790 resultados para signalisation cellulaire
Resumo:
Les nanotechnologies appliques aux sciences pharmaceutiques ont pour but damliorer ladministration de molcules actives par lintermdiaire de transporteurs nanomtriques. Parmi les diffrents types de vhicules proposs pour atteindre ce but, on retrouve les nanoparticules polymriques (NP) constitues de copolymres en bloc. Ces copolymres permettent la fois lencapsulation de molcules actives et confrent la particule certaines proprits de surface (dont lhydrophilicit) ncessaires ses interactions avec les milieux biologiques. Larchitecture retenue pour ces copolymres est une structure constitue le plus frquemment de blocs hydrophiles de poly(thylne glycol) (PEG) associs de faon linaire des blocs hydrophobes de type polyesters. Le PEG est le polymre de choix pour confrer une couronne hydrophile aux NPs et son lefficacit est directement lie son organisation et sa densit de surface. Nanmoins, malgr les succs limits en clinique de ces copolymres linaires, peu de travaux se sont attards explorer les effets sur la structure des NPs darchitectures alternatives, tels que les copolymres en peigne ou en brosse. Durant ce travail, plusieurs stratgies ont t mises au point pour la synthse de copolymres en peigne, possdant un squelette polymrique polyesters-co-ther et des chaines de PEG lies sur les groupes pendants disponibles (groupement hydroxyle ou alcyne). Dans la premire partie de ce travail, des ractions destrification par acylation et de couplage sur des groupes pendants alcool ont permis le greffage de chane de PEG. Cette mthode gnre des copolymres en peigne (PEG-g-PLA) possdant de 5 50% en poids de PEG, en faisant varier le nombre de chanes branches sur un squelette de poly(lactique) (PLA). Les proprits structurales des NPs produites ont t tudies par DLS, mesure de charge et MET. Une transition critique se situant autour de 15% de PEG (poids/poids) est observe avec un changement de morphologie, dune particule solide une particule molle (nanoagrgat polymre). La mthode de greffage ainsi que laddition probable de chaine de PEG en bout de chane principale semblent galement avoir un rle dans les changements observs. Lorganisation des chanes de PEG-g-PLA la surface a t tudie par RMN et XPS, mthodes permettant de quantifier la densit de surface en chanes de PEG. Ainsi deux proprits cls que sont la rsistance lagrgation en conditions saline ainsi que la rsistance la liaison aux protines (tudie par isothermes dadsorption et microcalorimtrie) ont t relies la densit de surface de PEG et larchitecture des polymres. Dans une seconde partie de ce travail, le greffage des chanes de PEG a t ralis de faon directe par cyclo-adition catalyse par le cuivre de mPEG-N3 sur les groupes pendants alcyne. Cette nouvelle stratgie a t pense dans le but de comprendre la contribution possible des chaines de PEG greffes lextrmit de la chaine de PLA. Cette librairie de PEG-g-PLA, en plus dtre compose de PEG-g-PLA avec diffrentes densits de greffage, comporte des PEG-g-PLA avec des PEG de diffrent poids molculaire (750, 2000 et 5000). Les chaines de PEG sont seulement greffes sur les groupes pendants. Les NPs ont t produites par diffrentes mthodes de nanoprcipitation, incluant la nanoprcipitation flash et une mthode en microfluidique. Plusieurs variables de formulation telles que la concentration du polymre et la vitesse de mlange ont t tudies afin dobserver leur effet sur les caractristiques structurales et de surface des NPs. Les tailles et les potentiels de charges sont peu affects par le contenu en PEG (% poids/poids) et la longueur des chanes de PEG. Les images de MET montrent des objets sphriques solides et l'on nobserve pas dobjets de type agrgat polymriques, malgr des contenus en PEG comparable la premire bibliothque de polymre. Une explication possible est labsence sur ces copolymres en peigne de chaine de PEG greffe en bout de la chane principale. Comme attendu, les tailles diminuent avec la concentration du polymre dans la phase organique et avec la diminution du temps de mlange des deux phases, pour les diffrentes mthodes de prparation. Finalement, la densit de surface des chanes de PEG a t quantifie par RMN du proton et XPS et ne dpendent pas de la mthode de prparation. Dans la troisime partie de ce travail, nous avons tudi le rle de larchitecture du polymre sur les proprits dencapsulation et de libration de la curcumine. La curcumine a t choisie comme modle dans le but de dvelopper une plateforme de livraison de molcules actives pour traiter les maladies du systme nerveux central impliquant le stress oxydatif. Les NPs charges en curcumine, montrent la mme transition de taille et de morphologie lorsque le contenu en PEG dpasse 15% (poids/poids). Le taux de chargement en molcule active, lefficacit de changement et les cintiques de librations ainsi que les coefficients de diffusion de la curcumine montrent une dpendance larchitecture des polymres. Les NPs ne prsentent pas de toxicit et ninduisent pas de stress oxydatif lorsque tests in vitro sur une ligne cellulaire neuronale. En revanche, les NPs charges en curcumine prviennent le stress oxydatif induit dans ces cellules neuronales. La magnitude de cet effet est relie larchitecture du polymre et lorganisation de la NP. En rsum, ce travail a permis de mettre en vidence quelques proprits intressantes des copolymres en peigne et la relation intime entre larchitecture des polymres et les proprits physico-chimiques des NPs. De plus les rsultats obtenus permettent de proposer de nouvelles approches pour le design des nanotransporteurs polymriques de molcules actives.
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Lopossum nait dans un tat trs immature, mais rampe avec ses membres antrieurs (MA) de lorifice urognital de la mre une ttine, o il sattache pour poursuivre son dveloppement. Des informations sensorielles sont ncessaires pour guider le nouveau-n vers une ttine et dclencher son attachement. Des expriences prcdentes ont montr que le systme du trijumeau, dont dpend linnervation somesthsique du museau, influence les mouvements prcoces des MA. Le prsent projet vise dterminer si les mcanorcepteurs faciaux sont fonctionnels et exercent une influence sur les MA. On sintresse particulirement aux cellules de Merkel, un mcanorcepteur pidermique innerv par des fibres adaptation lente de type I (SA I). Ces cellules ont t localises sur le pourtour du museau de lopossum nouveau-n en utilisant un traceur cellulaire, lAM1-43. Nous avons analys les rponses musculaires des MA conscutives lapplication de forces calibres au museau sur des prparations in vitro. Ces rponses sont bilatrales et simultanes, trs variables, et leur intensit augmente avec la force de la stimulation. Lors de stimulations rptitives pendant 60 min, les rponses diminuent avec le temps. Le retrait de la peau faciale abolit presque ces rponses. De plus, lapplication dun antagoniste des rcepteurs mtabotropiques du glutamate, qui affecte lactivit des fibres SA I, ou dun antagoniste des rcepteurs purinergiques les diminue fortement, suggrant une participation des cellules de Merkel. Ces rsultats soutiennent que le sens du toucher facial relay par le systme du trijumeau est fonctionnel chez lopossum nouveau-n et quil pourrait influencer les mouvements des MA.
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Les rcoltes de crales sont souvent contamines par des moisissures qui se dveloppent pendant la rcolte et lentreposage et produisent des mtabolites secondaires appels mycotoxines. Le porc est reconnu pour tre sensible au doxynivalnol (DON). Linfection virale la plus importante chez le porc est cause par le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP). Celui-ci provoque un syndrome grippal et des troubles de reproduction. Lobjectif du prsent projet tait de dterminer l'effet in vitro de DON sur la rplication du VSRRP dans de lignes cellulaires permissives, MARC-145 et PAM, et dterminer in vivo l'impact de DON dans des aliments naturellement contamins sur linfection au VSRRP chez le porcelet. Tout dabord, les cellules ont t incubes avec des doses croissantes de DON et ont t infectes avec du VSRRP pour valuer la viabilit et la mortalit cellulaire, la rplication virale et lexpression de cytokines. Les rsultats ont montr que les concentrations de DON de 560ng/ml et plus affectaient significativement la survie des cellules MARC-145 et PAM infectes par le VSRRP. En revanche, il y avait une augmentation significative de la viabilit et une rduction de la mortalit cellulaire des concentrations de DON de 140 280 ng/ml pour les cellules PAM et de 70 280 ng/ml pour les cellules MARC-145 avec une rduction de l'effet cytopathique provoqu parle VSRRP. Au niveau in vivo, 30 porcelets diviss en 3 groupes de 10 porcelets et nourris pendant 2 semaines avec 3 diffrentes dites naturellement ont t contamines avec DON (0; 2,5 et 3,5 mg/kg). Les porcelets ont t subdiviss en 6 groupes, 3 groupes de 6 porcelets et ont t exposs au DON pendant 2 semaines et infects par voie intratrachale et intramusculaire avec le virus. Les 3 autres groupes de 4 porcelets servaient de contrle non infects. Les signes cliniques ont t enregistrs pendant 21 jours. La virmie a t value par PCR. la fin de lexprimentation, les porcelets ont t euthanasis et les lsions pulmonaires ont t values. Les rsultats ont montr que lingestion de DON 3,5 mg/kg a augment leffet du VSRRP sur la svrit des signes cliniques, les lsions pulmonaires et la mortalit. Lingestion de DON 2,5 mg/kg a entrain une augmentation de la virmie au jour 3 aprs linfection mais sans impact sur les signes cliniques et les lsions pulmonaires. Mot cls: DON, VSRRP, MARC-145, PAM, effet cytopathique, cytokines, PCR
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La prvalence des allergies alimentaires IgE-mdies aurait tripl au cours de la dernire dcennie avec des tudes Nord-Amricaines atteignant les 8% chez les enfants. Quoiquil ny ait ce jour aucun traitement curatif pour les allergies alimentaires, limmunothrapie oral (OIT) constitue une nouvelle approche exprimentale prometteuse. Cette dernire consiste en ladministration de doses progressive dallergnes par voie orale sur une priode prolonge dans le but dinstaurer un tat de dsensibilisation et possiblement une tolrance orale soutenue. Cette approche a t dmontre scuritaire et permettrait la dsensibilisation haute dose de plus de 80% des participants allergiques aux arachides, lait ou ufs. Dans cette thse, nous prsentons 2 tudes de phase 1 portant sur des protocoles dOIT, destins optimiser lefficience du traitement chez les sujets avec allergies alimentaires multiples. Prs de 30% des enfants avec allergie alimentaire sont allergiques plus dun aliment, une proportion qui augmente 70% lorsquon considre les cas les plus svres. Ces enfants sont risque augment de ractions accidentelles et souffrent dun impact plus grand sur leur qualit de vie. Dans la premire tude, en crant un mlange individualis avec un ratio stochiomtrique 1:1 entre les protines des aliments allergiques de lenfant, nous dmontrons quil est possible de dsensibiliser jusqu 5 aliments simultanment avec un profil dinnocuit similaire une monothrapie. Dans la seconde tude, nous utilisons un traitement lomalizumab, un anticorps monoclonal anti-IgE, pour permettre une dsensibilisation orale multi-allergnique fortement acclre. Lorsque compar lapproche sans omalizumab, ce protocole sassocie une nette diminution du temps requis pour atteindre les doses dentretien, passant dune mdiane de 21 4 mois, sans affecter le profil dinnocuit. Alors que ces tudes fournissent des approches cliniques raisonnables pour dsensibiliser la population multi-allergique, plusieurs questions persistent, notamment en ce qui a trait linduction de tolrance permanente. Une barrire majeure cet gard rside dans notre pitre comprhension des mcanismes sous-jacents limmunothrapie. Prenant avantage dchantillons cliniques bien caractriss provenant des essais cliniques ci-haut mentionns, nous utilisons les nouvelles technologies de squenage TCR pour suivre la distribution clonale des lymphocytes T spcifiques aux arachides durant une immunothrapie orale. Nous dmontrons que lOIT sassocie des changements significatifs dans les frquences des clones spcifiques, suggrant un processus dpuisement clonal et de remplacement. Nous dmontrons par ailleurs que le test de prolifration lymphocytaire, traditionnellement utilis pour valuer la rponse cellulaire allergique, est domin par une distribution polyclonale hautement non-spcifique. Cette observation a des implications majeures considrant que la plupart de la littrature actuelle sur la rponse T se base sur cette technique. En somme, cette thse jette les bases pour des programmes de recherche translationnelle pour optimiser et personnaliser les protocoles cliniques actuels et dvelopper de nouvelles avenues dinvestigation et de traitement pour amliorer la prise en charge des sujets avec allergies alimentaires.
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Il a t suggr que lautophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la diffrenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La snescence cellulaire a aussi t montre comme implique dans la rparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont t tablis entre autophagie et snescence. Cette tude a pour but dinvestiguer les liens possibles entre autophagie, snescence et diffrenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mcanismes molculaires rgulant la rparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencs en srum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I levs et des niveaux de SQSTM1/p62 diminus. Laugmentation de lautophagie est accompagne dune augmentation de lexpression des marqueurs de diffrenciation myofibroblastique ACTA2/SMA et collagnes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de snescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de lactivit beta-galactosidase associe la snescence. Linhibition de lautophagie laide de diffrents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition gnique laide dARN interfrant ATG7 bloquent lexpression des marqueurs de diffrenciation et de snescence. Lexpression et la scrtion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentes chez les fibroblastes autophagiques. Linhibition de lexpression du CTGF par interfrence gnique prvient la diffrenciation myofibroblastique, dmontrant limportance de ce facteur pro-fibrotique pour la diffrenciation induite par lautophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation dAKT la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en srum des fibroblastes mais est suivie dune rephosphorylation aprs 2 jours. Ce rsultat suggre la ractivation de MTORC2 lors dune autophagie prolonge. Ceci a t vrifi par inhibition de lautophagie dans les fibroblastes carencs en srum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation dAKT. Linhibition de la ractivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation dAKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition gnique de RICTOR. Ces traitements inhibent laugmentation de lexpression du CTGF ainsi que des marqueurs de diffrenciation et de snescence, dmontrant le rle central jou par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la snescence et la carence en srum est connue pour augmenter la quantit de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin dinvestiguer le rle des ROS dans la diffrenciation et la snescence induites par lautophagie, nous avons incubs les fibroblastes carencs en srum en prsence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs dautophagie, de snescence et de diffrenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation dAKT Ser473. Lensemble de ces rsultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolonge comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour lactivation subsquente de la snescence et de la diffrenciation myofibroblastique.
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La sant folliculaire est dtermine par un nombre de facteurs endocriniens, paracrines et autocrines. Les gonadotrophines hypophysaires sont les principaux moteurs du dveloppement du follicule, mais leurs actions sont modules localement par les hormones et des facteurs de croissance. Les glycoprotines de la famille des WNTs reprsentent une grande famille de molcules impliques dans diffrentes voies de signalisation. Ils sont scrts dans le but de moduler et coordonner la rponse des follicules aux gonadotrophines, et leurs activits sont indispensables la fonction ovarienne et la fertilit fminine. Les WNTs sont gnralement classs en fonction de la (des) voie(s) quils activent. Le rle des membres de la voie canonique WNT et de ses composants tels que CTNNB1, WNT4, WNT2, FZD1 et FZD4 est bien tabli au cours du dveloppement du follicule chez les rongeurs. Un rle similaire des WNTs dans les espces mono-ovulatoires demeure essentiellement inconnu. De plus, le rle des WNT non canoniques dans l'ovaire de rongeurs est mconnu. Les objectifs de cette thse sont (1) d'lucider la rgulation hormonale de l'expression de WNT5A et le rle physiologique de WNT5A dans les cellules de la granulosa bovine in vitro et (2) d'identifier les rles physiologiques de WNT5A dans l'ovaire de souris par inactivation gnique conditionnelle. Chacun de ces objectifs a men la publication dun article partir des rsultats obtenus au cours de cette thse. Dans le premier article, le rle de WNT5A dans les cellules de la granulosa bovine a t tudi in vitro. Nous avons constat que WNT5A est un rgulateur ngatif de la strodogense stimule par la FSH issue des cellules de la granulosa, et qu'il agit en supprimant l'activit de signalisation des WNTs canoniques tout en induisant la voie de signalisation MAPK8/JUN. le deuxime article, afin dexaminer le rle de deux WNTs non-canoniques, WNT5A et WNT11, diffrents stades de dveloppement folliculaire, nous avons gnr des modles de souris knock-out conditionnels ciblant les cellules de la granulosa pour chacun de ces WNTs. Les rsultats obtenus ont permis de mettre en vidence que WNT5A est ncessaire pour assurer la fertilit normale chez la femelle, le dveloppement folliculaire et la strodogense ovarienne. Il est aussi un antagoniste de la rponse aux gonadotrophines, agissant par lintermdiaire de la suppression de la signalisation canonique des WNTs. Chez les souris knock-out pour WNT11, nous ne constatons aucun dfaut important dans la fertilit des femelles. Lensemble de notre travail met en vidence que WNT5A est essentiel pour le dveloppement normal du follicule et quil agit pour inhiber la diffrenciation des cellules de la granulosa. En rsum, nous avons fourni une tude novatrice et approfondie, utilisant plusieurs modles et techniques pour dterminer les mcanismes par lesquels WNT5A rgule le dveloppement des follicules.
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La division asymtrique est essentielle pour gnrer la diversit au cours du dveloppement et permet aussi de rguler la balance entre renouvellement et diffrenciation des cellules souches chez ladulte. Dans ces deux cas de figure, elle dpend respectivement dune polarit intrinsque ou dune polarit extrinsque. C. elegans est un excellent modle pour tudier les mcanismes cellulaires et molculaires de la division asymtrique in vivo. Chez lembryon, le maintien dun axe de polarit antro-postrieur dpend des protines PAR conserves et localises de faon asymtrique en deux groupes mutuellement exclusifs; le groupe antrieur avec PAR-3, PAR-6, PKC-3 et le groupe postrieur avec PAR-2 et PAR-1. Labsence dune protine PAR entraine une perte de polarit et une ltalit embryonnaire. Lors dun crible par ARN interfrence men par Jean-Claude Labb pour identifier les suppresseurs de la ltalit associe la perte de PAR-2, deux cyclines de type B, CYB-2.1 et CYB-2.2 ont t trouves. Jai dtermin que CYB-2.1 et CYB-2.2 interviennent dans la polarit sans perturber le cycle cellulaire et agissent vraisemblablement avec leur kinase associe, CDK-1, pour stabiliser les niveaux protiques de PAR-6. Ces travaux permettent de mieux dfinir les liens troits entre polarit et cycle cellulaire. La ligne germinale de C. elegans est un excellent modle pour tudier les divisions des cellules souches germinales in vivo. Par contre, labsence dorientation prfrentielle de ces divisions laisse envisager que la complexit morphologique de la niche pourrait engendrer une diversit daxe possible. Jai tudi la rgulation morphologique de cette niche, une unique cellule somatique appele distal tip cell (DTC), qui arborise de longues extensions au stade adulte. Mes rsultats prliminaires favorisent un modle dans lequel les cellules souches et progniteurs germinaux (CSPG) supportent la formation de ces extensions. Enfin, jai obtenu des conditions favorables ltude de la division asymtrique extrinsque dans ce modle, en simplifiant larchitecture de la niche dans des conditions qui prservent les divisions cellulaires des cellules souches. Mes travaux ont permis de mieux comprendre les liens unissant les diffrents processus biologiques impliqus dans la division asymtrique, dune part par ltude du rle quy jouent des rgulateurs cls du cycle cellulaire au cours du dveloppement et dautre part par la caractrisation dune communication bidirectionnelle entre la niche et les cellules souches chez ladulte.
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Lamylodose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathognses, qui est explique par la grande variabilit biologique et structurale des protines responsables de la formation des dpts damylode. Lamyline (polypeptide amylode des lots pancratiques, IAPP) est une protine trs susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bta et confrant aussi des proprits physicochimiques distinctes. Cette protine prend alors une forme fibrillaire et se dpose dans les lots de Langerhans chez les humains atteints de diabte de type 2 ou dinsulinome. Ces dpts damylode pancratique (AIAPP) ont t dcrits chez certaines espces animales telles que les flins domestiques, les grands flins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dpts damylode contribue la pathognse du diabte de type 2, mais les mcanismes qui induisent la conversion de lamyline (IAPP) en amylode (AIAPP) ne sont pas compltement compris. Les hypothses du projet sont que certaines variations prsentes dans les squences peptidiques de lIAPP provenant de diffrentes espces animales jouent un rle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composs chimiques aromatiques/phnoliques sont capables dabroger la formation de dpts damylode. Le projet de recherche consiste donc caractriser la propension des diffrentes isoformes animales dIAPP former de lamylode in vitro afin didentifier les acides amins jouant un rle cl dans cette transformation structurale et ultimement dinhiber la formation damylode pancratique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste identifier les diffrentes squences peptidiques de lIAPP retrouves chez les espces animales. Lobjectif est didentifier les acides amins jouant un rle cl dans la formation damylode. Le gne de lIAPP a t squenc chez plus dune quarantaine despces. Le potentiel dagrgation des squences obtenues a t simul laide doutils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a t commande afin de procder des analyses physicochimiques in vitro permettant dvaluer le potentiel amylodognique (test fluorimtrique la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichrosme circulaire, microscopie lectronique transmission) et cytotoxique (sur une ligne cellulaire provenant dinsulinome : INS-1). Les analyses effectues partir de la librairie constitue de 23 peptides ont permis didentifier trois squences ne formant pas damylode et qui proviennent des espces animales suivantes : le tamarin lion dor (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et lalpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 prsentant le motif NFLVH qui ne forme plus damylode lorsquil est remplac par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides amins 29P, 14K et 18R sont galement impliqus dans linhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernire partie du projet consiste inhiber la formation de lamylode en utilisant des composs chimiques commercialiss (hypoglycmiants, anti-inflammatoires non strodiens) ou nouvellement synthtiss dans notre laboratoire (les aryles thyles ures). Un criblage dune soixantaine de composs chimiques a t conduit dans cette tude. Leur efficacit a t teste sur lIAPP humaine, qui possde un fort potentiel amylodognique. Les techniques utilises sont les mmes que celles exploites prcdemment. Lessai de liaison croise photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a t ralis afin dtudier les formes intermdiaires (monomres, oligomres). Un total de 11 composs chimiques a dmontr un potentiel inhiber lagrgation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycmiants, le glyburide, le rpaglinide et la troglitazone ont montr lactivit thrapeutique la plus leve pour retarder et rduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamylodognes actifs incluaient le diclofenac, le mloxicam, le phnylbutazone, le sulindac et le tnoxicam. Les aryles tyles ures les plus intressantes taient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composs ont confr une protection cellulaire contre lactivit cytotoxique des fibrilles. Les molcules actives possdent des lments structuraux communs tels des substituants donneurs dlectrons (alcool, amine, halogne) sur un noyau benzne. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractriser lIAPP chez diverses espces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle navait pas encore t dcrite, de dterminer les sites jouant un rle cl dans sa transformation en amylode et, ultimement, de tester le potentiel thrapeutique de nouveaux agents antiamylodognes dans le diabte de type 2. Nous esprons que ce projet ouvrira ainsi la porte de nouvelles stratgies de traitement.
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Le diabte de type 2 est une maladie chronique dont lincidence est en augmentation continuelle. Le risque de dvelopper le diabte de type 2 chez les populations autochtones du Canada est de trois cinq fois plus lev que le reste de la population canadienne. La fort borale comporte plusieurs plantes mdicinales ayant un potentiel pour le traitement ou la prvention du diabte. Certaines de ces plantes font partie de la mdecine traditionnelle et alternative Crie. Des enqutes ethnobotaniques ont amen notre quipe de recherche identifier 17 extraits de plantes mdicinales utilises par les Cris dEeyou Istchee (Baie James, Qubec) pour traiter les symptmes du diabte. Parmi ces extraits, certains ont montr des activits anti-diabtiques au niveau des cellules musculaires, des adipocytes et dans des tudes in vivo ralises chez des animaux. Le but de cette thse est dlucider leffet de ces 17 plantes sur lhomostasie hpatique de glucose, didentifier lespce la plus prometteuse et isoler ces constituants actifs. De mme, le bleuet nain du genre Vaccinium angustifolium fait partie de la fort borale canadienne et est connu pour ses activits anti-diabtiques. Une biotransformation du jus de bleuet lui confre une activit antioxydante accrue et un profil biologique diffrent. Le deuxime but de cette thse est dlucider les mcanismes daction par lesquels le jus de bleuet biotransform (BJ) exerce son effet anti-diabtique et didentifier ses principes actifs. Les rsultats ont montr que trois extraits de plantes Cris se sont dmarqus par leur effet sur lhomostasie hpatique de glucose. Picea glauca exerce son effet en diminuant la production de glucose alors que Larix laricina agit en augmentant le stockage de glucose. Abies balsamea a montr le profil le plus prometteur, elle agit simultanment en diminuant lactivit de la Glucose-6-phosphatase (G6Pase) via la stimulation des voies insulino-dpendante et - indpendante et en augmentant lactivit de la Glycogne synthtase (GS) suite la phosphorylation de la Glycogne synthase kinase-3. Le fractionnement de lextrait dAbies balsamea guid par les deux bioessais a men lisolation de trois composs actifs; lacide abitique (AA), lacide dhydroabitique (DAA) et le squalne (SQ). Les principes actifs ont montr le mme mcanisme daction que lextrait brut en diminuant lactivit de la G6Pase et augmentant celle de la GS ainsi quen activant les voies de signalisation impliques. Le DAA ii sest dmarqu par son effet le plus puissant et trs comparable celui de lextrait dAbies balsamea dans toutes les expriences. De son ct le BJ a montr un effet sur la diminution de la production hpatique de glucose, laugmentation de son stockage ainsi que laugmentation de son transport dans le muscle. Son fractionnement guid par les bioessais a permis disoler sept fractions dont trois taient les plus actives. Lidentification des constituants de ces fractions actives a men isoler quatres composs phnoliques; lacide chlorognique, lacide gallique, lacide protocatchique et le catchol. Le catchol sest dmarqu avec ses effets les plus puissants en diminuant lactivit de la G6Pase, augmentant celle de la GS et en stimulant le transport de glucose dans le muscle. Les rsultats de cette thse indiquent que la diminution de la production hpatique de glucose peut sajouter au profil anti-diabtique de certaines plantes mdicinales Cries et surtout celui dA.balsamea dont les composs actifs peuvent aider dans le dveloppement de nouvelles molcules anti-diabtiques. De plus, les rsultats de cette thse ont montr que lactivit antidiabtique du BJ implique le contrle de lhomostasie de glucose au niveau du foie et du muscle. Lidentification du catchol comme principe actif avec potentiel anti-diabtique prometteur pourra servir pour des fins thrapeutiques ultrieures.
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Lhypertrophie cardiaque reprsente la rponse primaire du cur dans le but damliorer la fonction cardiaque qui est compromise suite un accident ischmique ou une surcharge hmodynamique. Cependant, lhypertrophie cardiaque a pour consquence pathologique la fibrose ractive, qui est caractrise par la synthse incontrle et le dpt du collagne par les myofibroblastes. Ainsi, laccumulation accrue du collagne dans le cur hypertrophi mne laugmentation de la rigidit cardiaque et la dtrioration progressive de la fonction contractile du cur. Plusieurs tudes ont dmontr que la protine nestine, appartenant la famille des filaments intermdiaires, est r-exprime dans les myofibroblastes durant la fibrose rparative et est implique dans la prolifration cellulaire. Base sur ces observations, cette tude teste lhypothse selon laquelle nestine est induite dans les myofibroblastes suivant le dveloppement de la fibrose ractive dans le cur des rats ayant subi une constriction aortique supra-rnale. Deux semaines suivant une constriction aortique supra-rnale chez le rat, un patron dhypertrophie concentrique cardiaque a t observ et associ avec une rponse de fibrose ractive caractrise par le dpt accru de collagne dans le tissu interstitiel et la rgion pri-vasculaire de nombreux vaisseaux sanguins cardiaques. De plus, les niveaux de la protine nestine sont augments significativement dans les curs des rats hypertrophis, et ce, de faon corrlative avec la pression artrielle moyenne et la pression systolique du ventricule gauche. Les techniques dimmunofluorescences ont rvl une apparition accrue des cellules immunoractives nestine, qui prsentent un phnotype msenchymateux caractris par la co-expression de collagne dans le tissu interstitiel et la rgion pri-vasculaire des curs hypertrophis. Ces donnes suggrent que les fibroblastes rsidents peuvent exprimer la protine nestine ou que lexpression de nestine est induite en rponse aux facteurs pro-fibrotiques impliqus dans la fibrose ractive. En effet, lexposition des myofibroblastes normaux et des myofibroblastes isols des curs hypertrophis lAII, TGF-B1 et EGF augmente significativement lexpression de la protine nestine, tandis que lexpression de l-SMA demeure inchange. De plus, de manire prdominante dans le cur hypertrophi, des cellules non-vasculaires CD31(+) ont t dtectes dans le tissu interstitiel et la rgion pri-vasculaire. Ces cellules co-expriment nestine et collagne suggrant une transition des cellules endothliales vers un phnotype msenchymateux. Finalement, la protine nestine, sous sa forme filamenteuse, a t dtecte dans les cellules endothliales de lartre coronaire humaine et leur exposition au TGF-B1, induit lexpression de collagne. En revanche, lexpression de collagne a t dtecte dans les cellules microvasculaires de rats CD31(+), alors que lexpression de nestine est absente. En rponse aux traitements de TGF-B1 et EGF, lexpression de nestine, sous sa forme non-filamenteuse, est dtecte dans les cellules microvasculaires de rats. Collectivement, ces donnes supportent la prmisse selon laquelle la rponse de fibrose ractive dans les curs hypertrophis, suite une constriction aortique supra-rnale, est attribue en partie laugmentation de lapparition des cellules msenchymateuses positives lexpression de nestine qui proviennent des fibroblastes rsidents du ventricule. De plus, les donnes in vivo et in vitro suggrent que les cellules endothliales dplaces reprsentent une source additionnelle des cellules msenchymateuses nestine(+) dans le cur hypertrophi et contribuent au dveloppement de la fibrose ractive. Cibler la protine nestine peut reprsenter une approche thrapeutique afin dattnuer la rponse de fibrose ractive indpendamment de lorigine des cellules msenchymateuses.
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L'adaptation l'environnement est essentielle la survie cellulaire et des organismes en gnral. La capacit d'adaptation aux variations en oxygne repose sur des mcanismes de dtection de l'hypoxie et une capacit rpondre en amorant un programme d'angiogense. Bien que la contribution du facteur induit par l'hypoxie (HIF) est bien dfinie dans l'induction d'une telle rponse, d'autres mcanismes sont susceptibles d'tre impliqus. Dans cette optique, les tudes dmontrant l'influence du mtabolisme nergtique sur le dveloppement vasculaire sont de plus en plus nombreuses. L'un de ces composs, le succinate, a rcemment t dmontr comme tant le ligand du GPR91, un rcepteur coupl aux protines G. Parmi les diffrents rles attribus ce rcepteur, notre laboratoire s'intressa aux rles du GPR91 dans la revascularisation observe suite des situations d'hypoxie dont ceux affectant la rtine. Il existe cependant d'autres conditions pour lesquelles une revascularisation serait bnfique notamment suite un stress hypoxique-ischmique crbral. Nos travaux ont pour objectifs de mieux comprendre le rle et le fonctionnement de ce rcepteur durant le dveloppement et dans le cadre de pathologies affectant la formation de vaisseaux sanguins. Dans un premier temps, nous avons dtermin le rle du GPR91 dans la gurison suite un stress hypoxique-ischmique crbral chez le nouveau-n. Nous montrons que ce rcepteur est exprim dans le cerveau et en utilisant des souris n'exprimant pas le GPR91, nous dmontrons que dans un modle d'hypoxie-ischmie crbrale nonatal l'angiogense prenant place au cours de la phase de gurison dpend largement du rcepteur. L'injection intracrbrale de succinate induit galement l'expression de nombreux facteurs proangiogniques et les rsultats suggrent que le GPR91 contrle la production de ces facteurs. De plus, l'injection de ce mtabolite avant le modle d'hypoxie-ischmie rduit substantiellement la taille de l'infarctus. In vitro, des essaies de transcription gnique dmontrent qu' la fois les neurones et les astrocytes rpondent au succinate en induisant l'expression de facteurs bnfiques la revascularisation. En considrant le rle physiologique important du GPR91, une seconde tude a t entreprise afin de comprendre les dterminants molculaires rgissant son activit. Bien que la localisation subcellulaire des RCPG ait traditionnellement t considre comme tant la membrane plasmique, un nombre de publications indique la prsence de ces rcepteurs l'intrieur de la cellule. En effet, tel qu'observ par microscopie confocale, le rcepteur colocalise avec plusieurs marqueurs du rticulum endoplasmique, que celui-ci soit exprim de faon endogne ou transfect transitoirement. De plus, lactivation des gnes par stimulation avec le succinate est fortement affecte en prsence d'inhibiteur du transport d'acides organiques. Nous montrons que le profil de facteurs angiogniques est influenc selon la localisation ce qui affecte directement l'organisation du rseau tubulaire ex vivo. Finalement, nous avons identifi une rgion conserve du GPR91 qui agit de signal de rtention. De plus, nous avons dcouvert l'effet de l'hypoxie sur la localisation. Ces travaux confirment le rle de rgulateur matre de l'angiogense du GPR91 lors d'accumulation de succinate en condition hypoxique et dmontrent pour la premire fois l'existence, et l'importance, d'un rcepteur intracellulaire activ par un intermdiaire du mtabolisme. Ces donnes pavent donc la voie une nouvelle avenue de traitement ciblant GPR91 dans des pathologies hypoxiques ischmiques crbrales et soulvent l'importance de tenir compte de la localisation subcellulaire de la cible dans le processus de dcouverte du mdicament.
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Les glycosides sont reconnus pour leur potentiel pharmaceutique tels que les antibiotiques, les agents anticancreux et antiviraux. Ils sont impliqus dans plusieurs processus biologiques entre autres la reconnaissance cellulaire, linflammation, la rponse immunitaire, la croissance, le transport cellulaire, ladhsion cellulaire et les groupes sanguin. Notre groupe excelle dans la glycosidation strocontrle avec un minimum de protection suivant le concept dactivation distance daglycones htrocycliques anomriques. La prsence dune quantit sous stoechiomtrique dacide de Lewis, les (2-pyridyl)--D-glycosides dprotgs sont dexcellents donneurs permettant de haute slectivit pour lanomre- -D de glycosides simples et complexes. Inversement, (2-pyridyl)--D-glycosides donnent les -D-glycosides avec de bonne slectivit. Des exemples de formation strocontrle de glycosides sont prsents dans cette thse avec des accepteurs tels que les phnols, les strodes, les terpnes et les acides hydroxyamins. Cette mthodologie de glycosidation a t applique sur support solide.
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Lencphalopathie hpatique (EH) est une complication neuropsychiatrique de la maladie de foie telle que la cirrhose, caractrise par des dysfonctions cognitives et motrices. Le seul traitement curatif est la transplantation hpatique (TH). Historiquement, lEH est considre comme un dsordre mtabolique rversible et il est attendu quil soit rsolu suivant la TH. Cependant, il a t dmontr que des complications neurologiques persistent chez 47% des patients transplants. La TH est une opration chirurgicale complexe accompagne de stress pri-opratoire telle que la perte sanguine et lhypotension. Lhypothse de ce projet dtude est que lEH minimale (EHm) rend le cerveau plus susceptible une perte neuronale suite une insulte hypotensive. Nous avons donc caractris un modle dhypotension chez des rats cirrhotiques avec ligation de la voie biliaire (BDL) dans lequel une hypovolmie de lartre fmorale a t faite. Avec ce modle, nous avons tudi limpact de diffrentes pressions sanguines de 120 minutes sur le compte neuronal. Nos rsultats dmontrent que les BDL hypotendus une pression artrielle moyenne de 60 mmHg et 30 mmHg ont une diminution du compte neuronal et que les neurones mourraient par apoptose (observe par la prsence de caspase-3 clive). Nous avons galement dtermin que le flot sanguin crbral tait altr chez les rats cirrhotiques BDL. Le second objectif tait dvaluer si le traitement de lEHm par lornithine phnylactate (OP) permettait dviter la perte neuronale chez les BDL hypotendus. Nos rsultats ont dmontrs que lOP permettait de partiellement rtablir les fonctions cognitives chez les rats BDL. De plus, les rats BDL traits avec lOP peuvent viter la mort neuronale. Cependant, le processus apoptotique est toujours enclench. Ce rsultat suggre la possibilit de mort cellulaire retarde par lOP. Ces rsultats suggrent que les patients cirrhotiques avec EHm sont plus susceptibles une mort neuronale induite par hypotension. La combinaison de lEHm et lhypotension permet dexpliquer les complications neurologiques rencontres chez certains patients. Le diagnostic et le traitement de ce syndrome doit donc tre fait chez les patients cirrhotiques pour viter ces complications post-TH.
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LITAF (lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha factor), une protine lysosomale, possde deux motifs PPXY capables dinteragir avec les domaines WW dun sous-groupe spcifique de trois ligases de lubiquitine. Ces ligases sont impliques dans lubiquitylation ainsi que la dgradation de diverses protines cellulaires aux lysosomes et aux protasomes. Les travaux mens dans le cadre de cette tude visaient dmontrer que LITAF active ces ligases et dterminer les consquences de cette activation sur les substrats de ces ligases. Pour y parvenir, des expriences dubiquitylation in vivo et in vitro ont t menes en prsence de LITAF ainsi que des ligases et des substrats appropris. Lactivation des ligases a t mesure par leur taux dautoubiquitylation et celle de leurs substrats par leur taux dubiquitylation et de dgradation. Les rsultats obtenus montrent que lactivit des ligases est augmente en prsence de LITAF et que lubiquitylation et la dgradation des substrats de ces ligases sont partiellement augmentes. LITAF semble donc jouer un rle de rgulateur des ligases de lubiquitine. Limportance de ces rsultats rside dans le fait que l'expression et la localisation intracellulaire de LITAF sont affectes dans plusieurs pathologies. Nos rsultats amnent un clairage nouveau sur le rle physiologique de cette protine et pourraient expliquer en partie comment l'altration de l'expression de LITAF affecte l'quilibre cellulaire.
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Dans le cortex visuel des mammifres, une cellule panier (BC) qui reprsente un sous-type majoritaire dinterneurones GABAergiques, innerve une centaine de neurones par une multitude de synapses localises sur le soma et sur les dendrites proximales de chacune de ses cibles. De plus, ces cellules sont importantes pour la gnration des rythmes gammas, qui rgulent de nombreuses fonctions cognitives, et pour la rgulation de la plasticit corticale. Bien que la fonction des BC au sein des rseaux corticaux est l'tude, les mcanismes qui contrlent le dveloppement de leur arborisation complexe ainsi que de leurs nombreux contacts synaptiques nont pas t entirement dtermins. En utilisant les rcepteurs allatostatines coupls aux protines G de la drosophile (AlstR), nous dmontrons in vitro que la rduction de l'excitation ainsi que la rduction de la libration des neurotransmetteurs par les BCs corticales individuelles des souris, diminuent le nombre de cellules innerves sans modifier le patron d'innervation prisomatique, durant et aprs la phase de prolifration des synapses prisomatiques. Inversement, lors de la suppression complte de la libration des neurotransmetteurs par les BCs individuelles avec lutilisation de la chane lgre de la toxine ttanus, nous observons des effets contraires selon le stade de dveloppement. Les BCs exprimant TeNT-Lc pendant la phase de prolifration sont caractrises par des arborisations axonales plus denses et un nombre accru de petits boutons homognes autour des somas innervs. Toutefois, les cellules transfectes avec TeNT-Lc aprs la phase de la prolifration forment une innervation prisomatique avec moins de branchements terminaux daxones et un nombre rduit de boutons avec une taille irrgulire autour des somas innervs. Nos rsultats rvlent le rle spcifique des niveaux de lactivit neuronale et de la neurotransmission dans l'tablissement du territoire synaptique des cellules GABAergiques corticaux. Le facteur neurotrophique driv du cerveau (BDNF) est un modulateur puissant de la maturation activit-dpendante des synapses GABAergiques. Grce l'activation et la signalisation de son rcepteur tyrosine kinase B (TrkB), la liaison de mBDNF module fortement la prolifration des synapses prisomatiques GABAergiques forms par les BCs. Par contre, le rle du rcepteur neurotrophique de faible affinit, p75NTR, dans le dveloppement du territoire synaptique des cellules reste encore inconnu. Dans ce projet, nous dmontrons que la suppression de p75NTR au niveau des BCs individuelles in vitro provenant de souris p75NTRlox induit la formation d'une innervation prisomatique exubrante. BDNF est synthtis sous une forme prcurseur, proBDNF, qui est par la suite clive par des enzymes, y compris la plasmine active par tPA, pour produire une forme mature de BDNF (m)BDNF. mBDNF et proBDNF se lient avec une forte affinit TrkB et p75NTR, respectivement. Nos rsultats dmontrent quun traitement des cultures organotypiques avec la forme rsistante au clivage de proBDNF (mut-proBDNF) rduit fortement le territoire synaptique des BCs. Les cultures traites avec le peptide PPACK, qui inactive tPA, ou avec tPA altrent et favorisent respectivement la maturation de linnervation synaptique des BCs. Nous dmontrons aussi que linnervation exubrante forme par les BCs p75NTR-/- nest pas affecte par un traitement avec mut-proBDNF. Lensemble de ces rsultats suggre que l'activation de p75NTR via proBDNF rgule ngativement le territoire synaptique des BCs corticaux. Nous avons ensuite examin si mut-proBDNF affecte linnervation prisomatique forme par les BCs in vivo, chez la souris adulte. Nous avons constat que les boutons GABAergiques prisomatiques sont significativement diminus dans le cortex infus avec mut-proBDNF par rapport lhmisphre non-infus ou trait avec de la saline. En outre, la plasticit de la dominance oculaire (OD) est rtablie par ce traitement chez la souris adulte. Enfin, en utilisant des souris qui ne possdent pas le rcepteur p75NTR dans leurs BCs spcifiquement, nous avons dmontr que l'activation de p75NTR via proBDNF est ncessaire pour induire la plasticit de la OD chez les souris adultes. Lensemble de ces rsultats dmontre un rle critique de l'activation de p75NTR dans la rgulation et le maintien de la connectivit des circuits GABAergiques, qui commencent lors du dveloppement postnatal prcoce jusqu l'ge adulte. De plus, nous suggrons que l'activation contrle de p75NTR pourrait tre un outil utile pour restaurer la plasticit dans le cortex adulte.
