Voies de signalisation non-canoniques du récepteur V2 de la vasopressine

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.

Altération du couplage neurovasculaire par l'angiotensine II : évaluation du rôle de la signalisation calcique astrocytaire

Le couplage neurovasculaire (CNV) est un mécanisme d’homéostasie cérébrale régulant le débit sanguin cérébral (CBF) en fonction de l’activité neuronale. La manière dont il est altéré par l’angiotensine II (Ang II), une hormone synthétisée et relâchée dans la circulation systémique ou, alternativement, produite dans le cerveau grâce aux astrocytes, demeure à élucider. Ces cellules expriment le récepteur AT1 (rAT1) et participent à l’orchestration du CNV en relâchant des agents vasoactifs suivant la réponse calcique astrocytaire. Nous avons donc étudié le rôle de cette réponse dans l’altération du CNV induite par l’Ang II. Nous avons trouvé par fluxmétrie par laser Doppler que l’Ang II atténue (p<0.05) la réponse du CBF engendrée par l’activation des récepteurs métabotropes du glutamate du groupe I (mGluRI) du cortex chez la souris C57BL/6. De manière similaire, l’Ang II diminue l'élévation du CBF induite par la stimulation des vibrisses (p<0.05). Sur tranches de cerveaux en aiguë, la polarité de la réponse vasculaire induite par un agoniste mGluRI dans les artérioles parenchymateuses a été significativement renversée par l’Ang II de la vasodilatation vers la vasoconstriction. En parallèle, l’Ang II a augmenté les niveaux de calcium astrocytaire basaux et l’amplitude des réponses calciques (p<0.05). L’altération des réponses vasculaires et calciques maximales a été prévenue par le candesartan, antagoniste des rAT1. Nos résultats suggèrent que l’Ang II potentialise via les rAT1 la réponse calcique qui atteint un seuil favorisant la vasoconstriction par rapport à la vasodilatation, altérant ainsi l’augmentation du CBF en réponse à l’activité neuronale.

Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.

Effets motivationnels des cannabinoïdes dans un modèle animal de la schizophrénie

Depuis quelques décennies, la consommation de cannabis et son usage thérapeutique sont le sujet de nombreux débats. Le cannabis est la drogue illicite la plus consommée au monde et cette consommation se trouve dix fois plus élevée chez les patients atteints de schizophrénie que dans la population générale. L’hypothèse d’une automédication initialement proposée afin d’expliquer la consommation élevée de cannabis chez les patients atteints de schizophrénie est maintenant remise en question. En effet, les rapports indiquant une aggravation des symptômes plutôt qu’une amélioration suite à une consommation à long terme sont de plus en plus nombreux. Sachant que le cannabis peut induire des effets soit plaisants soit aversifs, la question se pose à savoir si une prédominance de la valence motivationnelle positive ou une diminution de la valence négative du cannabis peut expliquer la consommation élevée parmi les individus ayant un diagnostic de schizophrénie? Bien qu’un grand nombre de recherches pré-cliniques aient été menées chez l’animal normal pour évaluer l’effet motivationnel du Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) et autres cannabinoïdes synthétiques, aucune n’a abordé cette problématique dans un modèle animal de la schizophrénie. Cette lacune nous a donc amené à étudier la valence motivationnelle du THC et de l’agoniste cannabinoïde WIN55,212-2 (WIN) dans un modèle animal de la schizophrénie: la lésion néonatale de l’hippocampe ventral (NVHL). Dans le premier article, nous présentons les résultats de quatre expériences. Une première avait pour objectif de déterminer si la procédure expérimentale que nous avons utilisée permettait de reproduire des signes distinctifs du modèle animal de la schizophrénie. Par la suite, nous avons évalué i) l’effet d’une dose de WIN sur l’activité locomotrice spontanée et ii) la valence motivationnelle du THC (0.5 mg/kg, i.p) et du WIN (1 mg/kg, i.p) chez les rats adolescents (jour post-natal 28-40, PD28-40) et adultes (PD56) au moyen du paradigme de préférence de place conditionnée (PPC). Tel qu’attendu, la réponse locomotrice à l’amphétamine (0.75 et 1.5 mg/kg) chez les rats NVHL adultes était supérieure à celle des rats contrôles (test distinctif du modèle). Le THC a induit une tendance aversive chez les rats contrôles adultes. Enfin, le WIN a stimulé l’activité locomotrice et induit une aversion significative chez les rats adultes NVHL. Dans un deuxième article, nous avons évalué la valence motivationnelle du THC (0.5 mg/kg), du WIN (1 et 3 mg/kg) et l’effet de l’amphétamine au moyen du paradigme d’autostimulation électrique intracérébrale (ASI). Les résultats montrent que : i) l’effet amplificateur de l’amphétamine sur l’ASI était de plus courte durée chez les rats NVHL; ii) le THC produit une légère atténuation de la récompense chez les rats contrôles tandis que le WIN a produit une atténuation plus prononcée de la récompense chez les rats NVHL, un effet qui a été bloqué par l’antagoniste aux récepteurs CB1, le AM251 (3 mg/kg). Pour la première fois les résultats suggèrent une altération du système endocannabinoïde dans un modèle animal de la schizophrénie. Ils indiquent qu’une exposition aigüe conduit à une prédominance de la valence négative. Bien qu’en apparente contradiction avec les études cliniques, ces résultats soulignent l’importance du contexte socio-environnemental pour expliquer les effets du cannabis chez les patients. De plus ils encouragent les futures études à évaluer cette valence sur un modèle d’exposition chronique.

Traitement des mélanges par le système trigéminal

Le système trigéminal –tout comme l’olfaction et la gustation– est un sens chimique qui permet la perception des informations chimiosensorielles de notre environnement. Contrairement à l’olfaction et à la gustation, notre connaissance du traitement des mélanges par le système trigéminal est limitée. Nous avons donc utilisé des mélanges de trois agonistes relativement spécifiques à des récepteurs (eucalyptol, agoniste TRPM8; aldéhyde cinnamique, agoniste TRPA1 ; camphre, agoniste TRPV1) et d’une odeur pure (alcool phényléthylique) dans différentes proportions afin de déterminer les dimensions de base de la perception trigéminale. Quatre dimensions principales se sont avérées pertinentes: l’intensité, la sensation de chaleur, la sensation de froid et la douleur. Nous avons utilisé ces dimensions pour étudier la perception de mélanges et de combinaisons dans différentes proportions d’un stimulus qui procure une sensation de froid (eucalyptol) et d’un stimulus qui procure une sensation de chaleur (aldéhyde cinnamique). Les résultats indiquent que les mélanges obtiennent généralement des scores plus élevés que les combinaisons sur les dimensions « intensité », « sensation de chaleur » et « douleur » alors que les combinaisons obtiennent des scores plus élevés sur la dimension « sensation de froid ». Ces résultats suggèrent des interactions spécifiques pour les différentes dimensions de la perception trigéminale. Nous en venons à la conclusion d’un effet d’additivité pour les mélanges sur les dimensions « intensité », « sensation de chaleur » et « douleur » alors que nous observons plutôt un effet de suppression de la perception de froid pour les deux stimuli dans les mélanges, ce qui semble indiquer des interactions particulières pouvant prendre place aux niveaux périphérique ou central.

Rôle de la plasticité synaptique des interneurones somatostatinergiques dans l’apprentissage et la mémoire dépendants de l’hippocampe

La plasticité synaptique activité-dépendante forme la base physiologique de l’apprentissage et de la mémoire dépendants de l’hippocampe. Le rôle joué par les différents sous-types d’interneurones dans l’apprentissage et la mémoire hippocampiques reste inconnu, mais repose probablement sur des mécanismes de la plasticité spécifique aux synapses de certains sous-types d’interneurones. Les synapses excitatrices établies sur les interneurones de l’oriens-alveus dans l’aire CA1 exhibent une forme persistante de potentialisation à long terme induite par la stimulation chimique des récepteurs métabotropiques du glutamate de type 1 (mGluR1) [mGluR1-mediated chemical late long-term potentiation (cL-LTPmGluR1)]. Le présent projet de recherche avait pour objectifs d’identifier les sous-types d’interneurones de l’oriens-alveus exprimant la cL-LTPmGluR1 et d’examiner les mécanismes d’induction et d’expression de celle-ci. Nous avons déterminé que la stimulation répétée des mGluR1 induit de la cL-LTPmGluR1 aux synapses excitatrices établies sur le sous-type d’interneurones exprimant le peptide somatostatine (SOM-INs). Des enregistrements électrophysiologiques couplés à des inhibiteurs pharmacologiques et à un knock-out fonctionnel de mammalian target of rapamycin complexe 1 (mTORC1) ont montré que l’induction de la cL-LTPmGluR1 (qui consiste en trois applications de l’agoniste des mGluR1/5, le (S)-3,5-dihydroxyphénylglycine (DHPG) en présence de l’antagoniste des récepteurs métabotropiques du glutamate de type 5 (mGluR5), le 2-méthyl-6-(phényléthynyl)-pyridine (MPEP)) des SOM-INs requiert les voies de signalisation des mGluR1, de extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) et de mTORC1. L’ensemble de nos résultats montre qu’une forme persistante de plasticité synaptique sous-tendue par mTORC1 est induite par la stimulation répétée des mGluR1 dans les interneurones hippocampiques exprimant le peptide somatostatine. La connaissance des mécanismes sous-tendant la cL-LTPmGluR1, couplée à l’utilisation de modèles animal in vivo, rendront maintenant possible le blocage de la cL-LTPmGluR1 dans les SOM-INs et l’examen de son rôle dans l’apprentissage et la mémoire dépendants de l’hippocampe.

Administration de [6]-gingérol intrathécal pour le traitement de la douleur neuropathique chez le rat mâle Sprague-Dawley

Le [6]-gingérol est un analogue structurel de la capsaïcine, une molécule agoniste au récepteurs TRPV1 et ayant des propriétés thérapeutiques connues dans le traitement de la douleur. Deux objectifs principaux ont été poursuivis lors de la réalisation de ce projet de recherche. D’abord, établir une meilleure caractérisation du métabolisme du [6]-gingérol chez le rat. Pour ce faire, une méthode sensible et spécifique pour la quantification du [6]-gingérol et ses métabolites par HPLC-ESI/MS/MS a été développée. Une étude de stabilité métabolique in vitro utilisant des microsomes hépatiques de rats a ensuite été réalisée. Les résultats démontrent une dégradation lente avec un temps de demi-vie de 163 minutes et une clairance intrinsèque relativement basse de 0.0043 mL/min. D’autres analyses ont ensuite été performées pour caractériser les métabolites in vitro et in vivo. Trois principaux métabolites de phase I et quatre métabolites de phase II ont été identifiés par HPLC-MS/MS et HPLC-MSD TOF. Les résultats suggèrent que le principal métabolite excrété dans l’urine est un glucuronide du [6]-gingérol hydroxylé. Le second objectif de ce projet était de déterminer l’effet central du [6]-gingérol sur la douleur neuropathique lorsqu’injecté par voie intrathécale. La distribution de la molécule a d’abord été évaluée suite à une administration intra-péritonéale de 40 mg/kg de [6]-gingérol et les ratios des concentrations cerveau-plasma et moelle épinière-plasma (0.73 et 1.7, respectivement) suggèrent que le [6]-gingérol se distribue efficacement au niveau du système nerveux central. Une injection intrathécale de 10 μg de [6]-gingérol à été performée chez les rats suite à l’induction de douleur par la pose de ligatures au niveau du nerf sciatique. Les résultats suggèrent une réduction significative de l’allodynie mécanique et de l’hyperalgésie thermique à 30 min, 2 h et 4 h suivant l’injection (p < 0.05, p < 0.01 et p < 0.001). Le [6]-gingérol se distribue donc adéquatement au niveau du système nerveux central des rats, permettant une action au niveau des récepteurs TRPV1. Ainsi, le [6]-gingérol pourrait soulager la douleur neuropathique en agissant centralement au niveau de la moelle épinière.

The Independence of CXCR4’s Pathways, Gαi and β-Arrestin2, and Their Modulation by AMD3100 and TC14012

CXCR4, a chemokine receptor involved in metastasis and homing of hematopoietic stem cells, signals through two major pathways: Gαi and β-arrestin2. β-arrestin2 terminates G-protein signaling and targets the receptor to endocytosis. This project proposed to study the effect of a previously described set of CXCR4 mutants on both these signaling pathways, as well as their localization. These mutants were assayed by different Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) systems. Using these systems, we confirmed that N119S is a constitutively active mutant (CAM), spontaneously activating Gαi. As well, we found that R134A is a constitutively inactive mutant (CIM), devoided of G-protein signaling, but spontaneously recruiting β-arrestin2. In addition, we studied the dependency of β-arrestin2 recruitment on the Gαi activity. By targeting R134A and N119S with pertussis toxin, an inhibitor of the Gαi activation, we showed efficient blocking of the Gαi pathway, while maintaining the constitutive recruitment of β-arrestin2. This demonstrated that for CXCR4, β-arrestin2 recruitment is independent of the Gαi pathway. Finally, two synthetic ligands of CXCR4, AMD3100 and TC14012 were tested for their ability to recruit β-arrestin2. AMD3100 is a clinically approved drug used for stem cell transplantation, with considerable side effects. We found it to be an antagonist on both Gαi and β-arrestin2 recruitment. On the other hand, TC14012 was found to be an inverse agonist on Gαi and an antagonist on β-arrestin2 recruitment. Based on this finding, it would be preferable to use of TC14012 as it will further reduce any basal Gαi activity, without affecting β-arrestin2 recruitment. These results support the development of TC14012 for stem cell mobilization trials.

Recognition of hepatitis C virus RNA by toll like receptors 7 and 8 : implications for the initiation of innate immune response

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus à ARN simple brin positif (ssARN) qui se replique dans le foie. Deux cents millions de personnes sont infectées par le virus dans le monde et environ 80% d’entre elles progresseront vers un stade chronique de l’infection. Les thérapies anti-virales actuelles comme l’interféron (IFN) ou la ribavirin sont de plus en plus utilisées mais ne sont efficaces que dans la moitié des individus traités et sont souvent accompagnées d’une toxicité ou d’effets secondaires indésirables. Le système immunitaire inné est essentiel au contrôle des infections virales. Les réponses immunitaires innées sont activées suite à la reconnaissance par les Pathogen Recognition Receptors (PRRs), de motifs macromoléculaires dérivés du virus appelés Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Bien que l'activation du système immunitaire par l'ARN ou les protéines du VHC ait été largement étudiée, très peu de choses sont actuellement connues concernant la détection du virus par le système immunitaire inné. Et même si l’on peut très rapidement déceler des réponses immunes in vivo après infection par le VHC, l’augmentation progressive et continue de la charge virale met en évidence une incapacité du système immunitaire à contrôler l’infection virale. Une meilleure compréhension des mécanismes d’activation du système immunitaire par le VHC semble, par conséquent, essentielle au développement de stratégies antivirales plus efficaces. Dans le présent travail nous montrons, dans un modèle de cellule primaire, que le génome ARN du VHC contient des séquences riches en GU capables de stimuler spécifiquement les récepteurs de type Toll (TLR) 7 et 8. Cette stimulation a pour conséquence la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs), le production d’interféron de type I (IFN) ainsi que l’induction de chémokines et cytokines inflammatoires par les différentes types de cellules présentatrices d’antigènes (APCs). Les cytokines produites après stimulation de monocytes ou de pDCs par ces séquences ssARN virales, inhibent la production du virus de façon dépendante de l’IFN. En revanche, les cytokines produites après stimulation de cellules dendritiques myéloïdes (mDCs) ou de macrophages par ces mêmes séquences n’ont pas d’effet inhibiteur sur la production virale car les séquences ssARN virales n’induisent pas la production d’IFN par ces cellules. Les cytokines produites après stimulation des TLR 7/8 ont également pour effet de diminuer, de façon indépendante de l’IFN, l’expression du récepteur au VHC (CD81) sur la lignée cellulaire Huh7.5, ce qui pourrait avoir pour conséquence de restreindre l’infection par le VHC. Quoiqu’il en soit, même si les récepteurs au VHC comme le CD81 sont largement exprimés à la surface de différentes sous populations lymphocytaires, les DCs et les monocytes ne répondent pas aux VHC, Nos résultats indiquent que seuls les macrophages sont capables de reconnaître le VHC et de produire des cytokines inflammatoires en réponse à ce dernier. La reconnaissance du VHC par les macrophages est liée à l’expression membranaire de DC-SIGN et l’engagement des TLR 7/8 qui en résulte. Comme d’autres agonistes du TLR 7/8, le VHC stimule la production de cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-8, IL-6 et IL-1b) mais n’induit pas la production d’interféron-beta par les macrophages. De manière attendue, la production de cytokines par des macrophages stimulés par les ligands du TLR 7/8 ou les séquences ssARN virales n’inhibent pas la réplication virale. Nos résultats mettent en évidence la capacité des séquences ssARN dérivées du VHC à stimuler les TLR 7/8 dans différentes populations de DC et à initier une réponse immunitaire innée qui aboutit à la suppression de la réplication virale de façon dépendante de l’IFN. Quoiqu’il en soit, le VHC est capable d’échapper à sa reconnaissance par les monocytes et les DCs qui ont le potentiel pour produire de l’IFN et inhiber la réplication virale après engagement des TLR 7/8. Les macrophages possèdent quant à eux la capacité de reconnaître le VHC grâce en partie à l’expression de DC-SIGN à leur surface, mais n’inhibent pas la réplication du virus car ils ne produisent pas d’IFN. L’échappement du VHC aux défenses antivirales pourrait ainsi expliquer l’échec du système immunitaire inné à contrôler l’infection par le VHC. De plus, la production de cytokines inflammatoires observée après stimulation in vitro des macrophages par le VHC suggère leur potentielle contribution dans l’inflammation que l’on retrouve chez les individus infectés par le VHC.

Study of nuclear receptor dynamics by BRET

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire. L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques, leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Effet de la galanine sur le système nerveux cardiaque intrinsèque.‎

Les neurones cholinergiques et adrénergiques efférents du système nerveux cardiaque ‎intrinsèque (SNCI) sont impliqués dans la régulation de la fonction cardiaque chronotrope. ‎La galanine, peptide présent et libéré dans les terminaisons nerveuses cardiaques, est capable ‎de diminuer la libération de l’acétylcholine. Notre hypothèse est d’étudier la possibilité que ‎la galanine puisse agir comme un peptide neuromodulateur inhibiteur dans les neurones du ‎SNCI chez le rat. Les oreillettes et les tissus associés du SNCI sont isolés à partir de rats ‎Sprague-Dawley et perfusés en vitro. Les valeurs de la fréquence auriculaire mesurées d’un ‎battement à l’autre sont tirées à partir d’un enregistrement bipolaire auriculaire. La perfusion ‎de la nicotine en forme de bolus (avec des concentrations dans le bain de 20-250 µm) a ‎induit des réponses biphasiques composées d’une réponse chronotrope négative au début ‎suivie d’une réponse chronotrope positive. Au cours de la superfusion de la galanine ‎‎(170 nM), les réponses chronotropes positives à la nicotine sont réduites chez 12/14 ‎préparations (contrôle : 21,35 ± 17,4 à galanine : 5,46 ± 8,0 bpm, n = 14, p = 0,02), tandis que ‎les réponses chronotropes négatives sont réduites chez 8 /14 préparations et affichent une ‎tendance générale vers la réduction (contrôle : -16,09 ± 14,7, galanine : -12,53 ± 13,2 bpm). ‎On peut conclure que la galanine agit comme un peptide neuromodulateur inhibiteur dans les ‎SNCI chez le rat, en modifiant de préférence la stimulation nicotinique de neurones ‎adrénergiques.‎

Régulation du complexe constitutif formé par le récepteur opioïde delta et le canal potassique de la famille Kir3

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces dans le traitement des douleurs sévères. Ils produisent leurs effets en ciblant spécifiquement les récepteurs opioïdes localisés tout le long de la voie de perception de la douleur où ils modulent la transmission de l'information douloureuse. La plupart des études dans ce domaine essaient de caractériser les récepteurs opioïdes à l'état isolé de tout partenaire de signalisation. Cette thèse, par contre, montre que le récepteur opioïde delta (DOR) peut former un complexe avec sa protéine G et l'un de ses effecteurs impliqués dans la production de l'effet analgésique, le canal potassique à rectification entrante activée par les protéines G (Kir3 ou GIRK). Après avoir établi la présence de ce complexe constitutif, on a ensuite caractérisé sa stabilité, modulation et régulation suite à une stimulation avec des agonistes opioïdes. En premier lieu, on a caractérisé la transmission de l'information du récepteur DOR, suite à son activation par un agoniste, vers le canal Kir3. On a remarqué que cette transmission ne suit pas le modèle de collision, généralement accepté, mais nécessite plutôt un simple changement dans la conformation du complexe préformé. Ensuite, on a déterminé que même suite à l'activation prolongée du récepteur DOR par un agoniste complet, le complexe DOR/Kir3 maintenait son intégrité et a été reconnu par la βarrestine (βarr) comme une seule unité signalétique provoquant ainsi l'internalisation de DOR et Kir3 par un mécanisme clathrine et dynamine-dépendant. Ainsi, prises ensemble, ces données montrent que l'activation du récepteur DOR déclenche non seulement l'activation de l'effecteur Kir3 mais également un mécanisme de régulation qui élimine cet effecteur de la membrane plasmique.

Le CpG et le poly(I:C) agissent en synergie avec le trastuzumab contre le cancer du sein HER2+

Chez la souris, la thérapie anti-HER2 est dépendante de la présence de cellules T CD8+IFN-γ+ et des réponses IFN de type I. Ces IFN sont induits par les TLRs suite à la reconnaissance de signaux de danger, appelés PAMPs et DAMPs. Les TLR-3 et TLR-9 sont tous deux de bons inducteurs d’IFN de type I et sont également capable d’agir en synergie afin d’augmenter les niveaux d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-12. Notre hypothèse fut que la stimulation de ces deux TLRs mènerait à l’amélioration de l’activité anti-tumorale du trastuzumab via le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Nos buts furent de confirmer le potentiel thérapeutique de la combinaison de l’anticorps anti-HER2, de l’agoniste de TLR-3, le poly(I:C), et de l’agoniste de TLR-9, le CpG ODN. Des études in vivo et in vitro nous ont permis de découvrir une synergie entre ces agents qui résulte en une cytotoxicité ciblée plus efficace. De plus, cette thérapie s’avéra efficace chez des modèles CD8-dépendants et CD8-indépendents. Les souris purent rejeter leur tumeur et demeurer sains plusieurs semaines après l’arrêt des injections. Ces souris étaient également protégées lors d’un challenge, soulignant ainsi la présence d’une immunité mémoire. Nous avons aussi découvert que l’administration combine de trastuzumab des deux agonistes de TLRs mène à des réponses systémiques. Des études de déplétion confirmèrent que les cellules T CD8+ sont cruciales pour la protection à long terme des animaux, mais que les pDC sont moins impliquées que ce que l’on pourrait croire. Leur absence n’a que modestement affecté les effets de notre thérapie. À l’opposé, les cellules NK sont d’importants médiateurs des effets thérapeutiques. Des expériences d’ADCC ont révélé que le CpG ODN et poly(I:C) ont tous deux la capacité d’améliorer les fonctions des cellules NK, mais que la stimulation simultanée des TLR-3 et TLR-9 permet de maximiser les effets bénéfiques du trastuzumab. De la même manière, l’addition de CpG ODN et de poly(I:C) aux anticorps anti-HER2 a permis d’augmenter les réponses pro-inflammatoires, plus spécifiquement l’IFN-γ, le TNF-α, l’IP-10 et l’IL-12.

Régulation de l'expression de PPARγ dans l'arthrose

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite.