phylogénétique, réalisée avec vingt et une séquences nucléotidiques du gène β-tubuline, a révélé que les séquences des Glomaceae forment un groupe monophylétique bien supporté, avec les Acaulosporaceae et Gigasporaceae comme groupe frère. Les séquences paralogues nouvellement identifiées chez les G. aggregatum et G. fasciculatum n'ont pas été monophylétiques au sein de chaque espèce. Les oligonucléotides ont été choisis sur la base des régions variables et conservées du gène β-tubuline. Le test PCR des amorces β-Tub.cerb.F/ β-Tub.cerb.R a révélé des bandes spécifiques de 401 pb pour les séquences paralogues du G. cerebriforme. Deux paires d’amorces ont été développées afin d’identifier les séquences du groupe nommé Tub.1. Les tests PCR nous ont permis d’identifier certaines séquences du groupe Tub.1. Une paire d’amorce β-Tub.2.F/ β-Tub.2.R nous a permis d’identifier certaines séquences paralogues du groupe nommé Tub.2. L’analyse d’autres gènes combinée à celle du gène β-tubuline permettra le développement de marqueurs moléculaires plus spécifiques pour l’identification de CMA.

Évaluation gastro-intestinale chez des chiens présentant un comportement de léchage excessif de surface

L’objectif de cette étude était de démontrer que le léchage excessif de surface (LES) chez le chien représente un signe clinique d’un trouble digestif sous-jacent plutôt qu’un trouble obsessionnel compulsif. Vingt chiens présentés pour LES (groupe L) ont été divisés en 2 sous-groupes de 10 chiens chacun : L0, sans, et LD, avec des signes cliniques digestifs concomitants. Dix chiens en santé ont été assignés à un groupe contrôle (groupe C). Une évaluation comportementale complète, un examen physique et neurologique ont été réalisés avant un bilan diagnostic gastro-intestinal (GI) complet (hématologie, biochimie, analyse urinaire, mesure des acides biliaires pré et post-prandiaux et de l’immunoréactivité spécifique de la lipase pancréatique canine, flottaison fécale au sulfate de zinc, culture de selles, échographie abdominale et endoscopie GI haute avec prise de biopsies). En fonction des résultats, un interniste recommandait un traitement approprié. Les chiens étaient suivis pendant 90 jours durant lesquels le comportement de léchage était enregistré. Des troubles GI ont été identifiés chez 14/20 chiens du groupe L. Ces troubles GI sous-jacents incluaient une infiltration éosinophilique du tractus GI, une infiltration lymphoplasmocytaire du tractus GI, un retard de vidange gastrique, un syndrome du côlon irritable, une pancréatite chronique, un corps étranger gastrique et une giardiose. Une amélioration >50% en fréquence ou en durée par rapport au comportement de léchage initial a été observée chez une majorité de chiens (56%). La moitié des chiens ont complètement cessé le LES. En dehors du LES, il n’y avait pas de différence significative de comportement (p.ex. anxiété), entre les chiens L et les chiens C. Les troubles GI doivent être considérés dans le diagnostic différentiel du LES chez le chien.

Régulation de protéine C-réactive vasculaire dans le diabète de type 2

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans les pays occidentaux et représentent une complication majeure du syndrome métabolique. Il est maintenant largement admis que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et que l’inflammation joue un rôle pathogénique majeur dans l’initiation et la progression de la maladie athéromateuse. Il a été démontré qu’une augmentation des niveaux sériques de la protéine c-réactive (CRP), une protéine de la phase aigüe et un important constituant de la réponse immunitaire de type inné, est associée à un risque cardiovasculaire accru. Ainsi, il a été documenté qu’une augmentation de CRP, tant chez les sujets sains que chez les sujets diabétiques, était associée à une augmentation du risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. De multiples évidences suggèrent que la CRP puisse non seulement constituer un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires mais aussi représenter un facteur pro-athérogénique direct. La dysfonction endothéliale représente un des stades les plus précoces du processus athérosclérotique et un rôle de la CRP dans la pathogenèse de la dysfonction endothéliale est postulé. Outre son origine systémique, la CRP est produite dans la lésion athérosclérotique et par diverses cellules vasculaires, dont les cellules endothéliales. Afin d’élucider le rôle de la CRP vasculaire dans l’altération de la fonction endothéliale associée au syndrome métabolique, nous avons étudié la régulation de l’expression endothéliale de la CRP par les acides gras libres (AGL) et le rôle de la CRP endothéliale dans l’inhibition de la synthèse d’oxyde nitrique (NO) par les AGL. Nos résultats démontrent que :1) l’acide palmitique (PA) induit l’expression génique de CRP au niveau de cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) en culture et, augmente, de manière dose-dépendante, l’expression protéique de la CRP; 2) La pré-incubation des HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la i) protéine kinase C (PKC), ii) du facteur nucléaire-kappa B, iii) des Janus kinases et des protéines de transduction et de régulation de la transcription et iv) des protéines kinases activées par les mitogènes prévient l’effet stimulant du PA sur l’expression protéique et génique de la CRP; 3) Le traitement des HAECs par le PA induit une augmentation de la production des espèces réactives oxygénées, un effet prévenu par les inhibiteurs de la PKC et par l’AICAR(5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), un activateur de la protéine kinase activée par l’AMP; 4) L’incubation des HAECs en présence de PA résulte enfin en une diminution de la production basale endothéliale de NO, un effet abrogé par la préincubation de ces cellules avec un anticorps anti-CRP. Dans l’ensemble, ces données démontrent un effet stimulant du PA sur l’expression de la CRP endothéliale via l’activation de kinases et de facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif. Ils suggèrent en outre un rôle de la CRP dans la dysfonction endothéliale induite par les AGL.

Étude structurale du mode de liaison des protéines Whirly de plantes à l’ADN monocaténaire

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus.

Nutrition parentérale du nouveau-né : modulation du stress oxydant et conséquences hépatiques

Introduction : Les enfants prématurés ont la particularité de naître alors que leur développement est souvent incomplet et nécessite la mise en œuvre de soins intensifs visant à poursuivre leur croissance en dehors de l’environnement utérin. Souvent cependant, le stade développemental de l’enfant ne lui permet pas d’assimiler une alimentation entérale du fait de l’immaturité de son système digestif. Le recours à une voie centrale délivrant les nutriments assurant le développement devient alors une nécessité. Ce type de nutrition, appelée nutrition parentérale (NP, ou total parenteral nutrition TPN), permet l’administration de molécules simples, directement dans le sang du prématuré. Il n’est toutefois pas exempt de risques puisqu’exposée à la lumière, la NP peut s’oxyder et générer des molécules oxydantes telles que des hydroperoxydes lipidiques susceptibles de se fragmenter par la suite en hydroxy-alkénals. Ceci devient problématique au vu de l’immaturité des systèmes de défenses antioxydants du nouveau-né prématuré. L’utilisation prolongée de la NP est d’ailleurs à l’origine de maladie hépatiques dans lesquelles le stress oxydant et la nécro-inflammation sont des composantes majeures. Nous avons émis l’hypothèse que l’infusion chez les enfants prématurés, d’aldéhydes d’origine lipidique est en relation avec le développement du stress oxydant et de l’inflammation hépatique. Objectif : Notre étude a consisté à évaluer la relation entre les quantités d’hydroxy-alkénals dans la NP et les effets hépatiques engendrés sur les marqueurs de stress oxydant et les voies de signalisation responsables d’une induction de processus inflammatoire. Dans ce but, nous avons cherché à mesurer la peroxydation lipidique dans l’émulsion lipidique de la NP et la conséquence de l’infusion en continue d’hydroxy-alkénals sur les marqueurs de stress oxydant, sur la voie de signalisation médiée par le Nuclear Factor κB et sur le déclenchement du processus inflammatoire hépatique. A la suite de ce travail, nous avons également travaillé sur des alternatives à la photoprotection, qui est la seule méthode réellement optimale pour réduire la peroxydation des lipides de la NP, mais cliniquement difficilement praticable. Résultats : Nos résultats ont mis en évidence la génération de 4-hydroxynonenal in vitro dans la NP, ce phénomène est augmenté par une exposition lumineuse. Dans ce cadre, nous avons montré l’inefficacité de l’ajout de multivitamines dans l’émulsion lipidique comme alternative à la photoprotection. Dans la validation biologique qui a suivi sur un modèle animal, nos résultats ont permis de démontrer que l’augmentation des adduits glutathion-hydroxynonenal était imputable à l’augmentation de 4-hydroxynonenal (4-HNE) dans la NP, et non à une peroxydation endogène. Nos données indiquent que la probable augmentation hépatique des niveaux de 4-HNE a conduit à une activation du NFκB responsable de l’activation de la transcription des gènes pro-inflammatoires du Tumour Necrosis Factor-α (TNF-α) et de l’interleukine-1 (IL-1). Nous avons alors évalué la capacité d’une émulsion lipidique enrichie en acides gras polyinsaturés (AGPI) n-3 à baisser les concentrations de 4-HNE dans la NP, mais également à moduler le stress oxydant et les marqueurs pro-inflammatoires. Enfin, nous avons démontré, en collaboration avec l’équipe du Dr Friel, que certains peptides isolés du lait humain (par un processus mimant la digestion) permettent également une modulation du stress oxydant et du processus inflammatoire. Conclusion : Le stress oxydant exogène issu de la NP a conduit par activation de facteurs de transcription intra-hépatiques au déclenchement d’un processus inflammatoire potentiellement responsable du développement de maladies hépatiques reliées à la NP telle que la cholestase. Dans ce sens, les AGPI n-3 et les peptides antioxydants peuvent se poser en tant qu’alternatives crédibles à la photoprotection.

Les lipides et les cancers urologiques - approches épidémiologiques. L’importance du temps immortel

Objectif: Définir l’effet des lipides et du traitement de la dyslipidémie sur les cancers de la prostate et de la vessie en utilisant différents devis d’étude et en tenant compte de la présence de plusieurs biais, particulièrement le biais du temps immortel. Devis: Le premier volet utilise un devis rétrospectif de type cas témoins. Un questionnaire semi-quantitatif de fréquence de consommation alimentaire validé a été utilisé. Le génotype COX2 de neuf polymorphisme nucléotidique unique (SNP) a été mesuré avec une plateforme Taqman. Des modèles de régression logistique non conditionnelle ont été utilisés pour comparer le risque de diagnostic d’un cancer de la prostate et l’interaction. Le deuxième volet utilise un devis rétrospectif de type cohorte basée sur les données administratives de la Régie de l’assurance-maladie du Québec (RAMQ). Des modèles de régression de Cox ont été employés pour mesurer l’association entre les statines et l’évolution du cancer de la vessie. Le troisième volet, porte un regard méthodologique sur le biais du temps immortel en examinant sa présence dans la littérature oncologique. Son importance est illustrée avec les données de la cohorte du deuxième volet, et les méthodes de correction possibles son appliquées. Résultats: L’étude du premier volet démontre qu’une diète riche en acides gras oméga-3 d’origine marine était fortement associée à un risque diminué de cancer de la prostate agressif (p<0.0001 pour la tendance). Le ratio de cote pour le cancer de la prostate du quartile supérieur d’oméga-3 était de 0.37 (IC 95% = 0.25 à 0.54). L’effet diététique était modifié par le génotype COX-2 SNP rs4648310 (p=0.002 pour l’interaction). En particulier, les hommes avec faible apport en oméga-3 et la variante rs4648310 avait un risque accru de cancer de la prostate (ratio de cote = 5.49, IC 95%=1.80 à 16.7), effet renversé par un apport en oméga-3 plus grand. L’étude du deuxième volet a observé que l’utilisation de statines est associée à une diminution du risque de progression du cancer de la vessie (risque relatif = 0.44, IC 95% = 0.20 à 0.96, p=0.039). Cette association était encore plus forte pour le décès de toute cause (HR = 0.57, 95% CI = 0.43 to 0.76, p=0.0001). L’effet des statines semble être dose-dépendant. L’étude du troisième volet démontre que le biais du temps immortel est fréquent et important dans les études épidémiologiques oncologiques. Il comporte plusieurs aspects dont certains sont mieux prévenus au stade du choix du devis d’étude et différentes méthodes statistiques permettent un contrôle de ce biais. Conclusion: 1) Une diète riche en oméga-3 aurait un effet protecteur pour le cancer de la prostate. 2) L’utilisation de statines aurait un effet protecteur sur la progression du cancer non invasif de la vessie. Les lipides semblent avoir un effet sur les cancers urologiques.

Riboswitches : le cas des atténuateurs de la transcription du type terminateur/antiterminateur chez les bactéries

Il est essentiel pour chaque organisme d’avoir la possibilité de réguler ses fonctions afin de permettre sa survie et d’améliorer sa capacité de se reproduire en divers habitats. Avec l’information disponible, il semble que les organismes consacrent une partie assez importante de leur matériel génétique à des fonctions de régulation. On peut envisager que certains mécanismes de régulation ont persisté dans le temps parce qu’ils remplissent bien leurs rôles. Les premières études sur les procaryotes ont indiqué qu’il y avait peu de mécanismes de régulation exerçant le contrôle des gènes, mais il a été démontré par la suite qu’une variété de ces mécanismes est utilisée pour la régulation de gènes et d’opérons. En particulier, les opérons bactériens impliqués dans la biosynthèse des acides aminés, l’ARNt synthétase, la dégradation des acides aminés, les protéines ribosomales et l’ARN ribosomal font l’objet d’un contrôle par l’atténuation de la transcription. Ce mécanisme d’atténuation de la transcription diffère d’autres mécanismes pour la génération de deux structures différentes de l’ARNm, où l’une de ces structures réprime le gène en aval, et l’autre permet de continuer la transcription/traduction. Dans le cadre de cette recherche, nous nous sommes intéressé au mécanisme d’atténuation de la transcription chez les procaryotes où aucune molécule ne semble intervenir comme facteur de régulation, en me concentrant sur la régulation des opérons bactériens. Le but principal de ce travail est de présenter une nouvelle méthode de recherche des riborégulateurs qui combine la recherche traditionnelle des riborégulateurs avec la recherche structurale. En incorporant l’étude du repliement de l’ARNm, nous pouvons mieux identifier les atténuateurs répondant à ce type de mécanisme d’atténuation. Ce mémoire est divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre présente une revue de la littérature sur l’ARN et un survol sur les mécanismes de régulation de l’expression génétique chez les procaryotes. Les chapitres 2 et 3 sont consacrés à la méthodologie utilisée dans cette recherche et à l’implémentation du logiciel TA-Search. Enfin, le chapitre 4 expose les conclusions et les applications potentielles de la méthode.

Monoacylglycerol as a metabolic coupling factor in glucose-stimulated insulin secretion

Les cellules beta pancréatiques sécrètent l’insuline lors d’une augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrôlé par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. D’autres sources d’énergie, comme les acides aminés (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la sécrétion d’insuline. Une sécrétion d’insuline insuffisante au besoin du corps déclanche le diabète. Le rôle que joue l’augmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la sécrétion d’insuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycérolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont été reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline. Le diacylglycérol, provenant de la lipolyse, a été proposé comme un signal lipidique important d’amplification. Cependant, l’hydrolyse des triglycérides et des diacylglycérides a été démontrée essentielle pour la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, en suggérant un rôle du monoacylglycérol (MAG) dans ce processus. Dans cette étude, on démontre que la réduction de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, lors d’une inhibition de la lipolyse, est restaurée par l’addition de MAG. Dans les cellules beta pancréatiques, le niveau de MAG augmente en présence des concentrations élevées du glucose, et également lorsqu’on inhibe l’enzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec l’inhibiteur spécifique WWL70. L’analyse lipidomique a démontré qu’après la stimulation des cellules beta pancréatiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, l’espèce la plus accumulée de MAG était le 1-stearoylglycérol (1-SG). L’addition de 1-SG, de 1-palmitoylglycérol (1-PG) ou de WWL70 augmente la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et cette augmentation est indépendante de la génération de acides gras à partir de MAG. Cela suggère que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. De plus, la surexpression du gène d’ABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une réduction de la sécrétion d’insuline, due probablement à la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le MAG, on a bloqué l’action du récepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par l’agent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancréatique par AMG9810 entraîne une diminution de la potentialisation de la sécrétion de l’insuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entraînerai l’entrée du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de l’exocytose des granules à insuline. En soutien de cette hypothèse, on a trouvé une diminution du calcium intracellulaire lorsqu’on traite au AMG9810 des cellules beta pancréatique de rat (provenant des îlots dispersés) stimulées au glucose et au WWL70. L’ensemble des résultats suggère que le MAG est un médiateur de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Vu que l’inhibition pharmacologique d’ABHD6 augmente la sécrétion d’insuline, on pourra conclure que cette enzyme représente une cible thérapeutique potentielle dans le développement des médicaments anti-diabétiques, visant une augmentation de la sécrétion d’insuline.

Le rôle de la dysrégulation du métabolisme du cholestérol par le retrait des estrogènes sur la stéatose hépatique

Les estrogènes confèrent aux femmes une protection cardiovasculaire jusqu’à la ménopause. En effet, la perte des fonctions ovariennes engendre plusieurs désordres du profil lipidique qui s’accompagnent d’une accumulation de triglycérides au foie appelée stéatose hépatique. Le retrait des estrogènes perturbe de nombreuses voies de contrôle de la cholestérolémie, provoquant simultanément une hypercholestérolémie et une stéatose hépatiques. Toutefois, à ce jour, les mécanismes d’action du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol favorisant le stockage de triglycérides au foie demeurent imprécis. À cet égard, les travaux de cette thèse visaient à clarifier l’ensemble des effets du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol pouvant mener à la pathogenèse de la stéatose hépatique. Lors de la première étude, l’ovariectomie (Ovx) chez la rate, un modèle bien établi de la stéatose, avait permis d’identifier la voie d’assemblage des lipoprotéines à très faible densité (VLDL) comme élément contributif à la stéatose. La voie des VLDL reliant étant également une voie de transport du cholestérol, l’étude suivante a été réalisée afin de comprendre le rôle du cholestérol alimentaire sur les lipides hépatiques. Dans cette deuxième étude, le modèle de la diète riche en lipides et en cholestérol (HFHC), aussi reconnu pour induire une stéatose hépatique, a permis d’établir des liens étroits entre le métabolisme du cholestérol et celui des lipides hépatiques. Étonnamment, de manière similaire à l’Ovx, la diète HFHC perturbait la voie d’assemblage des VLDL. En outre, les données recueillies au cours de ces travaux indiquaient qu’une dysrégulation du métabolisme des acides biliaires avait contribué à la sévérité de la stéatose hépatique induite par cette diète HFHC. Dans la continuité de ces deux premiers projets, nous nous sommes intéressés aux effets concomitants du retrait des estrogènes et d’une diète HFHC sur la stéatose hépatique. De manière intéressante, lorsque combinés, l’Ovx et la diète HFHC potentialisaient non seulement l’accumulation de lipides hépatiques, mais également les perturbations moléculaires des voies sous-jacentes à la stéatose, dont l’assemblage des VLDL et de la sécrétion d’acides biliaires. Dans l’ensemble, les données présentées dans la revue de littérature et dans les trois études reliées à cette thèse indiquent qu’une dysrégulation du métabolisme du cholestérol en réponse au retrait des estrogènes entraîne des complications favorisant l’accumulation de lipides dans le foie.

Régulation de la fonction vasculaire pendant le vieillissement : rôles de l’environnement post-natal et du gène suppresseur de tumeurs p53

La dysfonction endothéliale vasculaire constitue un marqueur précoce des maladies cardiovasculaires car l’endothélium est l’une des premières cibles des facteurs de risque cardiovasculaire. La présence d'un stress chronique engendré par les facteurs de risque cardiovasculaire sollicite les mécanismes de défense endogènes, tels que les enzymes antioxydantes, qui servent au maintien de la fonction endothéliale. L’environnement vasculaire auquel l’endothélium est exposé a un effet direct sur son fonctionnement à long terme. Certaines habitudes de vie sont ainsi associées à une bonne santé cardiovasculaire. Par exemple, la diète méditerranéenne et/ou la pratique régulière de l’exercice physique aident à maintenir une fonction endothéliale adéquate et à réduire l’incidence des maladies cardiovasculaires. D'autre part, certains gènes clés, comme le gène suppresseur de tumeurs p53, régulent plusieurs voies métaboliques importantes pour préserver l’intégrité des cellules endothéliales. Nous posons l’hypothèse que l’environnement vasculaire post-natal influence la mise en place de mécanismes de défenses endogènes tels que les enzymes antioxydantes afin de faire face à des stress plus tard dans la vie. Notre objectif global était d’évaluer les impacts d’interventions post-natales bénéfiques et d’une diminution endogène du gène suppresseur de tumeurs p53, sur la fonction endothéliale vasculaire et sur sa capacité à faire face à un stress métabolique. Dans une première étude, nous avons soumis des souris saines C57Bl/6 dès leur sevrage et jusqu’à l’âge de 9 mois, à un programme d’exercice physique volontaire (course dans une roue) ou à un antioxydant (catéchine), comparé à un groupe de souris sédentaires et sans antioxydant. Puis les interventions ont été stoppées et une diète riche en gras a été introduite, ou non, pour une période de 3 mois; les souris ont été sacrifiées à l'âge de 9 ou 12 mois. Nous avons observé que l’exercice a protégé les cellules endothéliales des effets délétères induits par la diète riche en gras en préservant la fonction endothéliale par le maintien d’un profil rédox sain et en évitant la hausse de l’inflammation. La catéchine a maintenu la fonction endothéliale aortique, mais n’a pas prévenu le profil inflammatoire en présence de la diète riche en gras. Finalement, chez les souris sédentaires, la fonction endothéliale a été détériorée en présence de la diète riche en gras, sans indice d’inflammation vasculaire. Dans une seconde étude, des souris partiellement déficientes en p53 (p53+/-) et contrôles C57Bl/6 ont été exposées à la même diète riche en gras à partir de 3 mois et ce jusqu’à l’âge de 6 mois. Notre raisonnement était basé sur la démonstration que p53 est un régulateur de l’expression des enzymes antioxydantes in vitro. Chez les souris p53+/-, les cellules endothéliales ont été protégées du stress induit par l’hypercholestérolémie engendrée par la diète riche en gras. Cependant, chez les souris p53+/- cette protection pourrait être secondaire à un métabolisme accru des acides biliaires, qui en prévenant la hausse de cholestérol, protègerait indirectement l'endothélium. Nous avons donc pu démontrer l’importance de l’environnement vasculaire sur la fonction endothéliale. La diète riche en gras a stimulé certains mécanismes de défense vasculaires tels que la voie des EDHF et la superoxyde dismutase afin de maintenir la fonction endothéliale malgré les conditions pro-athérosclérotiques. Nous avons observé que l’exercice et la catéchine influencent différemment l’endothélium malgré leurs capacités antioxydantes. Ces études soulignent la sensibilité de l’endothélium aux changements dans l’environnement vasculaire. En accord avec le vieillissement de la population et la progression des maladies cardiovasculaires, la proportion de personnes ayant une dysfonction endothéliale augmente. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes ou d’interventions qui permettent le maintien de la fonction endothéliale à long terme s’avère utile.

Rôle de l’enzyme PAS kinase dans la régulation du facteur de transcription PDX-1 dans la cellule bêta pancréatique.

Le diabète de type 2 (DT2) se caractérise par une production insuffisante d'insuline par le pancréas ainsi qu'une résistance des tissus périphériques à l'action de l'insuline. Dans les cellules bêta pancréatiques, le glucose stimule la production de l'insuline en induisant la transcription de son gène et la traduction ainsi que la sécrétion de sa protéine. Paradoxalement, une exposition prolongée et simultanée de ces cellules à de hautes concentrations de glucose en présence d'acides gras conduit à la détérioration de la fonction bêta pancréatique et au développement du DT2. Toutefois, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets du glucose ne sont que partiellement connus. L'objectif du travail décrit dans cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de la régulation de la transcription du gène de l'insuline. PDX-1 (de l’anglais pour pancreatic and duodenal homeobox 1) est un facteur de transcription majeur et essentiel tant pour le développement du pancréas que pour le maintien de sa fonction à l'état adulte. En réponse au glucose, PDX-1 se lie au promoteur du gène de l'insuline et induit sa transcription. Ceci est inhibé par l'acide gras palmitate. Dans la première partie des travaux effectués dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié deux mécanismes de régulation de la transcription du gène de l'insuline: le premier via ERK1/2 (de l'anglais pour extracellular-signal-regulated protein kinases 1 and 2) et le second par l’enzyme PASK (pour per-arnt-sim kinase). Nous avons également mis en évidence l'existence d'un troisième mécanisme impliquant l'inhibition de l'expression du facteur de transcription MafA par le palmitate. Nos travaux indiquent que la contribution de la signalisation via PASK est majeure. L'expression de PASK est augmentée par le glucose et inhibée par le palmitate. Sa surexpression dans les cellules MIN6 et les îlots isolés de rats, mime les effets du glucose sur l'expression du gène de l'insuline ainsi que sur l'expression de PDX-1 et prévient les effets délétères du palmitate. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel PASK augmente la stabilité protéique de PDX-1, soit via la phosphorylation et l'inactivation de la protéine kinase GSK3 bêta (de l'anglais pour glycogen synthase kinase 3 beta). Le glucose induit la translocation de PDX-1 du cytoplasme vers le noyau, ce qui est essentiel à sa liaison au promoteur de ses gènes cibles. L'exclusion nucléaire de PDX-1 a été observée dans plusieurs modèles ex vivo et in vivo de dysfonction de la cellule bêta pancréatique. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons démontré l'importance de l'utilisation de cellules primaires (îlots isolés et dispersés) pour étudier la translocation nucléaire de PDX-1 endogène étant donné que ce mode de régulation est absent dans les lignées insulino-sécrétrices MIN6 et HIT-T15. Ces études nous ont permis d'identifier et de mieux comprendre les mécanismes régulant la transcription du gène de l'insuline via le facteur de transcription PDX-1. Les cibles moléculaires ainsi identifiées pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. Mots-clés : Diabète, îlots de Langerhans, cellule bêta pancréatique, gène de l'insuline, PDX-1, PASK, GSK3 bêta, ERK1/2, PKB, glucose, palmitate.

Lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) in acute coronary syndrome

La phospholipase A2 liée aux lipoprotéines (Lp-PLA2) est une biomarqueur de plusieurs maladies inflammatoires et une niveau sérique élevé est associé à l’instabilité de la plaque artérioscléreuse. Comme son nom l’indique, la Lp-PLA2 est liée aux lipoprotéines plasmatiques (LDL et HDL) et son rôle est de prévenir l’accumulation de phospholipides oxidés a la surface des lipoprotéines. Toutefois, les produits de dégradation des phospholipides oxidés par la Lp-PLA2 - le lysophosphatidyl choline par les acides gras oxidés peuvent aussi promouvoir l’inflammation. Mieux comprendre le métabolisme de la Lp-PLA2 pourrait nous permettre de mieux apprécier son rôle dans la formation d’une plaque artérioscléreuse instable, car des études antérieures ont démontré une forte expression de la Lp-PLA2 dans la plaque. De plus, il existe une forte corrélation entre les niveaux et l’activité plasmatiques de la Lp-PLA2 et la maladie coronarienne, les accidents cérébraux-vasculaires et la mortalité cardiaque. L’inhibition de la Lp-PLA2 avec une petite molécule, le darapladib, n’a pas démontré de bénéfice sur les évènements cardiovasculaires dans deux études cliniques. Cette thèse présentera d’abord une revue de la littérature sur la Lp-PLA2 et les maladies cardiovasculaires et les deuxième et troisième chapitres, une étude clinique réalisée sur des patients avec un syndrome coronarien aigu.

Étude de l'impact de deux traitements, dont un sans antibiotiques, sur la santé digestive et les populations de Clostridium perfringens dans des élevages de poulets de chair.

Le problème grandissant de l’antibiorésistance remet en question plusieurs pratiques reliées à l’utilisation des antibiotiques, dont l’usage à grande échelle pour des fins de promotion de la croissance chez les animaux de consommation. Depuis 2006, le retrait des antibiotiques dans les élevages de poulets de chair en Europe a été associé à la résurgence d’entérite nécrotique, une maladie intestinale causée par la bactérie Clostridium perfringens. Alors que la pathogénie de la maladie semblait bien comprise, le retrait des antibiotiques a montré que peu de solutions de remplacement sont disponibles afin de prévenir cette maladie. Très peu d’études se sont intéressées à mieux caractériser la dynamique des populations de C. perfringens dans les élevages avicoles et l’effet que pouvait avoir le retrait des antibiotiques sur l’évolution de ces populations. La présente étude a évalué l’impact du remplacement des antibiotiques promoteurs de croissance et des anticoccidiens pendant une période de 14 mois, dans huit élevages commerciaux de poulets de chair au Québec. Un protocole d’élevage alternatif, combinant des stratégies telles que des produits à base d’huiles essentielles, des acides organiques et inorganique, une vaccination contre la coccidiose ainsi qu’une amélioration des conditions de démarrage des poussins, a été utilisé en remplacement des antimicrobiens. Les performances zootechniques, la santé digestive ainsi que l’occurrence d’entérite nécrotique pour les lots de poulets soumis au protocole d’élevage alternatif ont été comparées avec celles de lots de poulets de chair recevant une ration conventionnelle. Des analyses moléculaires basées sur la PCR et le PFGE ont été utilisées afin de documenter l’impact de la mise en place du protocole d’élevage alternatif sur les populations de C. perfringens. Les résultats obtenus montrent qu’aucune différence entre les groupes soumis aux deux types de protocoles n'est observée en ce qui a trait à la viabilité en élevage, à l'âge d'abattage et aux taux de condamnations à l'abattoir. Toutefois, les lots soumis au traitement alternatif ont eu des performances moindres pour le poids moyen à l'abattage, le gain moyen quotidien et la conversion alimentaire. Un peu plus de 27% des lots soumis au protocole alternatif ont connu un épisode d’entérite nécrotique clinique. Les analyses ont aussi montré que l’un ou l’autre des protocoles ne semble pas exercer d’influence particulière sur la dynamique temporelle des populations de C. perfringens. Pour les lots soumis au protocole d’élevage alternatif, une forte diversité génétique pour C. perfringens a été liée à un risque augmenté de vivre un épisode d’entérite nécrotique. À l’opposé, les lots alternatifs ayant vécu des épisodes récurrents de la maladie ont montré une diminution significative de la diversité génétique, ainsi qu’une augmentation marquée du nombre de souches de C. perfringens transportant plusieurs gènes de virulence. La présente étude a permis de mieux documenter, d’un point de vue économique et scientifique, la production de poulets de chair élevés sans antibiotiques ni anticoccidiens au Québec. Cette étude est la seule du genre s’étant intéressée à la caractérisation et à la comparaison dans le temps des flores de C. perfringens retrouvées dans les deux types d’élevages. Elle a révélé que la production à grande échelle de poulets de chair élevés sans antibiotiques ni anticoccidiens est possible au Québec, mais que celle-ci présente des impacts sur les performances zootechniques des oiseaux, sur leur santé digestive et sur la dynamique des populations de C. perfringens. Mots-clés : poulets de chair, antibiotiques, huiles essentielles, acides organiques, vaccination coccidiose, performances zootechniques, santé digestive, entérite nécrotique, Clostridium perfringens, dynamique populationnelle