Algorithmes pour la reconstruction de génomes ancestraux

L’inférence de génomes ancestraux est une étape essentielle pour l’étude de l’évolution des génomes. Connaissant les génomes d’espèces éteintes, on peut proposer des mécanismes biologiques expliquant les divergences entre les génomes des espèces modernes. Diverses méthodes visant à résoudre ce problème existent, se classant parmis deux grandes catégories : les méthodes de distance et les méthodes de synténie. L’état de l’art des distances génomiques ne permettant qu’un certain répertoire de réarrangements pour le moment, les méthodes de synténie sont donc plus appropriées en pratique. Nous proposons une méthode de synténie pour la reconstruction de génomes ancestraux basée sur une définition relaxée d’adjacences de gènes, permettant un contenu en gène inégal dans les génomes modernes causé par des pertes de gènes de même que des duplications de génomes entiers (DGE). Des simulations sont effectuées, démontrant une capacité de former une solution assemblée en un nombre réduit de régions ancestrales contigües par rapport à d’autres méthodes tout en gardant une bonne fiabilité. Des applications sur des données de levures et de plantes céréalières montrent des résultats en accord avec d’autres publications, notamment la présence de fusion imbriquée de chromosomes pendant l’évolution des céréales.

Étude de la variante d’histone H2A.Z et du cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II chez Saccharomyces cerevisiae

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire.

Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) : étude de mécanismes impliqués dans la phase exsudative

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) se développe suite à une atteinte pulmonaire lésionnelle, induisant un œdème et une inflammation excessive, généralement suivis d’une réparation atypique menant à la fibrose. Malgré de signifiants progrès dans les traitements, la mortalité reste élevée : ~ 40 %. Mon hypothèse de travail est que l’atténuation de l’œdème ou de la réponse inflammatoire pourrait freiner le développement ou la sévérité de la phase exsudative. Nous avons évalué cette hypothèse à l’aide d’un modèle de phase exsudative du SDRA, i.e. instillation intra-trachéale de bléomycine, chez les souris.  La modulation des fluides alvéolaires est étudiée avec des souris transgénique (Tg) pour le canal ENaC, qui sont sensibles à la formation d’un œdème. Cependant, ces souris Tg ne sont pas plus sensibles au développement de la phase exsudative en condition lésionnelle (bléomycine). Nous avons déterminé par une étude électrophysiologique des cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT II) que ce n’est pas lié à une inhibition par la bléomycine de la fonction du canal ENaC.  Le traitement de la réponse inflammatoire associée au SDRA par des glucocorticoïdes est une thérapie potentielle mais controversée. Les glucocorticoïdes dans notre modèle murin ne réduisent pas la sévérité des lésions. Nous avons pu déterminé lors d’expériences in vitro que ce serait dû à une réduction de la capacité de réparation des AT II. En résumé :  La modulation du canal ENaC ne modifie pas le développement de la phase exsudative, suggérant que la régulation de l’œdème n’est pas suffisante pour modifier l’évolution du SDRA.  La modulation de l’inflammation par les glucocorticoïdes est ineffective, possiblement à cause d’une altération de la réparation. Mon étude suggère que le traitement de la phase exsudative du SDRA est complexe. En effet, la régulation de l’œdème ou de l’inflammation de façon isolée ne peut pas modifier l’évolution du SDRA. L'hétérogénéité des sources du SDRA et la redondance des mécanismes cellulaires impliqués dans l’évolution des lésions pulmonaires suggèrent que le traitement nécessitera une approche visant plusieurs cibles mécanistiques afin d’en accélérer la résolution.

Organisation et modulation du réseau neuronal de la respiration chez la lamproie.

Les mécanismes neuronaux contrôlant la respiration sont présentement explorés à l’aide de plusieurs modèles animaux incluant le rat et la grenouille. Nous avons utilisé la lamproie comme modèle animal nous permettant de caractériser les réseaux de neurones du tronc cérébral qui génèrent et modulent le rythme respiratoire. Nous avons d’abord caractérisé une nouvelle population de neurones, dans le groupe respiratoire paratrigéminal (pTRG), une région du tronc cérébral essentielle à la genèse du rythme respiratoire chez la lamproie. Les neurones de cette région sont actifs en phase avec le rythme respiratoire. Nous avons montré que ces neurones possèdent une arborisation axonale complexe, incluant des projections bilatérales vers les groupes de motoneurones du tronc cérébral qui activent les branchies ainsi que des connexions reliant les pTRG de chaque côté du tronc cérébral. Ces résultats montrent que le pTRG contient un groupe de cellules qui active les motoneurones respiratoires des deux côtés et qui pourrait être impliqué dans la synchronisation bilatérale du rythme respiratoire. Nous avons ensuite étudié les mécanismes neuronaux par lesquels le rythme respiratoire est augmenté en lien avec l’effort physique. Nous avons montré que la région locomotrice du mésencéphale (MLR), en plus de son rôle dans la locomotion, active les centres respiratoires pendant la nage, et même en anticipation. Les neurones de la MLR projetant vers les centres locomoteurs et respiratoires sont ségrégés anatomiquement, les neurones localisés plus dorsalement étant ceux qui possèdent des projections vers les centres respiratoires. Nous avons aboli la contribution de la partie dorsale de la MLR aux changements respiratoires en injectant des bloqueurs des récepteurs glutamatergiques localement, sur des préparations semi-intactes. Nous avons montré que lors d’épisodes de nage, une majeure partie de l’effet respiratoire est abolie par ces injections, suggérant un rôle prépondérant des neurones de cette région dans l’augmentation respiratoire pendant la locomotion. Nos résultats confirment que le rythme respiratoire est généré par une région rostrolatérale du pons de la lamproie et montrent que des connexions des centres locomoteurs arrivent directement à cette région et pourraient être impliquées dans l’augmentation respiratoire reliée à l’effort physique.

Effet du développement résidentiel sur l'habitat et la distribution des macrophytes dans les lacs des Laurentides

L’effet du développement résidentiel des bassins versants sur l’habitat et la distribution des macrophytes dans le littoral de six lacs des Laurentides a été évalué à l’aide de carottes de sédiments et de quadrats. Le développement augmente la proportion de milieux déboisés ce qui réduit l’apport en débris de bois et augmente l’érosion et les apports de nutriments dans les sédiments du littoral. Les sédiments sont plus fins, plus denses et contiennent moins de matière organique. Ces changements favorisent les macrophytes en augmentant leur couverture dans les lacs développés. La présence d’espèces submergées de macrophytes est également favorisée au détriment des espèces à feuilles flottantes, plus caractéristiques des lacs moins développés. Même si la biomasse des macrophytes est limitée dans certains lacs, celle-ci augmente dans les lacs développés et montre des signes d’un effet tampon sur les apports de nutriments. Des quantités équivalentes à des valeurs entre 35 et 230% des apports annuels de phosphore et entre 79 et 659% des apports d’azote par les résidents ont été accumulées dans les tissus des macrophytes des lacs dont le bassin versant est très déboisé. Les sédiments s’enrichissent à la sénescence des macrophytes et contiennent alors plus de nutriments que la colonne d’eau et ce, pour tous les lacs. Une présence accrue d’espèces submergées et plus de nutriments dans les tissus des macrophytes des lacs développés, jumelés à l’absence de prolifération de phytoplancton malgré un plus grand apport de nutriments, laisse penser que les lacs des Laurentides sont en état d’eutrophisation précoce.

Études génétiques moléculaires du gène de la polarité planaire SCRIBBLE1 chez les anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.

Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

Étude de la virulence et de la résistance aux antibiotiques des Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline chez le porc à l'abattoir au Québec

Depuis quelques années et dans plusieurs pays, un nouveau type de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM), le séquence type (ST) 398, a été fréquemment retrouvé chez les porcs et chez les fermiers en contact avec ces porcs. Au Canada, très peu d’informations sont disponibles concernant le SARM d’origine porcine. Une première étude dans notre laboratoire a permis de récolter 107 isolats de SARM provenant de deux abattoirs porcins du Québec. Le présent travail vise à caractériser les gènes de virulence et de résistance aux antibiotiques de ces SARM, d’étudier leur formation de biofilm en relation avec la spécificité du groupe agr et de vérifier la localisation plasmidique et la transférabilité de ces gènes à des souches de SARM d’origine humaine. Plusieurs souches ont démontré différents patrons phénotypiques de résistance aux antibiotiques. Vingt-quatre souches représentatives de ces isolats ont été soumises à une caractérisation plus approfondie par une étude génotypique en utilisant une biopuce à ADN et un grand nombre de gènes de virulence a été détecté codant pour des entérotoxines staphylococcales, des leucocidines, des hémolysines, des auréolysines, des facteurs d’immunoévasion, des superantigènes, des facteurs d’adhésion et des facteurs impliqués dans la formation de biofilm. Des gènes de résistance envers les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les tétracyclines et les biocides ont été également détectés par biopuce et leur localisation plasmidique a par la suite été déterminée. La transférabilité de ces gènes de souches porcines à des souches de SARM d’origine humaine a été démontrée par conjugaison bactérienne; ainsi le transfert horizontal de certains gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence a été observé. Ces travaux de recherche apportent une meilleure connaissance de la résistance aux antibiotiques et de la virulence des SARM d’origine porcine et de leur potentiel de contribution à l’émergence de certaines résistances et facteurs de virulence chez le SARM d’origine humaine.

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

The Effects of Pro-inflammatory Cytokines on the L-type Calcium Current in Mouse Ventricular Myocytes

L’inflammation: Une réponse adaptative du système immunitaire face à une insulte est aujourd’hui reconnue comme une composante essentielle à presque toutes les maladies infectieuses ou autres stimuli néfastes, tels les dommages tissulaires incluant l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, l’inflammation se caractérise principalement par une activation à long terme du système immunitaire, menant à une faible, mais chronique sécrétion de peptides modulateurs, appelés cytokines pro-inflammatoires. En effet, la littérature a montré à plusieurs reprises que les patients souffrant d’arythmies et de défaillance cardiaque présentent des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires tels le facteur de nécrose tissulaire alpha (TNFα), l’interleukine 1β (IL-1β) et l’interleukine 6. De plus, ces patients souffrent souvent d’une baisse de la capacité contractile du myocarde. Le but de notre étude était donc de déterminer si un lien de cause à effet existe entre ces phénomènes et plus spécifiquement si le TNFα, l’IL-1β et l’IL-6 peuvent affecter les propriétés électriques et contractiles du cœur en modulant le courant Ca2+ de type L (ICaL) un courant ionique qui joue un rôle primordial au niveau de la phase plateau du potentiel d’action ainsi qu’au niveau du couplage excitation-contraction. Les possibles méchansimes par lesquels ces cytokines exercent leurs effets seront aussi explorés. Pour ce faire, des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveau-nées ont été mis en culture et traités 24 heures avec des concentrations pathophysiologiques (30 pg/mL) de TNFα, IL-1β ou IL-6. Des enregistrements de ICaL réalisés par la technique du patch-clamp en configuration cellule entière ont été obtenus par la suite et les résultats montrent que le TNFα n’affecte pas ICaL, même à des concentrations plus élevées (1 ng/mL). En revanche, l’IL-1β réduisait de près de 40% la densité d’ICaL. Afin d’examiner si le TNFα et l’IL-1β pouvaient avoir un effet synergique, les cardiomyocytes ont été traité avec un combinaison des deux cytokines. Toutefois aucun effet synergique sur ICaL n’a été constaté. En outre, l’IL-6 réduisait ICaL significativement, cependant la réduction de 20% était moindre que celle induite par IL-1β. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à la réduction de ICaL après un traitement avec IL-1β, l’expression d’ARNm de CaV1.2, sous-unité α codante pour ICaL, a été mesurée par qPCR et les résultats obtenus montrent aucun changement du niveau d’expression. Plusieurs études ont montré que l’inflammation et le stress oxydatif vont de pair. En effet, l’imagerie confocale nous a permis de constater une augmentation accrue du stress oxydatif induit par IL-1β et malgré un traitement aux antioxydants, la diminution de ICaL n’a pas été prévenue. Cette étude montre qu’IL-1β et IL-6 réduisent ICaL de façon importante et ce indépendamment d’une régulation transcriptionelle ou du stress oxydatif. De nouvelles données préliminaires suggèrent que ICaL serait réduit suite à l’activation des protéines kinase C mais des études additionelles seront nécessaires afin d’étudier cette avenue. Nos résultats pourraient contribuer à expliquer les troubles du rythme et de contractilité observés chez les patients souffrant de défaillance cardiaque.

Implication de l'association CD20/CD40 dans la mort cellulaire induite via le CD20

CD20 est une phosphoprotéine transmembranaire exprimée spécifiquement à la surface des lymphocytes B. Malgré les nombreuses études qui ont montré son implication dans le flux calcique, son rôle physiologique est assez mal connu. Cependant, des études récentes ont démontré que CD20 peut jouer un rôle important dans la mort cellulaire. D’ailleurs, le rituximab, un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre CD20 humain, a montré son efficacité dans le traitement de nombreuses maladies auto-immunes. Cet anticorps est capable d’induire une profonde déplétion des lymphocytes B, qui va également interférer avec la coopération T et la sécrétion de cytokines. En plus, l’engagement du CD20 à la surface des cellules induit la mort cellulaire, alors que la partie cytoplasmique de cette molécule ne possède pas un motif de mort. Donc, il est possible que cette réponse soit médiée par des molécules qui semblent être associées au CD20 comme CD40. En effet, CD40, une glycoprotéine transmembranaire de type I, est un composant majeur du système immunitaire, dont l’engagement pourrait moduler la fonction cellulaire et même conduire à la mort rapide des cellules B. Le travail présenté dans ce mémoire porte sur l’étude de la mort cellulaire induite par un anti-CD20, le rituximab, ainsi que l’étude du rôle de l’association CD20/CD40 dans la mort cellulaire médiée par cet anticorps. Nos résultats montrent que la mort cellulaire induite par le rituximab varie en fonction du type cellulaire et du niveau d’expression du CD20, et que la présence du CD40 à la surface des cellules augmente l’activité de la mort cellulaire induite par le rituximab. En plus, CD20 et CD40 sont associés à la surface cellulaire, et la partie cytoplasmique n’est pas impliquée dans cette association mais semble être importante dans la mort cellulaire induite via CD20.

Influence d’une augmentation du taux de testostérone sur les décisions d’approvisionnement chez les diamants mandarins mâles (Taeniopygia guttata)

Un animal qui s’approvisionne en groupe peut rechercher soi-même sa nourriture (tactique producteur) ou tenter de se joindre à des parcelles déjà découvertes par un autre individu (tactique chapardeur). Bien que les modèles de jeu producteur-chapardeur partent du principe que les gains moyens à l’équilibre associés à chacune de ces tactiques sont égaux et ne dépendent pas des caractéristiques des individus, de plus en plus d’études démontrent que le gain de chaque tactique est influencé par certaines caractéristiques phénotypiques (agressivité, capacités d’apprentissage,…). Dans cette étude, nous nous intéressons aux effets de la testostérone sur le choix des tactiques d’approvisionnement chez les mâles de diamant mandarin (Taeniopygia guttata). La testostérone est connue pour influencer le développement du cerveau et l’agressivité, nous avons donc testé les effets d’une exposition prénatale à la testostérone ainsi que durant l’âge adulte sur le choix des tactiques d’approvisionnement lorsque la nourriture est cryptique ou défendable. Nous avons réalisé deux expériences : nous avons tout d’abord utilisé la longueur du tarse ainsi que la différence entre les longueurs des doigts 2 et 4 comme des indicateurs de l’exposition prénatale à la testostérone puis testé si ces différences morphologiques se traduisent par des différences dans le choix des tactiques dans une condition défendable et une condition cryptique. Nous avons trouvé que le choix des tactiques chez les diamants mandarins était limité par le phénotype. Une exposition précoce à la testostérone au cours du développement prénatal pourrait donc être la cause d’au moins une part de la variation observée dans le choix des tactiques d’approvisionnement. Ensuite, nous avons manipulé le taux de testostérone plasmatique chez des mâles adultes grâce à des implants hormonaux sous-cutanés puis comparé le comportement des individus lorsqu’ils portaient un implant hormonal et un implant contrôle et ce, dans chacune des deux conditions d’approvisionnement. Nous n’avons mis en évidence aucun effet du taux de testostérone plasmatique sur le choix des tactiques à l’âge adulte. Nos résultats sont en accord avec l’hypothèse que le choix des tactiques d’approvisionnement peut être influencé par les hormones. Notre conclusion est que les hormones stéroïdiennes peut affecter le choix des tactiques via l’existence d’effets maternels dans le jeu producteur-chapardeur.

Régulation transcriptionnelle du gène de la protéine de liaison de la chlorophylle-a et de la péridinine chez le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes.

Modulation de l’adressage membranaire et de la fonction du canal CaV2.3 par les résidus leucine du domaine guanylate kinase impliqués dans la liaison à forte affinité de CaVβ

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1.