790 resultados para signalisation cellulaire
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La voie de signalisation Notch est conserve au cours de l'volution. Elle joue un rle cl dans le dveloppement, et elle est implique dans de nombreuses dcisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrle de la prolifration et de la diffrenciation cellulaires. Une drgulation de la signalisation Notch est implique dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utrus, et les leucmies, comme la Leucmie Aigu Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un rcepteur transmembranaire activ par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogniques ont t identifies au niveau du rcepteur Notch, de nombreux cancers moduls par Notch demeurent ligand-dpendants. tonnamment, les mcanismes molculaires rgulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractriss par rapport ceux qui rgissent le rcepteur Notch lui-mme. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur lucifrase de Notch, nous avons effectu le premier crible d'ARNi pan-gnomique visant spcifiquement identifier des rgulateurs des ligands de Notch dans la cellule mettrice du signal. Nous avons ainsi pu dcouvrir de nouvelles classes de rgulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces rgulateurs comprennent des inhibiteurs de protases, des facteurs de transcription, et des gnes divers fonction inconnue, tels que Tmem128 Transmembrane protein 128 , ou fonction pralablement caractrise tels que la co-chaperonne molculaire Cdc37 Cell division cycle 37 homolog . Par la suite, nous avons dvelopp des cribles secondaires fonctionnels o nous avons dmontr l'importance de ces rgulateurs pour des vnements Notch-dpendants, comme la diffrenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pr-leucmiques isoles partir d'un modle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouv que les rgulateurs les plus forts du crible de survie sont galement ncessaires pour l'activit d'auto-renouvellement des cellules souches pr-leucmiques. Finalement, nous avons entam une caractrisation molculaire prliminaire de deux rgulateurs nouvellement identifis; Tmem128 et Cdc37 afin d'tudier leur mcanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette tude nous a permis d'identifier de nouveaux rgulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thrapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustr par le modle LAL-T. La comprhension des dtails molculaires sous-jacents aux fonctions de ces rgulateurs sera essentielle afin de dvelopper des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Le cancer colorectal reprsente la troisime forme de cancer la plus frquente au Canada. Malgr les rcents dveloppements, aucun traitement curatif nest disponible pour les patients diagnostiqus un stade avanc de la maladie. Plusieurs vidences supportent un rle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des rcepteurs de type EP et FP est remarque. Ces derniers ainsi que les molcules de signalisations intracellulaires quils activent reprsentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et dautres groupes avons dmontr que les protines G monomriques sont des petits interrupteurs molculaires importants dans la signalisation intracellulaire engage par les rcepteurs dans des cellules saines mais quun drglement de celles-ci est associ au cancer. Lobjectif principal de ce projet de recherche vise donc identifier les voies de signalisations par lesquelles le rcepteur FP contribue aux capacits invasives des cellules tumorales dorigine colorectale. Notre hypothse est que la protine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protine RhoA, agissent pour coordonner lactivation des voies de signalisations associes la migration et linvasion cellulaire. Nos rsultats ont indiqu que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de faon stable le rcepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une ligne invasive de cancer colorectal, par le PGF2 augmentait les niveaux dactivation dARF6 mais galement de la protine RhoA. De plus, dautres mdiateurs et intermdiaires associs la rorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine lgre de la myosine (MLC) ont t hautement phosphoryls suite la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associes avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tent de dterminer si linhibition de ces protines G affectait la capacit du PGF2 activer ces intermdiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expriences contribueront identifier de nouvelles cibles thrapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.
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Lexpansion des maladies mtaboliques dans les socits modernes exige plus dactivits de recherche afin daugmenter notre comprhension des mcanismes et lidentification de nouvelles cibles dinterventions cliniques. Lobsit, la rsistance linsuline (RI) et la dyslipidmie, en particulier sont tous des facteurs de risque associs la pathogense du diabte de type 2 (DT2) et des maladies cardiovasculaires. Ainsi, la dyslipidmie postprandiale, notamment la surproduction des lipoprotines hpatiques et intestinales, contribue dune faon significative lhypertriglycridmie. Quoique plusieurs tudes cliniques et fondamentales chez lhomme et les modles animaux aient mis en vidence les rles importants jous par le foie et lintestin dans la dyslipidmie, les mcanismes molculaires en cause ne sont pas bien lucids. Lune des voies principales rgulant le mtabolisme lipidique est la voie de la protine kinase AMPK. Lpuisement de lATP intracellulaire entrane une activation de lAMPK qui va uvrer pour rtablir lquilibre nergtique en stimulant des voies gnratrices dATP et en inhibant des voies anaboliques consommatrices dATP. Les effets positifs de lactivation de lAMPK comprennent laugmentation de la sensibilit linsuline dans les tissus priphriques, la rduction de lhyperglycmie et la rduction de la lipogense, do son importance dans les interventions cliniques pour la correction des drangements mtaboliques. Il est souligner que le rle de lAMPK dans le foie et lintestin semble plus complexe et mal compris. Ainsi, la voie de signalisation de lAMPK nest pas bien lucide dans les situations pathologiques telles que le DT2, la RI et lobsit. Dans le prsent projet, notre objectif consiste caractriser le rle de cette voie de signalisation dans la lipogense hpatique et dans le mtabolisme des lipides dans lintestin chez le Psammomys obesus, un modle animal dobsit, de RI et de DT2. cette fin, 3 groupes danimaux sont tudis (i.e. contrle, RI et DT2). En caractrisant la voie de signalisation de lAMPK/ACC dans le foie, nous avons constat une augmentation de lexpression gnique des enzymes cls de la lipogense (ACC, FAS, SCD-1 et mGPAT) et des facteurs de transcription (ChREBP, SREBP-1) qui modulent leur niveau dexpression. Nos analyses dtailles ont rvl, par la suite, une nette augmentation de lexpression de lisoforme cytosolique de lACC, ACC1 (impliqu dans la lipogense de novo) concomitante avec une invariabilit de lexpression de lisoforme mitochondrial ACC2 (impliqu dans la rgulation ngative de la -oxydation). En dpit dun tat adaptatif caractris par une expression protique et une phosphorylation (activation) leves de lAMPK, lactivit de la kinase qui phosphoryle et inhibe lACC reste trs leve chez les animaux RI et DT2. Au niveau de lintestin grle des animaux RI et DT2, nous avons dmontr que laugmentation de la lipogense intestinale est principalement associe avec une diminution de la voie de signalisation de lAMPK (i.e. expression protique et phosphorylation/activation rduites des deux isoformes AMPK1 et AMPK2). La principale consquence de la diminution de lactivit AMPK est la rduction de la phosphorylation de lACC. tant donn que le niveau dexpression totale dACC reste inchang, nos rsultats suggrent donc une augmentation de lactivit des deux isoformes ACC1 et ACC2. En parallle, nous avons observ une rduction de lexpression protique et gnique de la CPT1 [enzyme cl de la -oxydation des acides gras (AG)]. Lensemble de ces rsultats suggre une inhibition de loxydation des AG concomitante avec une stimulation de la lipogense de novo. Enfin, nous avons dmontr que lintestin grle est un organe sensible laction de linsuline et que le dveloppement de la rsistance linsuline pourrait altrer les deux voies de signalisation (i.e. Akt/GSK3 et p38MAPK) essentielles dans plusieurs processus mtaboliques. En conclusion, nos rsultats indiquent que laugmentation de la lipogense qui contribue pour une grande partie la dyslipidmie dans la rsistance linsuline et le diabte serait due, en partie, des dfauts de signalisation par lAMPK. Nos observations illustrent donc le rle crucial du systme AMPK au niveau hpatique et intestinal, ce qui valide lapproche thrapeutique consistant activer lAMPK pour traiter les maladies mtaboliques.
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Les urodles amphibiens, dont fait partie laxolotl (Ambystoma mexicanum), ont la capacit de rgnrer leurs organes et membres suite une amputation, tout au long de leur vie. La patte est lorgane dont le processus de rgnration est le mieux caractris et ce dernier est divis en deux phases principales. La premire est la phase de prparation et commence immdiatement suite lamputation. Elle renferme des tapes essentielles au processus de rgnration comme la gurison de la plaie et la formation dune coiffe apicale ectodermique. Par la suite, les fibroblastes du derme et certaines cellules musculaires vont revenir un tat pluripotent via un processus appel ddiffrenciation cellulaire. Une fois ddiffrencies, ces cellules migrent et saccumulent sous la coiffe apicale pour former le blastme. Lors de la phase de redveloppement, les cellules du blastme se divisent puis se rediffrencient pour rgnrer la partie ampute. Fait intressant, la rgnration dun membre ou la gurison dune plaie chez laxolotl ne mne jamais la formation dune cicatrice. Afin den apprendre plus sur le contrle molculaire de la rgnration, les gnes Heat-shock protein-70 (Hsp-70) et Transforming growth factor-1 (Tgf-1) ont t slectionns. Ces gnes jouent un rle important dans la rponse au stress et lors de la gurison des plaies chez les mammifres. HSP-70 est une chaperonne molculaire qui est produite pour maintenir lintgrit des protines cellulaires lorsquun stress se prsente. TGF-1 est une cytokine produite suite une blessure qui active la rponse inflammatoire et qui stimule la fermeture de la plaie chez les amniotes. Les rsultats prsents dans cette thse dmontrent que Hsp-70 est exprim et rgul lors du dveloppement et de la rgnration du membre chez laxolotl. Dautre part, nos expriences ont men lisolation de la squence codante pour Tgf-1 chez laxolotl. Nos rsultats montrent que Tgf-1 est exprim spcifiquement lors de la phase de prparation dans le membre en rgnration. De plus, le blocage de la voie des Tgf- avec linhibiteur pharmacologique SB-431542, lors de la rgnration, mne linhibition du processus. Ceci dmontre que la signalisation via la voie des Tgf- est essentielle la rgnration du membre chez laxolotl.
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Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de rcepteurs membranaires impliqus dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique lactivation dune protine G htro-trimrique qui pourra son tour moduler lactivit de divers effecteurs intracellulaires. Ce schma classique de signalisation sest complexifi au fils des annes et lon sait maintenant quen plus dinteragir avec les protines G, les RCPGs sassocient avec une panoplie dautres protines afin de transmettre adquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la dcouverte dune famille de protines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptises protines modifiant lactivit des rcepteurs ( receptor activity-modifying proteins ; RAMPs), a chang la faon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du rcepteur similaire au rcepteur de la calcitonine ( calcitonin-like receptor ; CLR), lassociation avec les RAMPs permet lacheminement la surface cellulaire du rcepteur tout en modulant ses proprits pharmacologiques. Lorsquil est associ avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un rcepteur du peptide reli au gne de la calcitonine ( calcitonin gene-related peptide ; CGRP), alors quil devient un rcepteur de ladrnomedulline lorsquil interagit avec RAMP2 ou RAMP3. Dautre part, en plus dinteragir avec des protines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi sassocier entre eux pour former des oligomres de rcepteurs. Dans cette thse, nous nous sommes penchs sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulirement sur linterrelation entre ce type dassociation RCPG/RAMP et lassemblage en oligomres de rcepteurs, en utilisant le rcepteur du CGRP comme modle dtude. Une premire tude nous a tout dabord permis de confirmer linteraction entre le rcepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons dmontr que ce complexe CLR/RAMP1 active la protine G et recrute la protine de signalisation -arrestine suite une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons dtermin que mme sil doit obligatoirement former un htro-oligomre avec les RAMPs pour tre actif, le CLR conserve malgr tout sa capacit interagir avec dautres RCPGs. En plus dobserver la prsence dhomo-oligomre de CLR, nous avons constat que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi sassocier entre eux pour former des complexes oligomriques pouvant comprendre diffrents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la prsence dhomo-oligomres de CLR et de RAMP1, nous a amen nous questionner sur la stchiomtrie dinteraction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxime tude ayant pour but dtablir la composition molculaire du rcepteur CGRP1 in vivo, nous avons dvelopp une nouvelle approche permettant ltude de linteraction entre trois protines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptise BRET/BiFC, est base sur le transfert dnergie de rsonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla lucifrase, et un accepteur fluorescent, la protine fluorescente jaune (YFP), reconstitue suite au r-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu dterminer que le rcepteur CGRP1 est constitu dun homo-oligomre de CLR interagissant avec un monomre de RAMP1. En dmontrant un assemblage oligomrique asymtrique pour le rcepteur CGRP1 partir dune nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux prsents dans cette thse ont contribu largir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile la poursuite des recherches sur les complexes protiques impliqus dans la signalisation.
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Les opiodes sont les analgsiques les plus efficaces mais leur utilisation est limite par la tolrance, un processus li en partie la dsensibilisation des rcepteurs. Le rle de la prsente tude tait de mieux caractriser le processus de dsensibilisation des rcepteurs et plus particulirement, dtudier le rle de la tyrosine kinase Src sur la rgulation de la signalisation des rcepteurs delta opiodes. Nos rsultats dmontrent que linhibition pharmacologique avec PP2 ( faible concentration : 20- 40M) ou encore linhibition molculaire de la kinase avec de faibles concentrations dADN dun mutant dominant inactif de Src (0,2g/ml) potentialise lamplitude et la dure de lactivation de la cascade ERK lorsquun agoniste, DPDPE (1M; 5 min), se lie aux rcepteurs. Nous avons galement dmontr que de fortes concentrations dinhibiteurs de Src (80 et 100M de PP2 ou 1g/ml dADN du mutant dominant ngatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par lagoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur lactivit de ERK : linhibition complte de Src inhibe lactivit de la cascade MAPK alors quune inhibition modre potentialise cette mme cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfrent avec lactivation de ERK alors que de faibles concentrations interfrent avec la dsensibilisation des rcepteurs. Cette possibilit a t teste laide dessais daccumulation dAMPc qui visaient valuer leffet des bloqueurs de Src (PP2, 20 M; 1h) sur la dsensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production dAMPc, pralablement stimule par du forskolin, de faon dose-dpendante. Le maximum d'inhibition observ est de 61%, mais lors dun prtraitement au DPDPE (1 M, 30 min) linhibition maximale est rduite 72% de linhibition initiale observe. Cependant, un prtraitement des cellules au PP2 (20M pendant 1 heure) avant deffectuer la dsensibilisation protge contre cette dsensibilisation. Leffet protecteur des bloqueurs de Src nentrane pas de changement au niveau de linternalisation des DOR mais laltration de leur internalisation via un mutant tronqu du DOR ou via un milieu sucr hypertonique (0.4M de saccharose) rduit cette protection. Ces donnes suggrent alors que linternalisation optimale du rcepteur est ncessaire pour que leffet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue la dsensibilisation de DOR aprs que linternalisation du DOR soit survenue.
Brain tumor and brain endothelial cells' response to ionizing radiation and phytochemical treatments
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Le glioblastome multiforme (GBM) reprsente la tumeur crbrale primaire la plus agressive et la plus vascularise chez ladulte. La survie mdiane aprs le diagnostic est de moins dun an en labsence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traits avec de la radiothrapie aprs la rsection chirurgicale dun GBM dveloppent une rcidive tumorale. Rcemment, le traitement des GBM avec radiothrapie et tmozolomide, un agent reconnu pour ses proprits antiangiogniques, a permis de prolonger la survie mdiane 14,6 mois. Des efforts sont dploys pour identifier des substances naturelles capables dinhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogense. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphnol retrouv dans le th vert, est reconnu pour ses proprits anticancreuses et antiangiogniques. LEGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales crbrales et les cellules endothliales drives des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II dcrit la premire partie de ce projet de doctorat. Nous avons tent de dterminer si lEGCG pourrait sensibiliser la rponse des GBM lirradiation (IR) et si des marqueurs molculaires spcifiques sont impliqus. Nous avons document que les cellules U-87 taient relativement radiorsistantes et que Survivin, une protine inhibitrice de lapoptose, pourrait tre implique dans la radiorsistance des GBM. Aussi, nous avons dmontr que le pr-traitement des cellules U-87 avec de lEGCG pourrait annuler leffet cytoprotecteur dune surexpression de Survivin et potentialiser leffet cytorducteur de lIR. Au chapitre III, nous avons caractris limpact de lIR sur la survie de cellules endothliales microvasculaires crbrales humaines (HBMEC) et nous avons dtermin si lEGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec lEGCG et lIR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combin diminuait de faon synergique la survie cellulaire. Nous avons document que le traitement combin augmentait la mort cellulaire, plus spcifiquement la ncrose. Au chapitre IV, nous avons investigu limpact de lIR sur les fonctions angiogniques des HBMEC rsistantes lIR, notamment la prolifration cellulaire, la migration cellulaire en prsence de facteurs de croissance drivs des tumeurs crbrales, et la capacit de tubulogense. La voie de signalisation des Rho a aussi t tudie en relation avec les proprits angiogniques des HBMEC radiorsistantes. Nos donnes suggrent que lIR altre significativement les proprits angiogniques des HBMEC. La rponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et langiogense ainsi que la tubulogense sont attnues dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les proprits cytorductrices de lIR sur les gliomes malins et propose un nouveau mcanisme pour expliquer la radiorsistance des GBM. Ce projet documente pour la premire fois leffet cytotoxique de lIR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnat lexistence de HBMEC radiorsistantes et caractrise leurs fonctions angiogniques altres. La combinaison de molcules naturelles anticancreuses et antiangiogniques telles que lEGCG avec de la radiothrapie pourrait amliorer leffet de lIR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothliales associes, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thse supporte lintgration de nutriments avec proprits anticancreuses et antiangiogniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothliales aux traitements conventionnels.
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La mort cellulaire programme (PCD pour Programmed Cell Death) est un processus essentiel aux cellules. Le PCD a dabord t caractris dans le dveloppement cellulaire et peut tre divis en plusieurs groupes selon les caractristiques observes. Lapoptose, un sous-groupe du PCD, est caractris par plusieurs distinctions morphologiques et signaltiques attribu tout dabord aux organismes complexes pour son rle dans le dveloppement et dans le maintien de lintgrit tissulaire. Depuis la dernire dcennie, de nombreuses tudes font tat de lexistence dun programme apoptotique dans des organismes unicellulaires comme les levures. Ce programme apoptotique a surtout t tudi chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe et partage certaines caractristiques avec lapoptose des mammifres. Par contre, lapoptose associ aux levures est distinct certains gards entre autre par labsence de certains homologues prsents chez les mammifres. Lintrt au niveau de ltude du phnomne apoptotique chez les levures est sans cesse grandissant par la facilit avec laquelle les levures peuvent tre utilises comme systme modle. Lapoptose peut tre induit dans les cellules de diffrentes faons en rponse des stimuli internes ou externes. Laccumulation de protines mal replies au niveau du rticulum endoplasmique (RE) causant un stress est un inducteur bien caractris de la voie apoptotique. La signalisation de lapoptose dans un cas de stress au RE fait appel aux transducteurs des signaux de la voie du UPR ( Unfolded Protein Response). Rcemment, il a t montr que la calnexine, une chaperone transmembranaire du RE connue et caractrise surtout pour ses fonctions daide au repliement des protines et au contrle de qualit, joue un rle dans la transduction du signal apoptotique en rponse au stress du RE chez mammifres. Le rle de la calnexine dans ce cas consiste principalement en lchafaudage pour le clivage par la caspase 8 de la protine apoptotique Bap31. Nous avons tout dabord dmontr que le stress du RE et que la dficience en inositol, un prcurseur essentiel de nombreuses molcules signaltiques, sont deux inducteurs de lapoptose chez la levure S. pombe. Ces deux voies semblent induire lapoptose par deux voies distinctes puisque seule la voie de la dficience en inositol induit lapoptose de faon dpendante la mtacaspase Pca1p. La calnexine, essentielle la viabilit chez la levure S. pombe, est implique dans ces deux phnomnes apoptotiques. Lapoptose induit par le stress du RE ncessite une version de la calnexine ancre la membrane du RE pour tre optimal. De faon oppose, lapoptose induit par une dficience en inositol ncessite la prsence de la queue cytosolique ancre la membrane de la calnexine pour tre retard. Ces deux actions diffrentes imputables une mme protine laisse croire une double fonction pro et anti-apoptotique de celle-ci. Suite la dcouverte de lexistence dun clivage endogne de la calnexine en situation normale de croissance, un modle a t labor expliquant les rles distincts de la calnexine dans ces deux voies apoptotiques. Ce modle fait tat dun rle associ au clivage de la calnexine dans lapoptose.
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Il est reconnu, depuis une centaine dannes, que des dsordres de la coagulation, regroups sous le terme de coagulopathies, sont souvent associs au dveloppement noplasique. Pendant de nombreuses annes, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple consquence du dveloppement du cancer. Dailleurs, pour les cliniciens, lapparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique dun cancer occulte. Toutefois, ltude approfondie du lien existant entre le systme hmostatique et le cancer indique que diffrents facteurs hmostatiques vont interagir avec soit lenvironnement tumoral ou soit la tumeur elle-mme et influencer le dveloppement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons port une attention particulire deux protines jouant un rle primordial dans lhmostase. Le facteur tissulaire (TF) et linhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rles pro- ou anti-noplasique, et ce indpendamment de leurs fonctions hmostatiques normales. Dans le premier volet de cette thse, nous avons tudi les proprits antiangiogniques de TFPI. Langiogense, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins partir du rseau pr-existant, est reconnue comme tant une tape cle du dveloppement tumoral. Daprs nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de linhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothliales lorsque ces dernires sont stimules par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molcule relche lors de lactivation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire sexplique par leffet du TFPI sur ladhsion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protines cles participant la formation des complexes dadhsion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). Linhibition de ces deux protines suggre quil y ait une rorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte dadhrence. Finalement, des tudes de microscopie confocale dmontrent que les cellules traites au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette dactine provoquant une dsorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de ladhsion et de la morphologie cellulaire sont strictement spcifiques aux cellules endothliales humaines, puisque aucun neffet nest observ en traitant des cellules cancreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularises. En rsum, cette premire tude dmontre que le TFPI est un inhibiteur de langiogense. Dans le second volet de cette thse, nous nous sommes intresss aux diffrents rles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protine est galement implique dans le dveloppement noplasique et notamment celui des mdulloblastomes (MB) chez lenfant via des fonctions hmostatiques et non-hmostatiques. Nos travaux dmontrent que lexpression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son rcepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spcifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler lexpression de TF au niveau des cellules cancreuses de glioblastomes. TF, exprim la surface des cellules mdulloblastiques (DAOY), est responsable de lactivit pro-thrombognique de ces cellules, ainsi quun acteur important de la migration de ces cellules en rponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en tudiant 18 spcimens cliniques de MB, nous avons tabli un lien entre lintensit dexpression de TF et de Met. Limportance de cette corrlation est galement suggre par lobservation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont galement les plus agressives en termes dindex de prolifration et de dissmination mtastatiques. En rsum, ces travaux reprsentent le point de dpart pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pdiatriques. De plus, llucidation de la voie de signalisation molculaire responsable de lexpression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil dexpression de TF aux phnotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut galement jouer un rle protecteur contre lapoptose. Dans le troisime volet de cette thse, nous avons remarqu que cette protection est corrle lexpression de TF. En rduisant nant lexpression de TF laide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous dmontrons que HGF ne protge plus les cellules contre lapoptose. Donc, TF mdie lactivit anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la srine 15, empchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, lexpression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules mdulloblastiques favorise la survie de ces dernires et ce mme si elles sont soumises de fortes concentrations de mdicaments couramment utilises en cliniques. Ce troisime et dernier volet dmontre limplication de TF en tant que facteur impliqu dans la survie des cellules cancreuses, favorisant ainsi le dveloppement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thse vise dmontrer que les facteurs impliqus normalement dans des fonctions hmostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer rguler le dveloppement tumoral. Tout systme physiologique et pathologique est dpendant dun quilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI la rgulation du dveloppement noplasique illustre bien cette balance dlicate. Par sa contribution anti- ou pro-noplasique le systme hmostatique constitue beaucoup plus quune simple consquence du cancer; il fait partie par laction de TF des stratgies labores par les cellules cancreuses pour assurer leur croissance, leur dplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.
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Le repliement des protines est un processus cellulaire crucial impliquant plusieurs protines dont la calnexine, une chaperone du rticulum endoplasmique. Notre laboratoire et un autre groupe avons dmontr que la calnexine est essentielle la viabilit de la levure Schizosaccharomyces pombe. Dans le cadre dtudes structure-fonction portant sur cette protine, nous avons dcouvert un phnomne permettant la viabilit des cellules en absence de la calnexine. Cet tat, nomm Cin pour calnexine independence, est induit par un mutant de la calnexine dpourvu du domaine central hautement conserv (hcd_Cnx1p). La caractrisation de ltat Cin a rvl plusieurs caractristiques particulires telle la dominance, sa transmission de faon non-Mendlienne la progniture motique et sa transmission par des extraits protiques dpourvus dacides nucliques. Toutes ces proprits suggrent donc que ltat Cin est mdi via un lment de type prion. Le gne cif1+, pour calnexin independence factor, a t isol lors de criblages visant identifier des gnes impliqus dans ltat Cin. Il encode pour une protine orpheline dont la surexpression induit de faon stable un tat de viabilit en labsence de la calnexine. Cet tat diffre gntiquement et phnotypiquement de ltat Cin induit par le mutant hcd_Cnx1p pralablement caractris, ce qui suggre deux voies parallles de signalisation du phnomne Cin. Une caractrisation exhaustive de Cif1p a permis de dmontrer quil ne sagissait pas du prion responsable de ltat Cin, malgr que cette protine possde certaines proprits typiques des prions in vitro. Finalement, Cif1p est une protine nuclolaire dont la bonne localisation est essentielle sa capacit induire ltat Cin. Ceci suggre une interaction entre la fonction essentielle de la calnexine et une fonction excute dans le nuclole. Lors dtudes visant lucider la fonction cellulaire de Cif1p, il a t tabli quelle interagissait avec certaines protines de la grosse sous-unit du ribosome telle la protine L3. Cependant, Cif1p ne co-sdimente pas avec des sous-units ribosomales assembles, des ribosomes ou des polysomes. De plus, des cellules contenant une dltion gnomique de cif1 voient leur contenu en ribosomes perturb lors de la phase stationnaire. Il semble donc que Cif1p joue un rle dans la biosynthse des ribosomes lors de la phase stationnaire. Ce rle spcifique cette phase de croissance coincide avec un clivage de la portion N-terminale de Cif1p, clivage qui a lieu lors de lentre des cellules en phase stationnaire. De plus, des tudes effectues rcemment dans notre laboratoire proposent que la calnexine joue un rle important dans la signalisation de lapoptose, et ce particulirement en phase stationnaire. Ainsi, une voie impliquant Cif1p, sa fonction nuclolaire dans la biosynthse des ribosomes en phase stationnaire, la calnexine et la mdiation de lapoptose semble se dessiner. Dautres travaux, notamment sur la fonction exacte de Cif1p, le rle de son clivage et les autres composantes impliques dans le phnomne Cin nous permettront de dessiner un portrait plus complet de cette voie cellulaire indite.
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Contribuant la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de lhypertension, le remodelage vasculaire est associ une altration de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifration, taille, etc.). Or la prolifration des CMLV est augmente par les peptides vasoactifs tels que langiotensine II (AngII) et lendothline-1 (ET-1). Ces peptides tant surexprims lors de lhypertension, cette tude fut entreprise pour dterminer leur contribution endogne ainsi que celles du facteur de croissance pidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance driv des plaquettes (PDGF) la prolifration accrue des CMLV et aux mcanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR gs de 12 semaines ont t utilises pour cette tude. La prolifration cellulaire fut dtermine par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du rcepteur de EGF fut dtermine par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, compares celles de WKY, ont montr une prolifration accrue qui fut attnue par le losartan, un antagoniste du rcepteur AT1 de lAngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des rcepteurs ETA et ETB de lET-1. La prolifration accrue des CMLV de SHR fut ramene celle des WKY par les inhibiteurs des rcepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du rcepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR compare celle des WKY, fut attnue par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et lAG-1478, mais ne fut pas attnue par lAG-1295 et lAG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut attnue par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des rcepteurs aux facteurs de croissance. Paralllement, le rle de la transactivation de EGF-R dans la prolifration accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examin dans les CMLV A-10. Laugmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifration et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramene au niveau contrle par AG-1478. Ces donnes suggrent que les peptides vasoactifs endognes induisent la prolifration accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases rsultant de la transactivation de EGF-R.
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La sclrose systmique (ScS) est une maladie auto-immune dont lun des principaux auto-anticorps, dirig contre la protine centromrique B (CENP-B), est fortement associ lhypertension artrielle pulmonaire, lune des causes majeures de dcs d la ScS. Lhypertension rsulte de locclusion progressive des vaisseaux suite une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs tudes rcentes ont dmontr que certains auto-antignes possdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois librs par ncrose ou apoptose, ces auto-antignes adoptent une activit biologique qui s'apparente celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de rparation de blessure et/ou acqurir une activit pathogne qui contribue au dveloppement de certaines maladies auto-immunes. Nos rsultats suggrent que la CENP-B peut tre ajoute cette liste de molcules bifonctionnelles. l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytomtrie en flux, nous avons dmontr que la CENP-B se liait spcifiquement la surface des CML vasculaire de lartre pulmonaire avec une plus grande affinit pour le phnotype contractile que synthtique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la scrtion de cytokines pro-inflammatoires telles que linterleukine 6 et 8. Les mcanismes par lesquels la protine exerait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des tudes de signalisation intracellulaire effectues laide de plusieurs inhibiteurs spcifiques ainsi que des tudes de dsensibilisation nous ont permis didentifier le rcepteur de la CENP-B en plus didentifier les mcanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons dmontr que la CENP-B se liait de manire spcifique aux CML vasculaire via le rcepteur de chmokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le rcepteur EGF, selon un mcanisme mtalloprotase-dpendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans lactivation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la scrtion dIL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons dmontr que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empchant ainsi la CENP-B dexercer son rle de cytokine. Lidentification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant ltude du rle pathogne des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.
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L'angiotensine-II (Ang-II), synthtise partir de sources extracardiaques et intracardiaques, rgule l'homostasie cardiaque en favorisant des effets mitogniques et en promouvant la croissance cellulaire rsultant dune altration de l'expression gnique. Dans cette tude, nous avons valu la possibilit que les rcepteurs de l'angiotensine-1 (AT1) ou les rcepteurs de l'angiotensine-2 (AT2) situs sur l'enveloppe nuclaire rgulent lexpression gnique des cardiomyocytes. En analysant les noyaux cellulaires retenus des fractions de cur de rat par immunobuvardage Western, nous avons dtect une co-purification prfrentielle des protines AT1 et AT2 avec un marqueur de la membrane nuclaire (Nup 62), par rapport aux marqueurs de la membrane plasmique (Calpactin I), de lappareil de Golgi (GRP 78) ou du rticulum endoplasmique (GM130). La microscopie confocale a permis de dmontrer la prsence des AT1 et AT2 dans les membranes nuclaires. La microinjection de lAng-II-FITC sur des cardiomyocytes a provoqu une liaison de prfrence aux sites nuclaires. Les enregistrements de transients calciques ont illustr que les AT1 nuclaires rgulent le relchement du Ca2+. Lincubation des ligands spcifiques dAT1 et dAT2 avec lUTP [32P] a rsult en une synthse de novo dARN (par exemple, 16,9 0,5 cpm/ng ADN contrle vs 162,4 29,7 cpm/ng ADN-Ang II, 219,4 8,2 cpm/ng ADN L -162313 (AT1) et 126,5 8,7 cpm/ng ADN CGP42112A (AT2), P <0,001). Lincubation des noyaux avec Ang-II augmente de faon significative lexpression de NFB, une rponse qui est rprime partiellement par la co-administration de valsartan ou de PD123177. Les expriences dose-rponse avec Ang-II administre l'ensemble des noyaux purifis vs. aux cardiomyocytes seuls a montr une augmentation plus importante dans les niveaux d'ARNm de NFB avec une affinit de ~ 3 fois plus grande (valeurs dEC50 = 9 contre 28 pmol/L, respectivement), suggrant un rle prfrentiel nuclaire dans la signalisation. Par consquent, nous avons conclu que les membranes cardiaques nuclaires possdent des rcepteurs dAng-II coupls des voies de signalisation et la transcription gnique. La signalisation nuclaire pourrait jouer un rle cl dans les changements de l'expression de gnes cardiaques, entranant ainsi des implications mcanistiques et thrapeutiques diverses.
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Lostoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes ges. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie cause des cots conomiques quelle engendre mais surtout cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractrise par une dgradation du cartilage articulaire, une sclrose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la prsence dostophytes. Ltiologie de cette pathologie est reste nbuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rle cl de los sous-chondral dans lOA est maintenant reconnu. Lobsit tant un facteur de risque de lOA, nous avons mis lhypothse que la leptine, une adipocytokine cl dans lobsit, joue un rle important dans lOA. En effet, la leptine modifie le phnotype des ostoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phnotype altr, notre objectif tait de dterminer le rle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons prpar des cultures primaires dOb issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et dindividus normaux (N). Lexpression de la leptine et de son rcepteur actif (OB-Rb) ont t mesures par RT-PCR en temps rel, et leur production a t mesure par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifration des Ob OA a t dtermine par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a t dtermine par IB. Le phnotype des Ob fut dtermin par la mesure de lactivit de la phosphatase alcaline (ALP) et la scrtion dostocalcine (OC), en prsence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs dinterfrences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phnotype des Ob OA furent dtermins via leur impact sur lactivit de lALP et sur la scrtion dOC. Leffet dose-rponse de la leptine sur les expressions dOB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent dtermines par RT-PCR en temps rel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a t tudie en valuant leffet dose rponse de celle-ci sur la production des protines JAK2 et STAT3 phosphoryles par IB. Les rsultats obtenus ont montrs que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phnotypique, ces Ob OA possdent une activit de lALP ainsi quune scrtion dOC plus importante que celles observes chez les Ob N. Lajout danticorps inactivant linteraction leptine et OB-Rb ou dinhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminurent lactivit de lALP ainsi que la scrtion dOC dans les Ob OA. Par contre, lajout de leptine exogne aux Ob OA augmenta lactivit de lALP sans pour autant faire varier la scrtion dOC. La leptine des doses de 1ng/ml 10mg/ml stimula la prolifration des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogne diminua lexpression de TFG-1 tandis quelle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manire dose-dpendante. Cependant, lexpression dOB-Rb diminua de manire dose-dpendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua lactivit dALP, la scrtion dOC, lexpression de la leptine, lexpression dOB-RB ainsi que lexpression du facteur TGF-1. Lensemble de ces donnes dmontre que la leptine endogne des Ob OA est sous contrle des facteurs de croissance et quelle contribue maintenir le phnotype anormal de los sous-chondral OA. De plus, ceci suggre que la leptine serait un acteur important dans la rgulation du remodelage osseux.
