790 resultados para signalisation cellulaire
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La localisation des ARNm par transport dirig joue un rle dans le dveloppement, la motilit cellulaire, la plasticit synaptique et la division cellulaire asymtrique. Chez la levure Saccharomyces cerevisi, la localisation dARNm est un phnomne dont les mcanismes de rgulation sont conservs auprs de nombreux autres organismes. Lors de la division de la levure, plus dune trentaine de transcrits sont localiss par transport actif lextrmit du bourgeon de la cellule-fille. Parmi ceux-ci, lARNm ASH1 est le mieux caractris et constitue le modle utilis dans cette tude. Pour exercer sa fonction, la protine Ash1 doit tre produite uniquement aprs la localisation de lARNm ASH1. Pour ce faire, les mcanismes de rgulation de la traduction de lARNm ASH1 empchent son expression durant le transport. Ce projet de recherche vise tudier les mcanismes de rgulation de la traduction de lARNm ASH1 par les rpresseurs traductionnels connus, soit Khd1, Puf6 et Loc1. Les tudes antrieures se sont penches sur ces facteurs de manire individuelle. Cependant, dans cette tude, nous avons explor la prsence dune collaboration entre ceux-ci. Ainsi, nous avons voulu dterminer si les rpresseurs traductionnels peuvent tre intgrs en une seule voie de rgulation de la traduction de lARNm ASH1. De plus, nous avons cherch identifier le mcanisme de recrutement des rpresseurs traductionnels sur lARNm ASH1, qui correspond au point initial des voies de rgulations de lARNm ASH1. Nos rsultats montrent que les rpresseurs traductionnels de lARNm ASH1, soit Khd1 et Puf6, font partie dune mme voie de rgulation de la traduction. Le rle du facteur nuclaire Loc1 dans la voie de rgulation de la traduction, quant elle, a t examine partir dexpriences permettant ltude du mcanisme de recrutement des rpresseurs traductionnels dans le noyau. Ainsi, nos travaux montrent que Puf6 et Loc1 sont associs de manire ARN-dpendant avec la machinerie de transcription, notamment au facteur dlongation de la transcription Spt4-Spt5/DSIF. Par ailleurs, notre laboratoire a prcdemment montr que la localisation nuclaire de la protine de liaison lARN She2 est essentielle au recrutement des facteurs Loc1 et Puf6 sur lARNm ASH1. Des expriences dimmunoprcipitation de la chromatine (ChIP) supportent lhypothse que le recrutement de Loc1 est essentiel celui de Puf6, qui seffectue ultrieurement. Ainsi, partir des rsultats de cette tude et des rsultats publis prcdemment dans notre laboratoire, nous avons labor un modle de recrutement coordonn des facteurs She2, Loc1 et Puf6 sur lARNm ASH1 naissant. De manire gnrale, cette tude a permis dtablir la prsence dune seule voie de rgulation de la traduction de lARNm ASH1 et une meilleure connaissance du recrutement des facteurs de rpression traductionnelle sur celui-ci.
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Le centromre est la rgion chromosomique o le kintochore s'assemble en mitose. Contrairement certaines caractristiques gniques, la squence centromrique n'est ni conserve entre les espces ni suffisante la fonction centromrique. Il est donc bien accept dans la littrature que le centromre est rgul pigntiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18 et Mis18 sont des protines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthtis aux centromres. Des vidences exprimentales dmontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison l'ADN nomm Myb, est la protine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromres en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromres n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont t identifis par des expriences d'immunoprcipitation suivies d'une analyse en spectromtrie de masse. Un rle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthtis aux centromres a t attribu MgcRacGAP, une des 60 protines identifies par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont t dmontres comme tant requises pour la stabilit de CENP-A incorpor aux centromres. Ces diffrentes observations ont men l'identification d'une troisime tape au niveau molculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthtis en phase G1, celle de la stabilit de CENP-A nouvellement incorpor aux centromres. Cette tape est importante pour le maintien de l'identit centromrique chaque division cellulaire. Pour caractriser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthtis aux centromres, une technique de microscopie haute rsolution couple une quantification d'image a t utilise. Les rsultats gnrs dmontrent que le recrutement de KNL-2 au centromre est rapide, environ 5 minutes aprs la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nmatode C. elegans a t rsolue par RMN et celle-ci dmontre un motif hlice-tour-hlice, une structure connue pour les domaines de liaison l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune squence n'est reconnue spcifiquement par ces domaines. Cependant, il a t possible de dmontrer que ces deux domaines lient prfrentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement la chromatine H2B-GFP par un essai modifi de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnatre de faon spcifique la chromatine centromrique. Finalement, l'lment reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement t identifi. En effet, il a t dmontr que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprims dans les cellules HeLa, mais plutt avec les corps nuclaires PML, des structures nuclaires composes d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromriques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spcifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthtis uniquement aux rgions centromriques.
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Chez les humains, un large pourcentage de leucmies mylodes et lymphodes exprime des gnes Homobox (Hox) de faon aberrante, principalement ceux du groupe des gnes Hoxa. Cette drgulation de lexpression des gnes Hox peut provenir directement des translocations impliquant des gnes Hox ou indirectement par dautres protines ayant un potentiel oncognique. De plus, plusieurs tudes indiquent que les gnes Hox jouent un rle essentiel dans l'initiation de diverses leucmies. Comprendre le fonctionnement des gnes Hox dans l'hmatopose normale est donc une condition pralable pour lucider leurs fonctions dans les leucmies, ce qui pourrait ventuellement conduire llaboration de nouveaux traitements contre cette maladie. Plusieurs tudes ont tent dlucider les rles exacts des gnes Hox dans l'hmatopose via lutilisation de souris mutantes pour un seul gne Hox. Or, en raison du phnomne de redondance fonctionnelle chez cette famille de gnes, ces tudes ont t peu concluantes. Il a t prcdemment dmontr que dans une population de cellules enrichies en cellules souches hmatopotiques (CSH), les gnes du cluster Hoxa sont plus exprims que les gnes Hox des autres clusters. Aussi, il a t tabli que les gnes du cluster Hoxb sont non essentiels lhmatopose dfinitive puisque les CSH mutantes pour les gnes Hoxb1-9 conservent leur potentiel de reconstitution long terme. En nous basant sur ces donnes, nous avons mis l'hypothse suivante : les gnes Hoxa sont essentiels pour l'hmatopose normale adulte. Pour tester notre hypothse, nous avons choisi dutiliser un modle de souris comportant une dltion pour lensemble des gnes Hoxa. Dans le cadre de cette recherche, nous avons dmontr que les CSH, les progniteurs primitifs et les progniteurs des cellules B sont particulirement sensibles au niveau d'expression des gnes Hoxa. Plus particulirement, une baisse de la survie et une diffrenciation prmature semblent tre lorigine de la perte des CSH Hoxa-/- dans la moelle osseuse. Lanalyse du profil transcriptionnel des CSH par squenage de l'ARN a rvl que les gnes Hoxa sont capables de rguler un vaste rseau de gnes impliqus dans divers processus biologiques. En effet, les gnes Hoxa rgulent lexpression de plusieurs gnes codant pour des rcepteurs de cytokine. De plus, les gnes Hoxa influencent lexpression de gnes jouant une fonction dans larchitecture de la niche hmatopotique. Lexpression de plusieurs molcules dadhsion est aussi module par les gnes Hoxa, ce qui peut affecter la relation des CSH avec la niche hmatopotique. Lensemble de ces rsultats dmontre que les gnes Hoxa sont d'importants rgulateurs de l'hmatopose adulte puisquils sont ncessaires au maintien des CSH et des progniteurs grce leurs effets sur plusieurs processus biologiques comme l'apoptose, le cycle cellulaire et les interactions avec la niche.
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La plasticit synaptique activit-dpendante forme la base physiologique de lapprentissage et de la mmoire dpendants de lhippocampe. Le rle jou par les diffrents sous-types dinterneurones dans lapprentissage et la mmoire hippocampiques reste inconnu, mais repose probablement sur des mcanismes de la plasticit spcifique aux synapses de certains sous-types dinterneurones. Les synapses excitatrices tablies sur les interneurones de loriens-alveus dans laire CA1 exhibent une forme persistante de potentialisation long terme induite par la stimulation chimique des rcepteurs mtabotropiques du glutamate de type 1 (mGluR1) [mGluR1-mediated chemical late long-term potentiation (cL-LTPmGluR1)]. Le prsent projet de recherche avait pour objectifs didentifier les sous-types dinterneurones de loriens-alveus exprimant la cL-LTPmGluR1 et dexaminer les mcanismes dinduction et dexpression de celle-ci. Nous avons dtermin que la stimulation rpte des mGluR1 induit de la cL-LTPmGluR1 aux synapses excitatrices tablies sur le sous-type dinterneurones exprimant le peptide somatostatine (SOM-INs). Des enregistrements lectrophysiologiques coupls des inhibiteurs pharmacologiques et un knock-out fonctionnel de mammalian target of rapamycin complexe 1 (mTORC1) ont montr que linduction de la cL-LTPmGluR1 (qui consiste en trois applications de lagoniste des mGluR1/5, le (S)-3,5-dihydroxyphnylglycine (DHPG) en prsence de lantagoniste des rcepteurs mtabotropiques du glutamate de type 5 (mGluR5), le 2-mthyl-6-(phnylthynyl)-pyridine (MPEP)) des SOM-INs requiert les voies de signalisation des mGluR1, de extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) et de mTORC1. Lensemble de nos rsultats montre quune forme persistante de plasticit synaptique sous-tendue par mTORC1 est induite par la stimulation rpte des mGluR1 dans les interneurones hippocampiques exprimant le peptide somatostatine. La connaissance des mcanismes sous-tendant la cL-LTPmGluR1, couple lutilisation de modles animal in vivo, rendront maintenant possible le blocage de la cL-LTPmGluR1 dans les SOM-INs et lexamen de son rle dans lapprentissage et la mmoire dpendants de lhippocampe.
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Le Costimulateur Inductible (ICOS) est un rcepteur exprim la surface des cellules T CD4 auxiliaires et T CD8 cytotoxiques. Il fut dmontr laide de modles murins de transplantation de moelle osseuse que ICOS joue un rle important dans linduction de la maladie du greffon contre lhte aigue (GVHD). ICOS potentialise deux signaux mdis par le rcepteur de cellules T (TCR) : lactivation de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ainsi que la mobilisation interne de calcium. En conditions in vitro, dans les cellules CD4 et CD8, ICOS russi potentialiser le flux de calcium mdi par le TCR indpendamment de PI3K. La voie de signalisation de ICOS implique dans la GVHD demeure inconnue. Cependant, en utilisant une ligne de souris knock-in nomme ICOS-Y181F, dans laquelle le cellules T ont slectivement perdu la capacit dactiver PI3K par lentremise dICOS, nous avons dmontr que les cellules T peuvent utiliser un mcanisme ICOS indpendant de PI3K afin dinduire la GVHD. La mobilisation interne du Ca2+ mne lactivation de NFAT, un facteur de transcription cl rgulant des gnes comme IFN-, qui exprime une des cytokines cls impliques dans la GVHD. Nous mettons comme hypothse que la capacit pathognique intacte des cellules T ICOSY181F induire la GVHD, repose sur la signalisation du Ca2+ indpendante de PI3K. Le but de mon projet est didentifier les rsidus responsables de cette signalisation de Ca2+ mdie par ICOS ainsi que le mcanisme par lequel ce rcepteur fonctionne. laide de la mutagnse dirige, jai gnr des mutants dICOS et jai analys par cytomtrie en flux leur capacit activer le flux de Ca2+. Jai ainsi identifi un groupe de lysine sur la queue cytoplasmique dICOS situ proximit de la membrane comme tant essentiel la fonction de potentialisation du flux de Ca2+. Je fournis galement des preuves de limplication de la kinase Lck, membre de la famille de kinases Src, dans la voie de signalisation de ICOS mdiant la potentialisation du flux de Ca2+. Ainsi, ICOS sassocie Lck et mne une augmentation de lactivation de PLC1, la protine effectrice cl causant la sortie de Ca2+ de la rserve intracellulaire. En conclusion, notre tude permet de comprendre davantage une des voies de signalisation dICOS. Linflux de Ca2+ dans les cellules T implique la voie ICOS-Lck-PLC1. Une comprhension plus approfondie de cette voie de signalisation pourrait savrer bnfique afin dlaborer de nouvelles stratgies menant la prvention de maladies relies ICOS, comme la GVHD.
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L'hypertension systolique isole (HSI), amene par une augmentation de la rigidit vasculaire, est la forme d'hypertension la plus frquente chez les personnes ges de plus de 60 ans. L'augmentation de la rigidit vasculaire, cause en partie par la calcification aortique mdiale, est acclre de 15 ans chez les diabtiques. Il est suggr que la calcification aortique serait responsable de la rsistance aux agents antihypertenseurs chez les patients souffrant d'HSI, d'o la ncessit de dvelopper de nouvelles stratgies thrapeutiques ciblant la calcification artrielle. La protine Gla de la matrice (MGP) est une protine anti-calcifiante dpendante de la vitamine K, qui doit tre -carboxyle pour tre active. Deux enzymes sont responsables de la -carboxylation, soit la -glutamyl-carboxylase et la vitamine K poxyde rductase (VKOR). Plusieurs tudes rcentes ont indiqu que la calcification vasculaire semblait tre associe une rduction de la -carboxylation de la MGP, et un dficit en vitamine K. La modulation de l'expression et/ou de l'activit de la -carboxylase et de la VKOR et l'impact de cette modulation sur la -carboxylation de la MGP en prsence de diabte n'est pas connue. L'objectif principal de cette thse tait de dterminer les mcanismes impliqus dans l'acclration de la rigidit artrielle cause par la calcification des gros troncs artriels dans le diabte. Nous avons ainsi confirm, dans un modle animal de rigidit artrielle en prsence de diabte de type 1, que la -carboxylation de la MGP tait bel et bien altre au niveau aortique. En fait, nous avons dmontr que la quantit de MGP active (i.e. MGP -carboxyle, cMGP) au sein de la paroi vasculaire est diminue significativement. Paralllement, l'expression de la -carboxylase tait diminue de faon importante, alors que ni l'expression ni l'activit de la VKOR n'taient modifies. La diminution de l'expression de la -carboxylase a pu tre reproduite dans un modle ex vivo d'hyperglycmie. l'aide de ce modle, nous avons dmontr que la supplmentation en vitamine K dans le milieu de culture prvenait la diminution de l'expression de la -carboxylase, alors que les animaux diabtiques de notre modle in vivo avaient des concentrations plasmatiques de vitamine K pratiquement triples. D'autre part, l'tude des voies de signalisation impliques a rvl que la voie PKC pourrait tre responsable de l'altration de la -carboxylase. Ces rsultats gnrent de nouvelles pistes de rflexion et de nouvelles ides de recherche. Par exemple, il serait important de vrifier l'effet de la supplmentation en vitamine K dans le modle animal de rigidit artrielle en prsence de diabte pour valuer l'effet sur la -carboxylation de la MGP et par le fait mme, sur la calcification vasculaire. De plus, l'valuation de l'effet de l'administration de molcules ciblant la voie PKC chez ce mme modle animal permettrait de dterminer leur impact sur le dveloppement de la calcification vasculaire et d'valuer leur potentiel thrapeutique. Selon les rsultats de ces tudes, de nouvelles options pourraient alors tre notre disposition pour prvenir ou traiter la calcification artrielle mdiale associe au diabte, ce qui aurait pour effet de ralentir le dveloppement de la rigidit artrielle et d'ainsi diminuer le risque cardiovasculaire associ l'HSI.
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On retrouve dans le complexe Chrosomus eos-neogaeus une forme cybride ayant le gnome nuclaire de C. eos et le gnome mitochondrial de C. neogaeus. Ce modle particulier fournit une occasion unique dtudier linfluence dune mitochondrie exogne sur le mtabolisme et la physiologie d'organismes vivant en milieu naturel, et s'tant donc adapts cette situation cellulaire atypique. La mitochondrie jouant un rle fondamental vital, nous nous attendons ce que la prsence dune mitochondrie exogne chez la forme cybride ait un impact sur lexpression de son gnome et du protome qui en dcoule. Lobjectif de ce projet est dtudier les diffrences au niveau protomique entre des individus C. eos purs (forme sauvage) et des cybrides provenant d'habitats similaires afin de faire ressortir au maximum les diffrences dues la prsence de mitochondries C. neogaeus chez la forme cybride. Pour ce faire, nous avons compar les protomes des formes cybride et sauvage en utilisant l'lectrophorse en deux dimensions. Un sous-groupe de protines produisant un signal spcifique rvl par lanalyse comparative a t identifi et analys par spectromtrie de masse (LC/MS). Les rsultats indiquent que la prsence de mitochondries C. neogaeus chez le cybride influence fortement la rgulation gnique chez ce dernier. De plus, les protines identifies apportent des pistes intressantes supportant l'hypothse que la prsence de mitochondries C. neogaeus chez le cybride rendrait ce biotype plus rsistant au froid que la forme sauvage.
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La mthylation de l'ADN est une marque pigntique importante chez les mammifres. Malgr le fait que la mthylation de la cytosine en 5' (5mC) soit reconnue comme une modification pigntique stable, il devient de plus en plus reconnu qu'elle soit un processus plus dynamique impliquant des voies de mthylation et de dmthylation actives. La dynamique de la mthylation de l'ADN est dsormais bien caractrise dans le dveloppement et dans le fonctionnement cellulaire des mammifres. Trs peu est cependant connu concernant les implications rgulatrices dans les rponses immunitaires. Pour se faire, nous avons effectu des analyses du niveau de transcription des gnes ainsi que du profilage pigntique de cellules dendritiques (DCs) humaines. Ceux-ci ont t faits avant et aprs infection par le pathogne Mycobacterium tuberculosis (MTB). Nos rsultats fournissent le premier portrait gnomique du remodelage pigntique survenant dans les DCs en rponse une infection bactrienne. Nous avons constat que les changements dans la mthylation de l'ADN sont omniprsents, identifiant 3,926 rgions diffrentiellement mthyles lors des infections par MTB (MTB-RDMs). Les MTB-RDMs montrent un chevauchement frappant avec les rgions gnomiques marques par les histones associes avec des rgions amplificatrices. De plus, nos analyses ont rvles que les MTB-RDMs sont activement lies par des facteurs de transcription associs l'immunit avant mme d'tre infect par MTB, suggrant ces domaines comme tant des lments d'activation dans un tat de dormance. Nos donnes suggrent que les changements actifs dans la mthylation jouent un rle essentiel pour contrler la rponse cellulaire des DCs l'infection bactrienne.
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Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpudeficient HIV-1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with antiBST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDCbound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN1 production by pDCs in response to HIV1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV1.
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Les cortices sensoriels sont des rgions crbrales essentielles pour la perception. En particulier, le cortex visuel traite linformation visuelle en provenance de la rtine qui transite par le thalamus. Les neurones sont les units fonctionnelles qui transforment l'information sensorielle en signaux lectriques, la transfrent vers le cortex et l'intgrent. Les neurones du cortex visuel sont spcialiss et analysent diffrents aspects des stimuli visuels. La force des connections entre les neurones peut tre module par la persistance de l'activit pr-synaptique et induit une augmentation ou une diminution du signal post-synaptique long terme. Ces modifications de la connectivit synaptique peuvent induire la rorganisation de la carte corticale, cest dire la reprsentation de ce stimulus et la puissance de son traitement cortical. Cette rorganisation est connue sous le nom de plasticit corticale. Elle est particulirement active durant la priode de dveloppement, mais elle sobserve aussi chez ladulte, par exemple durant lapprentissage. Le neurotransmetteur actylcholine (ACh) est impliqu dans de nombreuses fonctions cognitives telles que lapprentissage ou lattention et il est important pour la plasticit corticale. En particulier, les rcepteurs nicotiniques et muscariniques du sous-type M1 et M2 sont les rcepteurs cholinergiques impliqus dans linduction de la plasticit corticale. Lobjectif principal de la prsente thse est de dterminer les mcanismes de plasticit corticale induits par la stimulation du systme cholinergique au niveau du tlencphale basal et de dfinir les effets sur lamlioration de la perception sensorielle. Afin dinduire la plasticit corticale, jai jumel des stimulations visuelles des injections intracorticales dagoniste cholinergique (carbachol) ou une stimulation du tlencphale basal (neurones cholinergiques qui innervent le cortex visuel primaire). J'ai analys les potentiels voqus visuels (PEVs) dans le cortex visuel primaire des rats pendant 4 8 heures aprs le couplage. Afin de prciser laction de lACh sur lactivit des PEVs dans V1, jai inject individuellement lantagoniste des rcepteurs muscariniques, nicotiniques, 7 ou NMDA avant linfusion de carbachol. La stimulation du systme cholinergique jumele avec une stimulation visuelle augmente lamplitude des PEVs durant plus de 8h. Le blocage des rcepteurs muscarinique, nicotinique et NMDA abolit compltement cette amlioration, tandis que linhibition des rcepteurs 7 a induit une augmentation instantane des PEVs. Ces rsultats suggrent que l'ACh facilite long terme la rponse aux stimuli visuels et que cette facilitation implique les rcepteurs nicotiniques, muscariniques et une interaction avec les rcepteur NMDA dans le cortex visuel. Ces mcanismes sont semblables la potentiation long-terme, vnement physiologique li lapprentissage. Ltape suivante tait dvaluer si leffet de lamplification cholinergique de lentre de linformation visuelle rsultait non seulement en une modification de lactivit corticale mais aussi de la perception visuelle. Jai donc mesur lamlioration de lacuit visuelle de rats adultes veills exposs durant 10 minutes par jour pendant deux semaines un stimulus visuel de type rseau sinusodal coupl une stimulation lectrique du tlencphale basal. Lacuit visuelle a t mesure avant et aprs le couplage des stimulations visuelle et cholinergique laide dune tche de discrimination visuelle. Lacuit visuelle du rat pour le stimulus dentrainement a t augmente aprs la priode dentrainement. Laugmentation de lacuit visuelle na pas t observe lorsque la stimulation visuelle seule ou celle du tlencphale basal seul, ni lorsque les fibres cholinergiques ont t lses avant la stimulation visuelle. Une augmentation long terme de la ractivit corticale du cortex visuel primaire des neurones pyramidaux et des interneurones GABAergiques a t montre par limmunoractivit au c-Fos. Ainsi, lorsque coupl un entrainement visuel, le systme cholinergique amliore les performances visuelles pour lorientation et ce probablement par loptimisation du processus dattention et de plasticit corticale dans laire V1. Afin dtudier les mcanismes pharmacologiques impliqus dans lamlioration de la perception visuelle, jai compar les PEVs avant et aprs le couplage de la stimulation visuelle/cholinergique en prsence dagonistes/antagonistes slectifs. Les injections intracorticales des diffrents agents pharmacologiques pendant le couplage ont montr que les rcepteurs nicotiniques et M1 muscariniques amplifient la rponse corticale tandis que les rcepteurs M2 muscariniques inhibent les neurones GABAergiques induisant un effet excitateur. Linfusion dantagoniste du GABA corrobore lhypothse que le systme inhibiteur est essentiel pour induire la plasticit corticale. Ces rsultats dmontrent que lentrainement visuel jumel avec la stimulation cholinergique amliore la plasticit corticale et quelle est contrle par les rcepteurs nicotinique et muscariniques M1 et M2. Mes rsultats suggrent que le systme cholinergique est un systme neuromodulateur qui peut amliorer la perception sensorielle lors dun apprentissage perceptuel. Les mcanismes damlioration perceptuelle induits par lactylcholine sont lis aux processus dattention, de potentialisation long-terme et de modulation de la balance dinflux excitateur/inhibiteur. En particulier, le couplage de lactivit cholinergique avec une stimulation visuelle augmente le ratio de signal / bruit et ainsi la dtection de cibles. Laugmentation de la concentration cholinergique corticale potentialise laffrence thalamocorticale, ce qui facilite le traitement dun nouveau stimulus et diminue la signalisation cortico-corticale minimisant ainsi la modulation latrale. Ceci est contrl par diffrents sous-types de rcepteurs cholinergiques situs sur les neurones GABAergiques ou glutamatergiques des diffrentes couches corticales. La prsente thse montre quune stimulation lectrique dans le tlencphale basal a un effet similaire linfusion dagoniste cholinergique et quun couplage de stimulations visuelle et cholinergique induit la plasticit corticale. Ce jumelage rpt de stimulations visuelle/cholinergique augmente la capacit de discrimination visuelle et amliore la perception. Cette amlioration est corrle une amplification de lactivit neuronale dmontre par immunocytochimie du c-Fos. Limmunocytochimie montre aussi une diffrence entre lactivit des neurones glutamatergiques et GABAergiques dans les diffrentes couches corticales. Linjection pharmacologique pendant la stimulation visuelle/cholinergique suggre que les rcepteurs nicotiniques, muscariniques M1 peuvent amplifier la rponse excitatrice tandis que les rcepteurs M2 contrlent lactivation GABAergique. Ainsi, le systme cholinergique activ au cours du processus visuel induit des mcanismes de plasticit corticale et peut ainsi amliorer la capacit perceptive. De meilleures connaissances sur ces actions ouvrent la possibilit dacclrer la restauration des fonctions visuelles lors dun dficit ou damplifier la fonction cognitive.
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Les leucmies mylodes aiges rsultent dun drglement du processus de lhmatopose et regroupent des maladies htrognes qui prsentent des profils cliniques et gntiques varis. La comprhension des processus cellulaires responsables de linitiation et du maintien de ces cancers permettrait de dvelopper des outils thrapeutiques efficaces et cibls. Au cours des dernires annes, une quantit croissante danomalies gntiques relies au dveloppement de leucmies ont t corrles une expression anormale des gnes HOX et de leurs cofacteurs MEIS et PBX. Des modles exprimentaux murins ont confirm le rle direct jou par ces protines dans le dveloppement de leucmies. En effet, la protine MEIS1 collabore avec HOXA9 dans la leucmogense et requiert pour ce faire trois domaines distincts. Deux de ces domaines sont conservs chez PREP1, un membre de la mme classe dhomoprotine que MEIS1. En utilisant une approche de gain-de-fonction, jai confirm limportance du rle jou par le domaine C-terminal de MEIS1 dans lacclration des leucmies induites par HOXA9. Jai galement montr que lactivit de ce domaine tait corrle avec une signature transcriptionnelle associe la prolifration cellulaire. Jai ensuite ralis un criblage haut dbit afin didentifier des antagonistes de linteraction MEIS-PBX, galement essentielle lacclration des leucmies HOX. cette fin, jai dvelopp un essai de transfert dnergie de rsonance de bioluminescence (BRET) permettant de dtecter la dimrisation MEIS-PBX dans les cellules vivantes. Plus de 115 000 composs chimiques ont t tests et suite une confirmation par un essai orthogonal, une vingtaine de molcules ont t identifies comme inhibiteurs potentiels. Ces composs pourront tre rapidement tests sur la prolifration de cellules leucmiques primaires dans un contexte dtude prclinique. Finalement, deux approches protomiques complmentaires ont permis didentifier des partenaires potentiels de MEIS1 et PREP1. La catgorisation fonctionnelle de ces candidats suggre un nouveau rle pour ces homoprotines dans lpissage de lARN et dans la reconnaissance de lADN mthyl.
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La division cellulaire est un processus fondamental des tres vivants. chaque division cellulaire, le matriel gntique d'une cellule mre est dupliqu et sgrg pour produire deux cellules filles identiques; un processus nomm la mitose. Tout d'abord, la cellule doit condenser le matriel gntique pour tre en mesure de sparer mcaniquement et galement le matriel gntique. Une erreur dans le niveau de compaction ou dans la dynamique de la mitose occasionne une transmission ingale du matriel gntique. Il est suggr dans la littrature que ces phnomnes pourraient caus la transformation des cellules cancreuses. Par contre, le mcanisme molculaire gnrant la coordination des changements de haut niveau de la condensation des chromosomes est encore incompris. Dans les dernires dcennies, plusieurs approches exprimentales ont identifi quelques protines conserves dans ce processus. Pour dterminer le rle de ces facteurs dans la compaction des chromosomes, j'ai effectu un criblage par ARNi coupl de l'imagerie haute-rsolution en temps rel chez l'embryon de C. elegans. Grce cette technique, j'ai dcouvert sept nouvelles protines requises pour l'assemblage des chromosomes mitotiques, incluant la Ribonuclotide rductase (RNR) et Topoisomrase II (topo-II). Dans cette thse, je dcrirai le rle structural de topo-II dans l'assemblage des chromosomes mitotiques et ces mcanismes molculaires. Lors de la condensation des chromosomes, topo-II agit indpendamment comme un facteur d'assemblage local menant par la suite la formation d'un axe de condensation tout au long du chromosome. Cette localisation est l'oppos de la position des autres facteurs connus qui sont impliqus dans la condensation des chromosomes. Ceci reprsente un nouveau mcanisme pour l'assemblage des chromosomes chez C. elegans. De plus, j'ai dcouvert un rle non-enzymatique la protine RNR lors de l'assemblage des chromosomes. Lors de ce processus, RNR est impliqu dans la stabilit des nuclosomes et alors, permet la compaction de haut niveau de la chromatine. Dans cette thse, je rapporte galement des rsultats prliminaires concernant d'autres nouveaux facteurs dcouverts lors du criblage ARNi. Le plus important est que mon analyse rvle que la dpltion des nouvelles protines montre des phnotypes distincts, indiquant la fonction de celles-ci lors de l'assemblage des chromosomes. Somme toute, je conclus que les chromosomes en mtaphase sont assembls par trois protines ayant des activits diffrentes d'chafaudage: topoisomrase II, les complexes condensines et les protines centromriques. En conclusion, ces tudes prouvent le mcanisme molculaire de certaines protines qui contribuent la formation des chromosomes mitotiques.
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CXCR4, a chemokine receptor involved in metastasis and homing of hematopoietic stem cells, signals through two major pathways: Gi and -arrestin2. -arrestin2 terminates G-protein signaling and targets the receptor to endocytosis. This project proposed to study the effect of a previously described set of CXCR4 mutants on both these signaling pathways, as well as their localization. These mutants were assayed by different Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) systems. Using these systems, we confirmed that N119S is a constitutively active mutant (CAM), spontaneously activating Gi. As well, we found that R134A is a constitutively inactive mutant (CIM), devoided of G-protein signaling, but spontaneously recruiting -arrestin2. In addition, we studied the dependency of -arrestin2 recruitment on the Gi activity. By targeting R134A and N119S with pertussis toxin, an inhibitor of the Gi activation, we showed efficient blocking of the Gi pathway, while maintaining the constitutive recruitment of -arrestin2. This demonstrated that for CXCR4, -arrestin2 recruitment is independent of the Gi pathway. Finally, two synthetic ligands of CXCR4, AMD3100 and TC14012 were tested for their ability to recruit -arrestin2. AMD3100 is a clinically approved drug used for stem cell transplantation, with considerable side effects. We found it to be an antagonist on both Gi and -arrestin2 recruitment. On the other hand, TC14012 was found to be an inverse agonist on Gi and an antagonist on -arrestin2 recruitment. Based on this finding, it would be preferable to use of TC14012 as it will further reduce any basal Gi activity, without affecting -arrestin2 recruitment. These results support the development of TC14012 for stem cell mobilization trials.
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Le virus de lhpatite C (VHC) est un virus ARN simple brin positif (ssARN) qui se replique dans le foie. Deux cents millions de personnes sont infectes par le virus dans le monde et environ 80% dentre elles progresseront vers un stade chronique de linfection. Les thrapies anti-virales actuelles comme linterfron (IFN) ou la ribavirin sont de plus en plus utilises mais ne sont efficaces que dans la moiti des individus traits et sont souvent accompagnes dune toxicit ou deffets secondaires indsirables. Le systme immunitaire inn est essentiel au contrle des infections virales. Les rponses immunitaires innes sont actives suite la reconnaissance par les Pathogen Recognition Receptors (PRRs), de motifs macromolculaires drivs du virus appels Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Bien que l'activation du systme immunitaire par l'ARN ou les protines du VHC ait t largement tudie, trs peu de choses sont actuellement connues concernant la dtection du virus par le systme immunitaire inn. Et mme si lon peut trs rapidement dceler des rponses immunes in vivo aprs infection par le VHC, laugmentation progressive et continue de la charge virale met en vidence une incapacit du systme immunitaire contrler linfection virale. Une meilleure comprhension des mcanismes dactivation du systme immunitaire par le VHC semble, par consquent, essentielle au dveloppement de stratgies antivirales plus efficaces. Dans le prsent travail nous montrons, dans un modle de cellule primaire, que le gnome ARN du VHC contient des squences riches en GU capables de stimuler spcifiquement les rcepteurs de type Toll (TLR) 7 et 8. Cette stimulation a pour consquence la maturation des cellules dendritiques plasmacytodes (pDCs), le production dinterfron de type I (IFN) ainsi que linduction de chmokines et cytokines inflammatoires par les diffrentes types de cellules prsentatrices dantignes (APCs). Les cytokines produites aprs stimulation de monocytes ou de pDCs par ces squences ssARN virales, inhibent la production du virus de faon dpendante de lIFN. En revanche, les cytokines produites aprs stimulation de cellules dendritiques mylodes (mDCs) ou de macrophages par ces mmes squences nont pas deffet inhibiteur sur la production virale car les squences ssARN virales ninduisent pas la production dIFN par ces cellules. Les cytokines produites aprs stimulation des TLR 7/8 ont galement pour effet de diminuer, de faon indpendante de lIFN, lexpression du rcepteur au VHC (CD81) sur la ligne cellulaire Huh7.5, ce qui pourrait avoir pour consquence de restreindre linfection par le VHC. Quoiquil en soit, mme si les rcepteurs au VHC comme le CD81 sont largement exprims la surface de diffrentes sous populations lymphocytaires, les DCs et les monocytes ne rpondent pas aux VHC, Nos rsultats indiquent que seuls les macrophages sont capables de reconnatre le VHC et de produire des cytokines inflammatoires en rponse ce dernier. La reconnaissance du VHC par les macrophages est lie lexpression membranaire de DC-SIGN et lengagement des TLR 7/8 qui en rsulte. Comme dautres agonistes du TLR 7/8, le VHC stimule la production de cytokines inflammatoires (TNF-, IL-8, IL-6 et IL-1b) mais ninduit pas la production dinterfron-beta par les macrophages. De manire attendue, la production de cytokines par des macrophages stimuls par les ligands du TLR 7/8 ou les squences ssARN virales ninhibent pas la rplication virale. Nos rsultats mettent en vidence la capacit des squences ssARN drives du VHC stimuler les TLR 7/8 dans diffrentes populations de DC et initier une rponse immunitaire inne qui aboutit la suppression de la rplication virale de faon dpendante de lIFN. Quoiquil en soit, le VHC est capable dchapper sa reconnaissance par les monocytes et les DCs qui ont le potentiel pour produire de lIFN et inhiber la rplication virale aprs engagement des TLR 7/8. Les macrophages possdent quant eux la capacit de reconnatre le VHC grce en partie lexpression de DC-SIGN leur surface, mais ninhibent pas la rplication du virus car ils ne produisent pas dIFN. Lchappement du VHC aux dfenses antivirales pourrait ainsi expliquer lchec du systme immunitaire inn contrler linfection par le VHC. De plus, la production de cytokines inflammatoires observe aprs stimulation in vitro des macrophages par le VHC suggre leur potentielle contribution dans linflammation que lon retrouve chez les individus infects par le VHC.
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L'longation cellulaire de cellules cultivant bout comme hyphae fongueux, inculquez hairs, des tubes de pollen et des neurones, est limit au bout de la cellule, qui permet ces cellules d'envahir l'encerclement substrate et atteindre une cible. Les cellules cultivant bout d'quipement sont entoures par le mur polysaccharide rigide qui rgule la croissance et l'longation de ces cellules, un mcanisme qui est radicalement diffrent des cellules non-walled. La comprhension du rglement du mur de cellule les proprits mcaniques dans le contrle de la croissance et du fonctionnement cellulaire du tube de pollen, une cellule rapidement grandissante d'quipement, est le but de ce projet. Le tube de pollen porte des spermatozodes du grain de pollen l'ovule pour la fertilisation et sur sa voie du stigmate vers l'ovaire le tube de pollen envahit physiquement le stylar le tissu mettant de la fleur. Pour atteindre sa cible il doit aussi changer sa direction de croissance les temps multiples. Pour valuer la conduite de tubes de pollen grandissants, un dans le systme exprimental vitro bas sur la technologie de laboratoire-sur-fragment (LOC) et MEMS (les systmes micro-lectromcaniques) ont t conus. En utilisant ces artifices nous avons mesur une varit de proprits physiques caractrisant le tube de pollen de Camlia, comme la croissance la croissance acclre, envahissante et dilatant la force. Dans une des organisations exprimentales les tubes ont t exposs aux ouvertures en forme de fente faites de l'lastique PDMS (polydimethylsiloxane) la matire nous permettant de mesurer la force qu'un tube de pollen exerce pour dilater la croissance substrate. Cette capacit d'invasion est essentielle pour les tubes de pollen de leur permettre d'entrer dans les espaces intercellulaires troits dans les tissus pistillar. Dans d'autres essais nous avons utilis l'organisation microfluidic pour valuer si les tubes de pollen peuvent s'allonger dans l'air et s'ils ont une mmoire directionnelle. Une des applications auxquelles le laboratoire s'intresse est l'enqute de processus intracellulaires comme le mouvement d'organelles fluorescemment tiquet ou les macromolcules pendant que les tubes de pollen grandissent dans les artifices LOC. Pour prouver que les artifices sont compatibles avec la microscopie optique haute rsolution et la microscopie de fluorescence, j'ai utilis le colorant de styryl FM1-43 pour tiqueter le systme endomembrane de tubes de pollen de cognassier du Japon de Camlia. L'observation du cne de vsicule, une agrgation d'endocytic et les vsicules exocytic dans le cytoplasme apical du bout de tube de pollen, n'a pas pos de problmes des tubes de pollen trouvs dans le LOC. Pourtant, le colorant particulier en question a adhr au sidewalls du LOC microfluidic le rseau, en faisant l'observation de tubes de pollen prs du difficile sidewalls cause du signal extrmement fluorescent du mur. Cette proprit du colorant pourrait tre utile de reflter la gomtrie de rseau en faisant marcher dans le mode de fluorescence.
