790 resultados para signalisation cellulaire
Resumo:
La leucmie aigu lymphoblastique (LAL) est le cancer pdiatrique le plus frquent. Elle est la cause principale de mortalit lie au cancer chez les enfants due un groupe de patient ne rpondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicits associes un traitement intensif de chimiothrapie. Les tudes en pharmacogntique de notre groupe ont montr une corrlation tant individuelle que combine entre les variants gntiques particuliers denzymes dpendantes du folate, particulirement la dihydrofolate rductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du mthotrexate (MTX) et le risque lev de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gne ATF5 impliqu dans la rgulation de lasparagine synthetase (ASNS) sont associes un risque plus lev de rechute ou une toxicit ASNase dpendante chez les patients ayant reu de lasparaginase dE.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thse est de comprendre davantage dun point de vue fonctionnel, le rle de variations gntiques dans la rponse thrapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que lASNase. Mon objectif spcifique tait danalyser une association trouve dans des paramtres cliniques par le biais dessais de prolifration cellulaire de lignes cellulaires lymphoblastodes (LCLs, n=93) et dun modle murin de xnogreffe de la LAL. Une variation gntique dans le polymorphisme TS (homozygosit de lallle de la rptition triple 3R) ainsi que lhaplotype *1b de DHFR (dfini par une combinaison particulire dallle driv de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilit au MTX ont t valus par le biais dessais de prolifration cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la rponse lASNase de E. Coli ont permis dvaluer leffet de la variation T1562C de la rgion 5UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gne ASNS (dfinis par deux variations gntiques et arbitrairement appels haplotype *1). Le modle murin de xnogreffe ont t utilis pour valuer leffet du gnotype 3R3R du gne TS. Lanalyse de polymorphismes additionnels dans le gne ASNS a rvl une diversification de lhaplotype *1 en 5 sous-types dfinis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrl avec la sensibilit in vitro lASNase et lun deux (rs10486009) semble particulirement important dans la rduction de la sensibilit in vitro lASNase, pouvant expliquer une sensibilit rduite de lhaplotype *1 dans des paramtres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifration cellulaire en rponse ASNase de E.Coli na t dtecte. Nous navons pas dtect une association lie au gnotype lors danalyse in vitro de sensibilit au MTX. Par contre, des rsultats in vivo issus de modle murin de xnogreffe ont montr une relation entre le gnotype TS 3R/3R et la rsistance de manire dose-dpendante au traitement par MTX. Les rsultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontr chez les patients au gnotype TS 3R/3R et suggrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. travers ces expriences, nous avons aussi dmontr que les modles murins de xnogreffe peuvent servir comme outil prclinique afin dexplorer loption dun traitement individualis. En conclusion, la connaissance acquise travers mon projet de thse a permis de confirmer et/ou didentifier quelques variants dans la voix daction du MTX et de lASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratgies dindividualisation de la dose, permettant la slection dun traitement optimum ou moduler la thrapie bas sur la gntique individuelle.
Resumo:
La leptine circule en proportion de la masse graisseuse du corps et la transduction de son signal travers la forme longue de son rcepteur via un certain nombre de voies neurales , y compris MAPK, PI3-K ,AMPK et JAK2 - STAT3 . Il faut noter que STAT3 constitue une voie cle au rcepteur de la leptine par laquelle la leptine module l'expression des gnes impliqus dans la rgulation du bilan nergtique. La plupart des recherches ont port sur la fonction du rcepteur de la leptine au sein de l' hypothalamus, en particulier la fonction du rcepteur de la leptine dans le noyau arqu. Toutefois, les rcepteurs de la leptine sont galement exprims sur les neurones dopaminergiques de l'aire tgmentale ventrale et la leptine agit sur cette rgion du cerveau pour influencer la prise alimentaire, la motivation, la locomotion, l'anxit et la transmission de la dopamine. De plus, la leptine active la STAT3 dans les dopaminergiques et GABAergiques populations neuronales. Bien que ces rsultats contribuent notre comprhension des multiples actions de la leptine dans le systme nerveux central, il reste rsoudre les cellules et la signalisation du rcepteur de la leptine qui sont responsables des effets neurocomportementaux de la leptine dans le msencphale. Visant dterminer la contribution de la voie de signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques du msencphale, nous avons gnr une ligne de souris knockout conditionnel dans lequel l'activation du gne de STAT3 sur son rsidu tyrosine 705 ( Tyr 705 ) est absent spcifiquement dans les neurones dopaminergiques. Avec l'utilisation de ce modle de souris gntique, nous avons valu l'impact de l'ablation de la signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques sur un certain nombre de fonctions lies la dopamine, y compris l'alimentation, la locomotion, les comportements lis la rcompense, l'motion et la libration de dopamine dans le noyau accumbens. Fait intressant, nous avons observ un dimorphisme sexuel dans le phnotype des souris STAT3DAT-KO. L'activation de la voie de signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques est responsable de l'action de la leptine dans la rduction de la locomotion, rcompense lie l'activit physique, et de l'augmentation de la libration et de la disponibilit de la dopamine chez les souris mles. Cependant, il ne module pas le comportement motionnel. D'autre part, les souris femelles STAT3DAT-KO augmentent les niveaux d'anxit et les niveaux plasmatiques de corticostrone, sans provoquer de changements de la dpression. Cependant, la perte d'activation de STAT3 dans les neurones dopaminergiques ne module pas le comportement locomoteur chez les souris femelles. Notamment, les actions de la leptine dans le msencphale pour influencer le comportement alimentaire ne sont pas mdies par l'activation de STAT3 dans les neurones dopaminergiques, considrant que les souris mles et femelles ont un comportement alimentaire normal. Nos rsultats dmontrent que la voie de signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques est responsable des effets anxiolytiques de la leptine, et soutient l'hypothse que la leptine communique l'tat d'nergie du corps (i.e. la relation entre la dpense et les apports nergtiques) pour les rgions msolimbiques pour attnuer les effets de motivation et de rcompense de plusieurs comportements qui servent rhabiliter ou puiser les rserves d'nergie. En outre, ce travail souligne l'importance d'tudier la modulation de la signalisation de la leptine dans diffrente types de cellules, afin d'identifier les voies de signalisation et les mcanismes cellulaires impliqus dans les diffrentes fonctions neuro-comportementales de la leptine.
Resumo:
Introduction: L'arthrose est caractrise par une destruction progressive du cartilage, une inflammation synoviale, et un remodelage de los sous-chondral avec une production excessive des mdiateurs inflammatoires et cataboliques. Nous avons dmontr que le niveau du 4-hydroxynonnal (4-HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augment dans le cartilage humain arthrosique sans quon sache le mcanisme exacte impliqu dans laugmentation de cette molcule. Des donnes de la littrature indiquent que laccumulation du HNE est contrle par laction de la glutathione S-transfrase A4-4 (GSTA4-4), une enzyme implique dans la dtoxification du HNE. Au niveau transcriptionel, lexpression de cette enzyme est rgule par la transactivation du facteur de transcription Nrf2. Objectif: Lobjectif de cette tude vise dmontrer que laugmentation du HNE dans le cartilage arthrosique est attribue, en partie, laltration de lexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2. Mthode: Le niveau dexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2 a t mesure par Western blot et par PCR en temps rel dans le cartilage humain arthrosique et dans le cartilage provenant des souris atteintes darthrose. Pour dmontrer le rle du Nrf2 dans larthrose, les chondrocytes humains arthrosiques ont t traits par linterleukine 1beta (IL-1) ou par le H2O2 en prsence ou en absence des activateurs du Nrf2 tels que le Protandim, AI, et du 6-Gingrol. Par ailleurs, les chondrocytes ont t transfects par un vecteur dexpression de Nrf2 puis traits par lIL-. En utilisant le modle darthrose chez la souris, les animaux ont t traits par voie orale de 10 mg/kg/jour de Protandim pendant 8 semaines. Rsultats: Nous avons observ une diminution significative de lexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2 dans le cartilage humain et murin arthrosique. L'activation de Nrf2 bloque la stimulation de la mtalloprotinase-13 (MMP-13), la prostaglandine E2 (PGE2) et de l'oxyde nitrique (NO) par lIL-1. En outre, nous avons montr que l'activation Nrf2 protge les cellules contre la mort cellulaire induite par H2O2. Fait intressant, l'administration orale de Protandim rduit la production du HNE par l'intermdiaire de lactivation de la GSTA4. Nous avons dmontr que le niveau dexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2 diminue dans le cartilage provenant des patients et des souris atteints darthrose. De plus, la surexpression de ce facteur nuclaire Nrf2 empche la production du HNE et la MMP-13 et linactivation de la GSTA4-4. Dans notre modle exprimental darthrose induite par dstabilisation du mnisque mdial chez la souris, nous avons trouv que l'administration orale de Protandim 10 mg / kg / jour rduit les lsions du cartilage. Conclusion: Cette tude est de la premire pour dmontrer le rle physiopathologique du Nrf2 in vitro et in vivo. Nos rsultats dmontrent que lactivation du Nrf2 est essentielle afin de maintenir lexpression de la GSTA4-4 et de rduire le niveau du HNE. Le fait que les activateurs du Nrf2 abolissent la production de la HNE et aussi un certain nombre de facteurs connus pour tre impliqus dans la pathogense de larthrose les rend des agents cliniquement utiles pour la prvention de la maladie.
Resumo:
Lautophagie est une voie hautement conserve de dgradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel lhomostasie cellulaire et contribue lapprtement et la prsentation des antignes. Les rles relativement rcents de l'autophagie dans l'immunit inne et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le dveloppement de nouvelles thrapies o la drgulation de lautophagie est associe des maladies auto-immunes. Cependant, l'tude in vivo de la rponse autophagique est difficile en raison du nombre limit de mthodes d'analyse pouvant fournir une dfinition dynamique des protines cls impliques dans cette voie. En consquence, nous avons dvelopp un programme de recherche en protomique intgre afin didentifier et de quantifier les proteines associes l'autophagie et de dterminer les mcanismes molculaires rgissant les fonctions de lautophagosome dans la prsentation antignique en utilisant une approche de biologie des systmes. Pour tudier comment l'autophagie et la prsentation antignique sont activement rguls dans les macrophages, nous avons d'abord procd une tude protomique grande chelle sous diffrentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels lactivation par les cytokines et linfection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les ractions locales et systmiques afin de dvelopper une rponse immune adaptative. La protomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrles et stimuls avec le TNF-alpha a rvl que l'activation des macrophages a entrain la dgradation de protines mitochondriales et des changements dabondance de plusieurs protines impliques dans le trafic vsiculaire et la rponse immunitaire. Nous avons constat que la dgradation des protines mitochondriales tait sous le contrle de la voie ATG5, et tait spcifique au TNF-alpha. En outre, lutilisation dun nouveau systme de prsentation antignique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entraine lapprtement et la prsentation dantignes mitochondriaux par des molcules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du rpertoire immunopeptidomique la surface cellulaire. Ces rsultats mettent en vidence un rle insouponn du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure comprhension des mcanismes responsables de la prsentation dauto-antignes par les molcules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe galement entre infection virale et l'autophagie. Rcemment, notre laboratoire a fourni une premire preuve suggrant que la macroautophagie peut contribuer la prsentation de protines virales par les molcules du CMH de classe I lors de linfection virale par l'herps simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus rpandues. Bien que la composition des particules virales a t tudie prcdemment, on connat moins bien l'expression de l'ensemble du protome viral lors de linfection des cellules htes. Afin de caractriser les changements dynamiques de lexpression des protines virales lors de linfection, nous avons analys par LC-MS/MS le protome du HSV1 dans les macrophages infects. Ces analyses nous ont permis didentifier un total de 67 protines virales structurales et non structurales (82% du protome HSV1) en utilisant le spectromtre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons galement identifi 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites dubiquitylation sur diffrentes protines virales. Suite lubiquitylation, les protines virales peuvent se localiser au noyau ou participer des vnements de fusion avec la membrane nuclaire, suggrant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vsiculaire des protines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la rplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protines virales, mettant en vidence l'interdpendance des protines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de lubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces rsultats ouvriront la voie vers de nouvelles tudes sur la biologie des virus de l'herps. Fait intressant, l'infection HSV1 dans les macrophages dclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffre remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appel autophagie associe lenveloppe nuclaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit la formation de vsicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nuclaire o on retrouve une grande proportion de certaines protines virales, telle la glycoprotine B. Les mcanismes rgissant NEDA et leur importance lors de linfection virale sont encore mconnus. En utilisant un essai de prsentation antignique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indpendante dATG5 et participe lapprtement et la prsentation dantignes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la prsentation des antignes, il est essentiel de caractriser le protome des autophagosomes isols partir de macrophages infects par HSV1. Aussi, nous avons dvelopp une nouvelle approche de fractionnement bas sur lisolation de lysosomes chargs de billes de latex, nous permettant ainsi dobtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antignes HSV1 dans les autophagosomes a t determine par protomique quantitative. Les protines provenant de lenveloppe nuclaire ont t prfrentiellement transfres dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protomiques dautophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mcanismes jouant un rle cl dans limmunodominance de la glycoprotine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont galement rvles que diverses voies autophagiques peuvent tre induites pour favoriser la capture slective de protines virales, faonnant de faon dynamique la nature de la rponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des mthodes de protomique quantitative a jou un rle cl dans l'identification et la quantification des protines ayant des rles importants dans la rgulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou dinfection virale. En outre, notre approche de biologie des systmes, qui combine la protomique quantitative base sur la spectromtrie de masse avec des essais fonctionnels tels la prsentation antignique, nous a permis dacqurir de nouvelles connaissances sur les mcanismes molculaires rgissant les fonctions de l'autophagie lors de la prsentation antignique. Une meilleure comprhension de ces mcanismes permettra de rduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite l'infection virale ou lors du dveloppement du cancer en mettant en place une rponse immunitaire approprie.
Resumo:
Un dsquilibre de la balance nergtique constitue la principale cause du dveloppement des pathologies mtaboliques telles que lobsit et le diabte de type 2. Au sein du cerveau, lhypothalamus joue un rle primordial dans le contrle de la prise alimentaire et du mtabolisme priphrique via le systme nerveux autonome. Ce contrle, repose sur lexistence de diffrentes populations neuronales au sein de lhypothalamus mdio-basal (MBH), neurones neuropeptide Y (NPY)/Agouti-related peptide (AgRP), et neurones a proopiomelanocortine (POMC), dont lactivit est directement module par les variations des taux circulants des nutriments tels que le glucose et les acides gras (FA). Alors que les mcanismes de dtection et le mtabolisme intracellulaire du glucose ont t largement tudis, limplication du mtabolisme intracellulaire des FA dans leurs effets centraux, est trs peu comprise. De plus, on ignore si le glucose, module le mtabolisme intracellulaire des acides gras longue chaine (LCFA) dans le MBH. Le but de notre premire tude est, de dterminer l'impact du glucose sur le mtabolisme des LCFA, le rle de lAMP-activated protein kinase (AMPK), kinase dtectrice du statut nergtique cellulaire, et d'tablir sil y a des changements dans le mtabolisme des LCFA en fonction de leur structure, du type cellulaire et de la rgion crbrale. Nos rsultats montrent que le glucose inhibe l'oxydation du palmitate via lAMPK dans les neurones et les astrocytes primaires hypothalamiques, in vitro, ainsi que dans les explants du MBH, ex vivo, mais pas dans les astrocytes et les explants corticaux. De plus, le glucose augmente l'estrification du palmitate et non de lolate dans les neurones et les explants du MBH, mais pas dans les astrocytes hypothalamiques. Ces rsultats dcrivent le devenir mtabolique de diffrents LCFA dans le MBH, ainsi que, la rgulation AMPK - dpendante de leur mtabolisme par le glucose dans les astrocytes et les neurones, et dmontrent pour la premire fois que le mtabolisme du glucose et des LCFA est coupl spcifiquement dans les noyaux du MBH, dont le rle est critique pour le contrle de l'quilibre nergtique. Le deuxime volet de cette thse sest intress dterminer les mcanismes intracellulaires impliqus dans le rle de la protine de liaison ACBP dans le mtabolisme central des FA. Nous avons dmontr que le mtabolisme de lolate et non celui du palmitate est dpendant de la protine ACBP, dans les astrocytes hypothalamiques ainsi que dans les explants du MBH. Ainsi, nos rsultats dmontrent quACBP, protine identifie originellement au niveau central, comme un modulateur allostrique des rcepteurs GABA, agit comme un rgulateur du mtabolisme intracellulaire des FA. Ces rsultats ouvrent de nouvelles pistes de recherche lies la rgulation du mtabolisme des acides gras au niveau central, ainsi que, la nouvelle fonction de la protine ACBP dans la rgulation du mtabolisme des FA au niveau du systme nerveux central. Ceci aiderait identifier des cibles molculaires pouvant contribuer au dveloppement de nouvelles approches thrapeutiques de pathologies telles que lobsit et le diabte de type 2.
Resumo:
Les opiodes sont les analgsiques les plus puissants mais leur utilisation prolonge peut entraner le dveloppement dune tolrance analgsique. La tolrance serait en partie associe linhibition prolonge de ladnosine monophosphate cyclique (AMPc) entranant des changements compensatoires dans la voie de ladnylate cyclase. Pour cette tude, nous avons eu recours un biosenseur base sur la technologie de Bioluminescence Resonnance Energy Transfer (BRET) et qui fournit des mesures de lAMPc en fonction du temps rel. Durant les 15 premires minutes de stimulation, la rponse de lAMPc est bi-phasique. Cette progression de la rponse lAMPc nest pas la mme pour tous les ligands. Par exemple, la deltorphine II qui induit linternalisation du rcepteur opiode delta (DOR) affiche une baisse de linhibition de lAMPc. linverse la morphine qui ninduit pas linternalisation du DOR affiche une rponse stable linhibition de lAMPc. Ainsi le profil dinternalisation permet de prdire la progression de linhibition de lAMPc court terme (15 minutes). Nous avons aussi mesur la rponse lAMPc durant 30, 60 et 120 min, tant donn quun traitement chronique aux opiodes induit une tolrance analgsique. Selon les rsultats obtenus, le profil dinternalisation du DOR induits par les ligands ne permet pas dexpliquer linhibition persistante de lAMPc.
Resumo:
La prsente tude sinscrit dans une ligne de travaux de recherche en traductologie raliss dans un cadre de smantique cognitive et visant dgager les modes de conceptualisation mtaphorique dans les domaines de spcialit, et plus prcisment dans les sciences biomdicales. Notre tude se concentre sur les modes de conceptualisation mtaphorique utiliss en neuroanatomie en franais, en anglais et en allemand, dans une perspective dapplication la traduction. Nous nous penchons plus spcifiquement sur la description anatomique de deux structures du systme nerveux central : la moelle spinale et le cervelet. Notre objectif est de reprer et de caractriser les indices de conceptualisation mtaphorique (ICM). Notre mthode s'appuie sur un corpus trilingue de textes de rfrence traitant de ces structures et fait appel une annotation smantique en langage XML, ce qui autorise une interrogation des corpus annots au moyen du langage XQuery. Nous mettons en vidence que les ICM jouent un rle prdominant dans la phrasologie et les dnominations propres la description anatomique du systme nerveux, comme c'est le cas en biologie cellulaire et en anatomie des muscles, des nerfs priphriques et des vaisseaux sanguins. Sous langle lexical, il faut distinguer les ICM prdicatifs, les ICM non prdicatifs ainsi que les ICM quasi prdicatifs. La plupart des modes de conceptualisation mtaphorique pralablement reprs en biologie cellulaire et en anatomie sont galement prsents dans le domaine plus spcifique de la neuroanatomie. Certains ICM et modes de conceptualisation sont toutefois spcifiques des lments des rgions tudies. Par ailleurs, les modes de conceptualisation mtaphorique en franais, en anglais et en allemand sont semblables, mais sont exprims par des rseaux lexicaux d'ICM dont la richesse varie. De plus, la composition nominale tant une des caractristiques de l'allemand, la forme linguistique des ICM prsente des caractristiques spcifiques. Nos rsultats mettent en vidence la richesse mtaphorique de la neuroanatomie. Cohrents avec les rsultats des tudes antrieures, ils enrichissent cependant la typologie des ICM et soulignent la complexit, sur les plans lexical et cognitif, de la mtaphore conceptuelle.
Resumo:
La division cellulaire asymtrique (DCA) consiste en une division pendant laquelle des dterminants cellulaires sont distribus prfrentiellement dans une des deux cellules filles. Par laction de ces dterminants, la DCA gnrera donc deux cellules filles diffrentes. Ainsi, la DCA est importante pour gnrer la diversit cellulaire et pour maintenir lhomostasie de certaines cellules souches. Pour induire une rpartition asymtrique des dterminants cellulaires, le positionnement du fuseau mitotique doit tre trs bien contrl. Frquemment ceci gnre deux cellules filles de tailles diffrentes, car le fuseau mitotique nest pas centr pendant la mitose, ce qui induit un positionnement asymtrique du sillon de clivage. Bien quun complexe impliquant des GTPases htrotrimriques et des protines liant les microtubules au cortex ait t impliqu directement dans le positionnement du fuseau mitotique, le mcanisme exact induisant le positionnement asymtrique du fuseau durant la DCA n'est pas encore compris. Des tudes rcentes suggrent quune rgulation asymtrique du cytosquelette dactine pourrait tre responsable de ce positionnement asymtrique du faisceau mitotique. Donc, nous mettons l'hypothse que des contractions asymtriques dactine pendant la division cellulaire pourraient dplacer le fuseau mitotique et le sillon de clivage pour crer une asymtrie cellulaire. Nos rsultats prliminaires ont dmontr que le blebbing cortical, qui est une indication de tension corticale et de contraction, se produit prfrentiellement dans la moiti antrieure de cellule prcurseur dorganes sensoriels (SOP) pendant le stage de tlophase. Nos donnes soutiennent l'ide que les petites GTPases de la famille Rho pourraient tre impliqus dans la rgulation du fuseau mitotique et ainsi contrler la DCA des SOP. Les paramtres exprimentaux dvelopps pour cette thse, pour tudier la rgulation de lorientation et le positionnement du fuseau mitotique, ouvrirons de nouvelles avenues pour contrler ce processus, ce qui pourrait tre utile pour freiner la progression de cellules cancreuses. Les rsultats prliminaires de ce projet proposeront une manire dont les petites GTPases de la famille Rho peuvent tre impliqus dans le contrle de la division cellulaire asymtrique in vivo dans les SOP. Les modles thoriques qui sont expliqus dans cette tude pourront servir amliorer les mthodes quantitatives de biologie cellulaire de la DCA.
Resumo:
La concentration locale des messagers chimiques secretes par les cellules peut etre mesuree afin de mieux comprendre les mecanismes moleculaires lies a diverses maladies, dont les metastases du cancer. De nouvelles techniques analytiques sont requises pour effectuer ces mesures locales de marqueurs biologiques a proximite des cellules. Ce memoire presentera le developpement dune nouvelle technique basee sur la reponse plasmonique sur des leviers AFM, permettant detudier les reactions chimiques et biologiques a la surface des leviers grace au phenomene de resonance des plasmons de surface (SPR), ainsi qua la diffusion Raman exaltee par effet de pointe (TERS). En effet, il est possible de localiser lamplification du signal Raman a la pointe dun levier AFM, tout comme le principe de la diffusion Raman exaltee par effet de surface (SERS) basee sur la diffusion de la lumiere par des nanoparticules metalliques, et permettant une large amplification du signal Raman. La surface du levier est recouverte dune nano-couche metallique dor, suivi par des reactions biologiques pour limmobilisation dun recepteur moleculaire, creant ainsi un biocapteur sur la pointe du levier. Une detection secondaire utilisant des nanoparticules dor conjuguees a un anticorps secondaire permet egalement une amplification du signal SPR et Raman lors de la detection dantigene. Ce memoire demontrera le developpement et la validation de la detection de limmunoglobuline G (IgG) sur la pointe du levier AFM.Dans des projets futurs, cette nouvelle technique dinstrumentation et dimagerie sera optimisee grace a la creation dun micro-detecteur proteique generalement adapte pour letude de la communication cellulaire. En integrant le signal SPR a la microscopie AFM, il sera alors possible de developper des biocapteurs SPR couples a une sonde a balayage, ce qui permettra deffectuer une analyse topographique et de lenvironnement chimique dechantillons cellulaires en temps reel, pour la mesure des messagers moleculaires secretes dans la matrice extracellulaire, lors de la communication cellulaire.
Resumo:
Les tests PAMPA et les tests Caco-2 sont des essais in vitro de lvaluation de la permabilit intestinale des mdicaments. Ils sont raliss lors de la phase de dcouverte du mdicament. Les tests PAMPA ne sont pas biologiquement reprsentatifs de la paroi intestinale, mais ils sont rapides et peu coteux. Les tests Caco-2 ncessitent plus de 21 jours pour la culture cellulaire et des installations spcifiques sont requises. Ils sont constitus dune monocouche dentrocytes confluence et donc plus biologiquement reprsentatifs. Il y a un besoin pour le dveloppement dun essai qui est biologiquement reprsentatif de la membrane intestinale humaine, rapide et peu coteux. Le premier but de ce projet tait de dvelopper une mthode analytique qui permettrait lvaluation simultane de huit mdicaments tmoins utiliss pour la validation de lessai de permabilit. Le deuxime but de ce projet tait donc damliorer la membrane des tests PAMPA pour proposer un nouveau test : le noPAMPA. Contrairement au test PAMPA traditionnel, cette membrane est constitue de trois composantes : (1) un filtre poreux qui agit titre de support, (2) un coussin polydopamine charg ngativement qui sert dancrage et qui assure la fluidit de la bicouche et (3) une bicouche lipidique forme par fusion de vsicules. Une mthode analytique HPLC-MS/MS a t valide selon les spcifications de la FDA et de la EMA. Cette mthode a permis de quantifier simultanment les huit mdicaments standards utiliss pour le test noPAMPA. Le test PAMPA traditionnel a t mis en place titre dessai control. Les coefficients de permabilit mesurs pour les huit mdicaments au travers de la membrane PAMPA comparaient favorablement aux rsultats de la littrature. Les composantes de la membrane noPAMPA ont t optimises. Les conditions optimales retenues taient les filtres de polycarbonate hydrophile ayant des pores de 15 nm, les plaques Costar 12 puits comme dispositif des tests de permabilit, une bicouche lipidique compose de 70 % DOPC et de 30 % cholestrol cationique ainsi quune dposition des liposomes en prsence de 150 mM NaCl suivi dun quilibre d1 h en prsence dune solution sature en DOPC. Les stabilits de la cassette de mdicaments et des liposomes sont insuffisantes pour le conditionnement commercial des membranes noPAMPA. Les diffrentes optimisations ralises ont permis damliorer la membrane noPAMPA sans toutefois la rendre fonctionnelle. La membrane noPAMPA nest toujours pas en mesure de discriminer des molcules en fonction de leur permabilit attendue.
Resumo:
Laquaporine-2 (AQP2) est le canal responsable de la rabsorption finale deau au niveau du tubule collecteur du rein. la base, contenue dans des vsicules internes, lAQP2 est achemine la membrane apicale des cellules principales du tubule collecteur suite une stimulation par lhormone antidiurtique (ADH). Lincapacit accomplir cette fonction entrane le diabte insipide nphrognique (DIN), une maladie caractrise par linhabilet du rein concentrer lurine, entranant une production de volumes urinaires levs. Alors que les mutations rcessives gnrent des protines mal structures et incapables de former des ttramres, les mutations dominantes sont capables de sassocier leurs homologues sauvages, engendrant ainsi un DIN mme chez les patients htrozygotes. Ce mmoire prsente lanalyse biochimique et fonctionnelle dune nouvelle mutation naturelle de lAQP2, la mutation T179N, aussi responsable du DIN. Cette dernire est particulirement intressante de par son gnotype qui implique un caractre dominant, et sa position extracellulaire habituellement rserve aux mutations rcessives. Les tudes comparatives de T179N deux modles de mutation rcessive et dominante dmontrent, tant en ovocytes de Xenopus laevis quen ligne cellulaire mpkCCDc14, le caractre rcessif de cette nouvelle mutation. Les tests dimmunobuvardage de lysats dovocytes en membranes totales et membranes plasmiques purifies ont rvl que seule la forme sauvage atteint la membrane plasmique alors que le mutant T179N est squestr dans la cellule. En accord avec ce rsultat, les analyses de permabilit fonctionnelle dmontrent aussi une absence dactivit pour T179N. En cellule mpkCCDc14, le mutant T179N exprim seul natteint pas la membrane plasmique suite laction de la forskoline, contrairement la forme sauvage. Cependant, ce mutant peut sassocier son homologue sauvage en coexpression tant dans les ovocytes quen ligne mpkCCDc14 sans toutefois engendrer leffet typique de dominance ngative. En fait, dans ce contexte de coexpression, on remarque une augmentation de la Pf de 837 % et une rcupration dadressage la membrane plasmique en cellule (immunofluorescence). En conclusion, T179N serait un mutant rcessif fonctionnellement rcuprable lorsquen prsence de lAQP2 sauvage.
Resumo:
Le cycle cellulaire est hautement rgul par la phosphorylation rversible de plusieurs effecteurs. La kinase dpendante des cyclines Cdk1 dclenche la mitose en induisant le bris de lenveloppe nuclaire, la condensation des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. Chez les animaux mtazoaires, ces vnements sont contrs par la protine phosphatase PP2A-B55, qui dphosphoryle plusieurs substrats de Cdk1. La kinase Greatwall (Gwl) est active par le complexe cycline B-Cdk1 en dbut de mitose et induit ensuite linhibition de PP2A-B55 via Endos/Arpp19. Toutefois, les mcanismes molculaires qui rgulent Gwl sont encore peu connus. Nous avons montr que Gwl a une activit sopposant PP2A-B55, qui collabore avec la kinase Polo pour assurer lattachement du centrosome au noyau et la progression du cycle cellulaire dans le syncytium de lembryon de la drosophile. Ensuite, nous avons trouv dans des cellules de drosophile que Gwl est localise au noyau pendant linterphase, mais quelle se relocalise au cytoplasme ds la prophase, avant le bris de lenveloppe nuclaire. Nous avons montr que cette translocation de Gwl est cruciale pour sa fonction et quelle dpend de la phosphorylation de plusieurs rsidus de la rgion centrale de Gwl par les kinases Polo et Cdk1. Cette rgion centrale contient galement deux squences de localisation nuclaire (respectivement NLS1 et NLS2). De plus, nos rsultats suggrent que la phosphorylation de Gwl par la kinase Polo promeut sa liaison avec la protine 14-3-3, ce qui favorise la rtention cytoplasmique de Gwl. Le rle de Cdk1 dans cette translocation reste quant lui inconnu. De plus, nous avons montr que le complexe cycline B-Cdk1 entre dans le noyau avant que Gwl ne soit transporte dans le cytoplasme. Cdk1 pourrait donc activer Gwl et phosphoryler ses substrats nuclaires, labri de PP2A-B55 qui est largement cytoplasmique. Gwl est ensuite exclue du noyau et relocalise dans le cytoplasme afin dinduire linhibition de PP2A-B55. Cela permet de synchroniser les vnements de phosphorylation se produisant dans le noyau et dans le cytoplasme. Fait intressant, un mcanisme de rgulation de la localisation de Gwl similaire cela a t dcouvert chez lhumain et chez la levure, suggrant que ce mcanisme est conserv entre diffrentes espces.
Resumo:
Connue pour son rle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protase srine, peut galement agir par lintermdiaire de PAR1, un rcepteur activ par protase et coupl aux protines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive lextrmit N-terminale du PAR1 entre lArg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrmit terminale qui agit elle-mme comme un ligand. La thrombine et une squence peptidique de cinq acides amins, compose des rsidus Ser42 Arg46, nomme PAR1-AP, dclenchent dans diverses cellules de mammifres une rponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette tude, le systme dexpression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le rcepteur PAR1 du rat la surface de ces cellules et de raliser son couplage fonctionnel leur signalisation intracellulaire (modle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en rponse au PAR1-AP, a ensuite t tudie en dtail laide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres lments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP dclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi dun plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. laide dinhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifdipine et le D-600, l'entre du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibe, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. Linhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la rponse au PAR1-AP aprs puisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de faon discordante quant linhibition de la libration de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La rponse PAR1-AP nest pas affecte par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase . Linhibition de la protine kinase C (PKC) par le bisindolylmalimide induit des oscillations en prsence de Ca2+ extracellulaire et attnue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En prsence de Ca2+ extracellulaire, lactivation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la rponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protine kinase A (PKA), cause une prolongation de la dure du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la rponse PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dpourvu de Ca2+. Les rsultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modle rPAR1-Sf9.
Resumo:
La rapamycine est un immunosuppresseur utilis pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par linhibition de la voie de Tor mne des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit une altration rapide et globale de lexpression gnique, dclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rle crucial dans le remodelage de la chromatine en rponse la rapamycine. Notre objectif principal est didentifier dune banque de mutants dhistone les variantes qui vont chouer rpondre la rapamycine dans une tentative de raliser une caractrisation des modifications dhistone critiques pour la rponse cette drogue. Ainsi, nous avons ralis un criblage dune banque de mutants dhistone et identifi plusieurs mutants dhistone dont la rsistance la rapamycine a t altre. Nous avons caractris une de ces variantes dhistone, savoir H2B, qui porte une substitution de lalanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et dmontr que ce mutant est extrmement rsistant la rapamycine, et non dautres drogues. Des immunoprcipitations ont dmontr que H2B-R95A est dfectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la rplication et la transcription par les ADN et ARN polymrases, respectivement. Des expriences de ChIP-Chip et de micropuce ont dmontr que larginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre lexpression dune multitude de gnes, dont certains font partie de la voie des phromones. Des vidences seront prsentes pour la premire fois dmontrant que la rapamycine peut activer la voie des phromones et quune dfectuosit dans cette voie cause la rsistante cette drogue.
Resumo:
Le Cancer du Col Utrin (CCU) chez la femme est provoqu par le virus oncognique VPH. La mtastase lymphatique ganglionnaire est un facteur pronostique majeur pour lvolution de ce cancer et sa prsence influence la dcision thrapeutique. En gnral, lenvahissement ganglionnaire est diagnostiqu par histologie, mais cette mthode est laborieuse et parfois prise en dfaut pour dtecter les micromtastases et les cellules cancreuses isoles et pour donner des rsultats rapides en per opratoire. Loutil molculaire que nous dsirons dvelopper pour combler cette lacune est bas sur une analyse dARN des gnes du VPH exprims par les cellules du CCU. Ceci sera fait par transcription rverse de lARN cellulaire coupl une raction quantitative en chaine par polymrase en temps rel (RT-qPCR). Cette technique devrait nous permettre une dtection et une valuation rapide des micromtastases pour aider dterminer immdiatement un pronostic fiable et la thrapie associe. Cest un test prcis, sensible et rapide pour dtecter un envahissement ganglionnaire dans le CCU visant amliorer la gestion thrapeutique. Le projet est bas sur trois objectifs. En premier lieu, valider les marqueurs molculaires E6 et E7 de VPH16 et 18 partir des chantillons frais et des chantillons fixs dans des blocs de paraffine. En deuxime lieu, dterminer la fiabilit et la sensibilit des marqueurs pour la dtection des macromtastases, des micromtastases et les cellules tumorales isoles en utilisant la technique de RT-qPCR. En troisime lieu et paralllement au travail prsent dans ce mmoire, il est ncessaire de constituer une base de donnes des patientes qui ont le virus VPH16 et 18 intgr dans leur gnome, qui ont t traites et dont nous connaissons dj le diagnostic final afin de valider la mthode (biobanque). Nous avons russi extraire de lARNm de haute qualit partir dchantillons complexes, dtecter les gnes E6 et E7 de VPH16 et 18 en RT-qPCR, et dterminer prcisment la limite de dtection de E6 et E7 dans les chantillons frais qui est une proportion de 0,008% de cellules cancreuses. Dans les chantillons fixs dans la paraffine, cette limite est de 0,02% et 0,05% pour E6-E7-VPH16 et E6-E7-VPH18 respectivement. Ceci comparativement une limite de dtection histologique de 1% qui est dtermine par immunohistochimie de CK19. Enfin, notre protocole est valid pour VPH18 dans les ganglions lymphatiques du CCU.
