Embryonic and Uterine Characteristics of Diapause

L’implantation retardée ou diapause embryonnaire décrit l'arrêt ou le retardement pendant l'embryogenèse. Chez le vison, la diapause est corrélée avec une sécrétion pituitaire insuffisante de la prolactine, ayant pour résultat la différentiation incomplète du corpus luteum et réduction de la progestérone. Des études antérieures suggèrent que le blastocyste de vison en diapause demeure dans un état de quiescence ou se développe lentement. Pour élucider ceci, la réplication de l'ADN a été étudiée. Les résultats démontrent synthèse de l’ADN et prolifération cellulaire dans les embryons au stade de morula, avant la diapause et dans les blastocystes après la réactivation. La réplication de l'ADN a été également détectée dans des blastocystes en diapause et en diapause prolongée. L'implantation est considérée comme une interaction bidirectionnelle entre le blastocyste et l'utérus. Il a été montré que les prostaglandines sont importantes pour la vascularisation de l’utérus au moment de l’implantation et peuvent réactiver l'utérus des visons après la diapause. La concentration protéinique et la localisation de la phospholipase citosolique A2 (CPLA2) et de la cyclooxygenase 2 (COX2) ont été étudiées dans l'utérus de vison. L’expression de la CPLA2 et COX2 étaient sur-régulées au moment de l'implantation. Il est connu que la prolactine active les corpus luteum des visons. L'idée de un lien entre la prolactine et la voie de signalisation des prostaglandines a été testée en mesurant les récepteurs de prolactine. Les résultats montrent une augmentation de l’expression des récepteurs de prolactine à l'implantation suggérant que la prolactine pourrait activer la voie de prostaglandine à l'utérus par son propre récepteur. La conclusion, les embryons pendant la diapause ne sont pas arrêtées complètement et les protéines liées à la voie de prostaglandine sont implique dans la réactivation de l'utérus.

Développement et caractérisation d’une méthode photonique pour créer des distributions spatiales de protéines

Les cellules sont capables de détecter les distributions spatiales de protéines et ainsi de migrer ou s’étendre dans la direction appropriée. Une compréhension de la réponse cellulaire aux modifications de ces distributions spatiales de protéines est essentielle pour l’avancement des connaissances dans plusieurs domaines de recherches tels que le développement, l’immunologie ou l’oncologie. Un exemple particulièrement complexe est le guidage d’axones se déroulant pendant le développement du système nerveux. Ce dernier nécessite la présence de plusieurs distributions de molécules de guidages étant attractives ou répulsives pour connecter correctement ce réseau complexe qu’est le système nerveux. Puisque plusieurs indices de guidage collaborent, il est particulièrement difficile d’identifier la contribution individuelle ou la voie de signalisation qui est déclenchée in vivo, il est donc nécessaire d’utiliser des méthodes pour reproduire ces distributions de protéines in vitro. Plusieurs méthodes existent pour produire des gradients de protéines solubles ou liées aux substrats. Quelques méthodes pour produire des gradients solubles sont déjà couramment utilisées dans plusieurs laboratoires, mais elles limitent l’étude aux distributions de protéines qui sont normalement sécrétées in vivo. Les méthodes permettant de produire des distributions liées au substrat sont particulièrement complexes, ce qui restreint leur utilisation à quelques laboratoires. Premièrement, nous présentons une méthode simple qui exploite le photoblanchiment de molécules fluorescentes pour créer des motifs de protéines liées au substrat : Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). Cette méthode permet de produire des motifs de protéines complexes d’une résolution micrométrique et d’une grande portée dynamique. Une caractérisation de la technique a été faite et en tant que preuve de fonctionnalité, des axones de neurones du ganglion spinal ont été guidés sur des gradients d’un peptide provenant de la laminine. Deuxièmement, LAPAP a été amélioré de manière à pouvoir fabriquer des motifs avec plusieurs composantes grâce à l’utilisation de lasers à différentes longueurs d’onde et d’anticorps conjugués à des fluorophores correspondants à ces longueurs d’onde. De plus, pour accélérer et simplifier le processus de fabrication, nous avons développé LAPAP à illumination à champ large qui utilise un modulateur spatial de lumière, une diode électroluminescente et un microscope standard pour imprimer directement un motif de protéines. Cette méthode est particulièrement simple comparativement à la version originale de LAPAP puisqu’elle n’implique pas le contrôle de la puissance laser et de platines motorisées, mais seulement d’envoyer l’image du motif désiré au modulateur spatial. Finalement, nous avons utilisé LAPAP pour démontrer que notre technique peut être utilisée dans des analyses de haut contenu pour quantifier les changements morphologiques résultant de la croissance neuronale sur des gradients de protéines de guidage. Nous avons produit des milliers de gradients de laminin-1 ayant différentes pentes et analysé les variations au niveau du guidage de neurites provenant d’une lignée cellulaire neuronale (RGC-5). Un algorithme pour analyser les images des cellules sur les gradients a été développé pour détecter chaque cellule et quantifier la position du centroïde du soma ainsi que les angles d’initiation, final et de braquage de chaque neurite. Ces données ont démontré que les gradients de laminine influencent l’angle d’initiation des neurites des RGC-5, mais n’influencent pas leur braquage. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse faciliteront l’utilisation de motifs de protéines liées au substrat dans les laboratoires des sciences de la vie, puisque LAPAP peut être effectué à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope standard légèrement modifié. Cela pourrait contribuer à l’augmentation du nombre de laboratoires travaillant sur le guidage avec des gradients liés au substrat afin d’atteindre la masse critique nécessaire à des percées majeures en neuroscience.

Développement de modèles C. elegans de Sclérose Latérale Amyotrophique

Les gènes TDP-43 (TAR DNA Binding Protein 43) et FUS/TLS (Fused in Sarcoma/Translocated in Liposarcoma) sont actuellement à l’étude quant à leurs rôles biologiques dans le développement de diverses neuropathies telles que la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Étant donné que TDP-43 et FUS sont conservés au cours de l’évolution, nous avons utilisé l’organisme modèle C. elegans afin d’étudier leurs fonctions biologiques. Dans ce mémoire, nous démontrons que TDP-1 fonctionne dans la voie de signalisation Insuline/IGF pour réguler la longévité et la réponse au stress oxydatif. Nous avons développé des lignées C. elegans transgéniques mutantes TDP-43 et FUS qui présentent certains aspects de la SLA tels que la dégénérescence des motoneurones et la paralysie adulte. La protéotoxicité causée par ces mutations de TDP- 43 et FUS associées à la SLA, induit l’expression de TDP-1. À l’inverse, la délétion de tdp-1 endogène protège contre la protéotoxicité des mutants TDP-43 et FUS chez C. elegans. Ces résultats suggèrent qu’une induction chronique de TDP-1/TDP-43 sauvage propagerait la protéotoxicité liée à la protéine mutante. Nous avons aussi entrepris un criblage moléculaire pilote afin d’isoler des suppresseurs de toxicité neuronale des modèles transgéniques mutants TDP-43 et FUS. Nous avons ainsi identifié le bleu de méthylène et le salubrinal comme suppresseurs potentiels de toxicité liée à TDP-43 et FUS via réduction de la réponse au stress du réticulum endoplasmique (RE). Nos résultats indiquent que l’homéostasie de repliement des protéines dans le RE représente une cible pour le développement de thérapies pour les maladies neurodégénératives.

Développement de méthodes analytiques pour la protéomique et l'identification de peptides MHC I issus de cellules leucémiques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Identification et caractérisation des cibles transcriptionnelles de ETV6, un facteur de transcription impliqué dans la leucémie de l’enfant.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est responsable d’environ 25% de l’ensemble des cancers pédiatriques. Chez 85% des enfants diagnostiqués, la LLA entraîne une prolifération massive et incontrôlée de lymphocytes immatures de type précurseurs B dans la moelle osseuse (LLA pré-B). Des avancées intéressantes ont été faites au cours des trente dernières années et ont mené à une augmentation de l’efficacité des traitements thérapeutiques. Plus de 80% des enfants atteints de LLA seront guéris de cette maladie. Malheureusement, ces traitements manquent de spécificité à cause du manque de connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués durant l’initiation et le développement de la LLA pré-B pédiatrique. En d’autres termes, nous connaissons peu de chose sur l’étiologie de cette maladie. Plus de 25% des enfants atteints de la LLA pré-B présentent la translocation chromosomique t(12;21)(p13;q22) qui implique les gènes ETV6 et AML1. Celle-ci est formée in utero et mène à l’expression de la protéine chimère transcriptionnelle ETV6-AML1, dont la présence seule ne suffit pas au développement de la LLA pré-B. Ainsi, d’autres événements génétiques sont nécessaires au développement de cette leucémie. La délétion de l’allèle résiduel de ETV6 est un événement génétique fréquemment rencontré au moment du diagnostic de la LLA pré-B t(12;21)+. Cette délétion entraîne l’inactivation complète de ETV6 dans les lymphocytes pré-B leucémiques. ETV6 est un répresseur transcriptionnel de la famille Ets. Mon hypothèse de recherche est que ETV6 agit comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. L’inactivation de ETV6 causerait une dérégulation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles et, par le fait même, favoriserait l’initiation et le déroulement de la leucémogenèse pédiatrique. Dans le cadre de mon projet, comme peu de cibles transcriptionnelles de ETV6 sont connues, j’ai effectué des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine et des essais luciférases qui ont permis d’identifier six nouvelles cibles transcriptionnelles: TP53 (p53 et Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 et LUM. J’ai démontré que la régulation transcriptionnelle médiée par ETV6 requiert la présence de ses deux domaines fonctionnels: PNT (interactions protéiques) et ETS (liaison à l’ADN). Ces domaines favorisent la reconnaissance d’un site EBS consensus dans une région située près du promoteur de base. Ce mécanisme peut dépendre du promoteur régulé par ETV6, mais également du contexte cellulaire. Des études fonctionnelles réalisées sur des lymphocytes pré-B leucémiques ont permis de mesurer l’impact de la dérégulation de l’expression des cibles transcriptionnelles de ETV6 sur trois voies biologiques: la prolifération cellulaire, l’apoptose induite par un stress génotoxique et la migration cellulaire dirigée par la voie de signalisation CXCL12/CXCR4. Ceci a permis de démontrer l’implication des gènes SPHK1, IL-18 et PTGER4 durant la leucémogenèse pédiatrique. Cette étude est une des premières à suggérer le rôle de ETV6 comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. Suite à l’inactivation du répresseur transcriptionnel ETV6, l’augmentation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles favoriserait la prolifération et la survie des lymphocytes pré-B leucémiques dans la moelle osseuse. L’identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement de la LLA pré-B pédiatrique ouvre la porte au développement de nouveaux traitements thérapeutiques qui pourront présenter une meilleure spécificité envers l’étiologie de la maladie.

Caractérisation fonctionnelle chez le poisson zèbre de l'isoforme protéique WNK1/HSN2 mutée dans la neuropathie héréditaire sensitive et autonome de type 2

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative.

Identification de nouveaux substrats des kinases Erk1/2 par une approche bio-informatique, pharmacologique et phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle.

Étude de la régulation transcriptionnelle du gène Indian Hedgehog et de son rôle dans l'ostéoarthrose

L’Ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire entrainant une dégénérescence du cartilage et une ossification de l’os sous-chondral. Elle touche un Canadien sur 10 et pourtant l’origine de cette pathologie est encore inconnue. Dans le cadre de ce projet, la contribution de deux facteurs de transcription, NFAT1 et PITX1, dans la régulation transcriptionnelle du promoteur d’IHH a été examiné compte tenu de l’implication potentielle de la voie hedgehog (Hh) et de ces facteurs dans la pathogenèse de l’OA. La voie de signalisation Hh régule la croissance et la différenciation des chondrocytes. Indian hedgehog (IHH), l’un des trois membres de la famille Hh, contrôle leur prolifération et leur différenciation.

Implications des canaux K+ sur la régulation génique du canal ENaC, et impact de l'hyperglycémie sur le transport ionique et la réparation de l'épithélium respiratoire

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale.

Antidiabetic activity of Vaccinium vitis-idaea, a medicinal plant from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

L’incidence du diabète chez les premières nations du Canada est plus de trois fois celle du reste du pays, dû, en partie, aux traitements culturellement inappropriés. Notre projet vise à traiter le diabète chez ces populations à partir de leur pharmacopée de médicine traditionnelle afin d’améliorer l’acceptation des traitements. En utilisant une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées pour traiter des symptômes du diabète par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec). Parmi eux, l'extrait éthanolique de baies de Vaccinium vitis-idaea a montré un effet stimulateur sur le transport du glucose dans les cellules musculaires squelettiques et les adipocytes en culture. Le but de cette thèse était d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets anti-hyperglycémiants, d’identifier ses principes actifs et de confirmer in vivo, son efficacité. Les résultats démontrent que V.vitis a augmenté le transport du glucose dans les cellules musculaires en cultures, C2C12 et L6 et a stimulé la translocation des transporteurs GLUT4 dans les cellules L6. L'extrait a également inhibé la respiration dans les mitochondries isolées du foie du rat. Cet effet est semblable à celui de la metformine et en lien avec la production du stress métabolique et l'activation de l'AMPK. De plus, la voie de signalisation de l’insuline ne semble pas être impliquée dans le mécanisme d’action de V. vitis. Le fractionnement guidé par la stimulation du transport du glucose a mené à l'isolation des principes actifs; la quercétine, la quercétine-3-O-galactoside, et la quercétine-3-O-glucoside. Comparable à l'extrait brut, ses composés ont stimulé la voie AMPK. Cependant, la quércetine était la seule à inhiber la respiration mitochondriale. Pour valider l'effet de V.vitis in vivo, l'extrait (1% dans l'eau de boisson) a été administré aux souris KKAy pendant 10 jours. La glycémie et le poids corporel ont été significativement réduits par V.vitis. Ces effets ont été associés à une diminution de la prise alimentaire, ce qui suggère que V.vitis diminue l'appétit. L'étude pair-fed a confirmé que les effets de V.vitis sont, majoritairement, dû à la réduction de l’appétit. De plus, V.vitis a augmenté la teneur en GLUT4 dans le muscle squelettique, a stimulé la iv phosphorylation de l'ACC et a augmenté les niveaux de PPAR-α dans le foie des souris KKAy. Ces effets se voient être additifs à l’effet anorexigène de V. vitis. Au cours du fractionnement bioguidé de l’extrait, l’ester méthylique de l'acide caféique (CAME), un produit formé lors de la procédure du fractionnement, a démontré un effet stimulateur puissant sur le transport du glucose dans les celules C2C12 et donc un potentiel anti-diabétique. Pour identifier d'autres acides caféique active (AC) et pour élucider leurs relations structure-activité et structure-toxicité, vingt dérivés AC ont été testés. Outre CAME, quatre composés ont stimulé le transport du glucose et ont activé l'AMPK suite au stress métabolique résultant d'un découplage de la phosphorylation oxydative mitochondriale. L’activité nécessite une fonction d’AC intacte dépourvu de groupements fortement ionisés et ceci était bien corrélée avec la lipophilicite et la toxicité. Les résultats de cette thèse soutiennent le potentiel thérapeutique de V. vitis, ses composés actifs ainsi que de la famille de l’AC et pour la prévention et le traitement du diabète.

Le niveau réduit d’AMPc dans la surexpression des protéines G(alpha)i et la prolifération accrue des cellules du muscle lisse vasculaire des rats spontanément hypertendus

Nous avons précédemment montré que les cellules musculaires lisses vasculaires(CMLV) des rats spontanément hypertendus (SHR) présentent une expression augmentée des protéines G inhibitrices (Gi) et une prolifération cellulaire accrue par rapport aux CMLV des rats Wystar-Kyoto (WKY). Le niveau d'AMPc s’est également avéré plus faible dans les CMLV de SHR. La présente étude a donc été entreprise afin d'examiner la contribution de la diminution du niveau intracellulaire d'AMPc à l’augmentation de l'expression des protéines Gi et à la prolifération accrue des CMLV de SHR et de continuer à explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents responsables de cette réponse. Les CMLV de SHR ont montré par rapport aux CMLV des WKY une expression accrue de Giα-2 et Giα-3 qui a été diminué d'une manière dépendante de concentration par le dbcAMP, un analogue d'AMPc perméable à la membrane cellulaire. En outre, les fonctions augmentées des protéines Gi comme démontrées par l'amplification de l’inhibition de l'adénylate cyclase par les hormones inhibitrices et l'activité forskoline (FSK)-stimulée de l’adénylate cyclase par une faible concentration de GTPγS dans les CMLV de SHR ont également été restaurées aux niveaux de WKY par le dbcAMP. La prolifération accrue des CMLV de SHR a également été atténuée par le dbcAMP et la forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase. De plus, dbcAMP a restauré la production augmentée d'anion superoxyde (O2-), l'activité de la NAD(P)H oxydase et l’expression accrue des protéines Nox 4 et p47phox observée dans les CMLV de SHR jusqu’au niveau contrôle. Par ailleurs, la phosphorylation accrue des PDGF-R, EGF-R, c-Src et ERK1/2 énoncée par les CMLV de SHR a également été diminuée par le dbcAMP d'une manière dépendante de concentration. Ces résultats suggèrent que le niveau réduit d'AMPc intracellulaire montré par les CMLV de SHR contribue à l'expression accrue des protéines Gi et à l’hyperprolifération cellulaire à travers l’augmentation du stress oxydatif, la transactivation des EGF-R, PDGF-R et la voie de signalisation des MAP kinases.

Études génétiques moléculaires du gène de la polarité planaire SCRIBBLE1 chez les anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.

Caractérisation du motif acidique de la sous-unité p28 de l’IL-27 et étude des propriétés partagées entre cette protéine, le CNTF, CLC/CLF et l’interleukine-6

L’interleukine 6 (IL-6) est une cytokine qui joue un rôle essentiel dans l’inflammation. Son récepteur (IL-6R) est composé de la chaîne non signalétique IL-6Rα et de la chaîne transductrice du signal gp130, commune aux cytokines de la famille IL-6. La liaison de l’IL-6 à son récepteur permet l’activation de plusieurs voies de signalisation, notamment des voies Jak/STAT1 et préférentiellement Jak/STAT3. De façon complémentaire, nous avons démontré que l’IL-6 est capable d’activer la voie Jak/STAT5 dans les lymphocytes T CD4. L’activation de cette voie de signalisation pourrait être impliquée dans le rétrocontrôle des effets pro-inflammatoires de l’IL-6 sur les cellules T CD4. Le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) et la « cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 » (CLC/CLF) sont deux cytokines de la famille de l’IL-6 qui signalent à travers un récepteur commun, le récepteur au CNTF (CNTFR), composé du CNTFRα, « leukaemia inhibitory factor receptor β » (LIFRβ) et gp130. Toutes deux exercent des actions au niveau du système immunitaire, or la chaîne CNTFRα de leur récepteur n’y est pas exprimée. Il a été montré que le CNTFR humain peut également activer un récepteur formé des sous-unités IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Nous avons comparé les effets du CNTF et du CLC/CLF de souris sur des transfectants exprimant LIFRβ et gp130 et les chaines α connues de la famille IL-6 (IL-6Rα, IL-11Rβ et CNTFRα). Nos résultats indiquent que le CNTF de souris, comme le CNTF humain est capable d’activer un récepteur formé de l’IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Toutefois cette propriété n’est pas partagée par CLC/CLF et le récepteur impliqué dans les effets de cette cytokine sur le système immunitaire reste donc à identifier. L’IL-27 appartient à la famille de l’IL-6 composée d’une sous-unité cytokinique, p28, associée à un récepteur soluble « l’Epstein-Barr virus-induced gene 3» (EBI3). La sous-unité p28 peut s’associer avec le récepteur soluble CLF pour former une cytokine capable d’activer les lymphocytes T. Dans le but de caractériser cette cytokine, nous avons montré que p28/CLF agit aussi sur les lymphocytes B et permet leur différenciation en plasmocytes. Le partage de l’IL-6R par l’IL-6 et p28/CLF semble être à l’origine de la similarité des effets de ces deux cytokines. De plus, nous avons observé des effets semblables à ceux de l’IL-6 suite à l’association de la sous-unité p28 seule avec la chaîne IL-6Rα. En effet, afin de mieux caractériser la cytokine p28/CLF, nous avons étudié les effets dus au recrutement de la chaîne IL-6Rα par la sous-unité p28. Les cytokines de la famille de l’IL-6 sont composées de quatre hélices α disposées de façon anti-parallèle deux à deux. La sous-unité p28 possède, au niveau d’une boucle reliant deux hélices α, un motif de plusieurs acides glutamiques consécutifs (motif polyE) qui n’est retrouvé dans aucune autre cytokine de cette famille. Nous avons démontré que ce motif est impliqué dans la liaison de cette sous-unité avec l’hydroxyapatite et l’os. Cette caractéristique de p28 pourrait permettre un ciblage de l’IL-27 (p28/EBI3) et de p28/CLF préférentiellement vers la niche endostéale des cellules souches et des cellules immunitaires.

Anti-VEGFA therapy reduces tumor growth and extends survival in a murine model of ovarian granulosa cell tumor

Les tumeurs des cellules de la granulosa (GCTs) sont des tumeurs avec un potentiel malin ayant tendance à récidiver, provoquant ainsi la mort dans 80% des cas de stade avancé consécutif à une rechute. Bien que les GCTs représentent 5% des tumeurs ovariennes, peu d’études ont évalué les protocoles de traitement adjuvant pour la maladie avancée ou récurrente. Notre but était d’évaluer l’efficacité de la voie de signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) comme cible pour le traitement de la GCT utilisant le modèle murin transgénique Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA) qui reproduit le stade avancé de la maladie humaine. Un anticorps anti-VEGFA a été administré une fois par semaine par voie intrapéritonéale (IP) à partir de 3 semaines d’âge. La thérapie anti-VEGFA a permis une réduction de la taille des tumeurs à 6 semaines d’âge (p<0.05) et une prolongation de la survie des animaux traités, lorsque comparé aux animaux contrôles. L’analyse des GCTs a montré une réduction significative de la prolifération cellulaire (p<0.05) et de la densité microvasculaire (p<0.01) mais aucune différence significative n’a été détectée dans l’apoptose cellulaire. p44/p42 MAPK, un effecteur de la signalisation pour le récepteur 2 de VEGFA (VEGFR2) associé à la prolifération cellulaire, était moins activé dans les tumeurs traitées (p<0.05). Par contre, l’activation d’AKT, un effecteur impliqué dans la survie cellulaire, était similaire d’un groupe à l’autre. Ces résultats suggèrent que l’anticorps anti-VEGFA réduit la prolifération cellulaire et la densité microvasculaire chez les souris PCA par inhibition de la voie de signalisation VEGFR2-MAPK, inhibant ainsi la croissance tumorale. En conclusion, l’efficacité de la thérapie anti- VEGFA mérite d’être évaluée en essais contrôlés randomisés pour le traitement des GCTs chez l’homme.