The Development, Validation and Implementation of a Broad-Based ADME Genotyping Assay into Research and Clinical Trials

Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion (ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de 3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet, les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%. L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés. Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une longue liste complète de gènes d’ADME.

La validité diagnostique des tests cliniques et l’efficacité des traitements en réadaptation pour l’instabilité gléno-humérale: Une revue systématique

Travail d'intégration réalisé dans le cadre du cours PHT-6113.

Approximation du calcul de la taille échantillonnale pour les tests à hypothèses multiples lorsque r parmis m hypothèses doivent être significatives

Généralement, dans les situations d’hypothèses multiples on cherche à rejeter toutes les hypothèses ou bien une seule d’entre d’elles. Depuis quelques temps on voit apparaître le besoin de répondre à la question : « Peut-on rejeter au moins r hypothèses ? ». Toutefois, les outils statisques pour répondre à cette question sont rares dans la littérature. Nous avons donc entrepris de développer les formules générales de puissance pour les procédures les plus utilisées, soit celles de Bonferroni, de Hochberg et de Holm. Nous avons développé un package R pour le calcul de la taille échantilonnalle pour les tests à hypothèses multiples (multiple endpoints), où l’on désire qu’au moins r des m hypothèses soient significatives. Nous nous limitons au cas où toutes les variables sont continues et nous présentons quatre situations différentes qui dépendent de la structure de la matrice de variance-covariance des données.

L'évaluation des tests génétiques : considérations normatives et contextuelles

L’objectif de ce mémoire vise à exposer les méthodes d’évaluation propres aux tests génétiques. Le mémoire se penche également sur le recours grandissant, par des instances locales, aux services de génétique dispensés par des laboratoires internationaux. Le premier article propose une recension des modèles d'évaluation propres aux tests génétiques et une analyse de leur situation sur le parcours translationnel. L'article expose les origines de ces modèles, leurs attributs et particularités distinctives et spécifie le public cible auquel ils sont destinés. L'analyse comparative des modèles d'évaluation permet de mettre en relief leurs apports et limites respectives. Les critères évaluatifs de chaque modèles sont situés le long du parcours translationnel permettant de mettre en évidence les types d'évaluations nécessaires à chacune des phases de progression des tests génétiques le long du continuum menant à leur utilisation. Le second article adopte une tangente pragmatique et se penche sur l'utilisation effective des tests génétiques dans un centre hospitalier universitaire pédiatrique. Plus spécifiquement, l'article dresse un portrait exhaustif de l'ensemble des tests génétiques moléculaires réalisés à l’extérieur du Québec par le CHU Sainte-Justine en 2009 étant donné l’augmentation des tests disponibles internationalement comparativement à ceux offerts à l’interne. Vu la globalisation des envois d'échantillons vers des laboratoires localisés à l'étranger, l'objectif est de décrire l’état de la situation actuelle et d’identifier des cibles potentielles pour l’amélioration des processus et le développement de tests localement. L'évaluation des tests génétiques est abordée sous une double perspective: les considérations normatives liées à l'évaluation des tests génétiques tel que préconisé par les différents modèles d'évaluation ainsi que d'un point de vue pratique dans le contexte particulier d'un centre hospitalier universitaire.

Le progiciel PoweR : un outil de recherche reproductible pour faciliter les calculs de puissance de certains tests d'hypothèses au moyen de simulations de Monte Carlo

Notre progiciel PoweR vise à faciliter l'obtention ou la vérification des études empiriques de puissance pour les tests d'ajustement. En tant que tel, il peut être considéré comme un outil de calcul de recherche reproductible, car il devient très facile à reproduire (ou détecter les erreurs) des résultats de simulation déjà publiés dans la littérature. En utilisant notre progiciel, il devient facile de concevoir de nouvelles études de simulation. Les valeurs critiques et puissances de nombreuses statistiques de tests sous une grande variété de distributions alternatives sont obtenues très rapidement et avec précision en utilisant un C/C++ et R environnement. On peut même compter sur le progiciel snow de R pour le calcul parallèle, en utilisant un processeur multicœur. Les résultats peuvent être affichés en utilisant des tables latex ou des graphiques spécialisés, qui peuvent être incorporés directement dans vos publications. Ce document donne un aperçu des principaux objectifs et les principes de conception ainsi que les stratégies d'adaptation et d'extension.

Facteurs de risque d’insuffisance rénale chronique chez les greffés cardiaques : du phénotype aux tests pharmacogénomiques

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est un problème majeur fréquemment rencontré chez les greffés cardiaques. Les inhibiteurs de la calcineurine, pierre angulaire de l’immunosuppression en transplantation d’organes solides, sont considérés comme une des principales causes de dysfonction rénale postgreffe. Plusieurs autres éléments tels que les caractéristiques démographiques, cliniques et génétiques du receveur contribuent également au phénomène, mais il demeure plutôt difficile de déterminer quels sont les patients les plus à risque de développer une IRC après la transplantation. Ainsi, la découverte de nouveaux marqueurs génétiques de dysfonction rénale pourrait un jour mener à l’individualisation de la thérapie immunosuppressive selon le profil génétique de chaque patient. Or, on ne connaît pas les opinions des greffés à l’égard des tests pharmacogénomiques et l’on ne sait pas si celles-ci diffèrent des opinions exprimées par les individus en bonne santé. Cette thèse de doctorat a donc pour objectifs : 1- De décrire l’évolution de la fonction rénale à très long terme après la transplantation et d’identifier les marqueurs démographiques et phénotypiques associés à l’IRC postgreffe cardiaque; 2- D’identifier les marqueurs génétiques associés à la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine; 3- D’évaluer et de comparer les attitudes des patients et des individus en bonne santé par rapport à l’intégration clinique potentielle des marqueurs pharmacogénomiques. Trois projets ont été réalisés pour répondre à ces questions. Le premier repose sur une analyse rétrospective de l’évolution de la fonction rénale chez les patients greffés au sein de notre établissement entre 1983 et 2008. Nous y avons découvert que le déclin de la fonction rénale se poursuit jusqu’à 20 ans après la transplantation cardiaque et que les facteurs de risque d’IRC incluent entre autres l’âge avancé, le sexe féminin, la dysfonction rénale prégreffe, l’hypertension, l’hyperglycémie et l’utilisation de la prednisone. Le deuxième projet est une étude pharmacogénomique s’intéressant aux déterminants génétiques de la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine. Elle nous a permis d’illustrer pour la première fois qu’un polymorphisme génétique lié à PRKCB (gène codant pour la protéine kinase C-β) est associé avec la fonction rénale des patients greffés cardiaques, alors que cela n’est probablement pas le cas pour les polymorphismes de TGFB1 (gène codant pour le transforming growth factor-β1). La troisième section de cette thèse rapporte les résultats d’un questionnaire dont le but était de comparer les attitudes envers les tests pharmacogénomiques parmi un groupe de personnes en bonne santé, de patients greffés cardiaques et de patients souffrant d’insuffisance cardiaque. Cette étude a démontré que, bien que l’enthousiasme pour la pharmacogénomique soit partagé par tous ces individus, les craintes liées à la confidentialité et aux répercussions potentielles sur l’emploi et les assurances sont plus prononcées chez les personnes en bonne santé. En résumé, les travaux issus de cette thèse ont révélé que l’identification précoce des patients greffés cardiaques les plus susceptibles de présenter une détérioration de la fonction rénale ainsi que l’adoption d’une approche thérapeutique individualisée reposant notamment sur les applications cliniques de la pharmacogénomique pourraient éventuellement permettre de freiner cette complication postgreffe.

Le diagnostic des tuméfactions latérales solides cervicales chez l'enfant

Introduction : Faute de tests diagnostiques précis, une étude histologique est souvent nécessaire pour diagnostiquer les tuméfactions latérales solides cervicales (TLSC) chez l’enfant. Nous étudierons les modalités diagnostiques pour les TLSC afin de créer une approche diagnostique standardisée intégrant de nouveaux outils diagnostics à ceux actuellement offerts. Méthodologie : Après révision des étiologies et des modalités diagnostiques, une revue de la littérature a été effectuée. Une étude rétrospective entre 2002 à 2012 est présentée suivie d’une étude de faisabilité de la cytoponction. Puis, un arbre décisionnel est créé basé sur nos résultats et sur l’avis d’un groupe d’experts de différentes disciplines médicales. Résultats : Le diagnostic différentiel des TLSC est varié, la littérature scientifique est désuète et la comparaison reste difficile. Pour nos 42 enfants avec un âge médian de sept ans, les tuméfactions inflammatoires représentent 59% (26/44 biopsies) des TLSC, surtout des lymphadénites à mycobactérie atypique (13/26) qui ont un dépistage ardu et multimodal. La biopsie fut peu contributive à la prise en charge dans 39% (17/44) des cas. La cytoponction sous échoguidance est une technique diagnostique faisable et moins invasive que la biopsie. L’arbre décisionnel offre aux cliniciens une approche diagnostique standardisée des TLSC appuyée sur des faits scientifiques que nous souhaitons valider par une étude prospective. Conclusion : Les TLSC chez l’enfant représentent un défi diagnostic et notre arbre décisionnel répond au manque de standardisation dans l’approche diagnostique. Une étude prospective sur notre arbre décisionnel est en voie d’acceptation au CHU Sainte-Justine.

L'évaluation systématique de la lombalgie selon les données probantes.

Les illustrations accompagnant le texte ont été dessinées par monsieur Mathieu Gagnon.

L’implication du réseau fronto-pariétal dans le raisonnement est-elle atypique chez les autistes?

Les individus autistes présentent un profil cognitif particulier. Par exemple, contrairement aux non-autistes, ils tendent à obtenir des scores plus élevés au test des Matrices progressives de Raven (RSPM) qu’aux tests de QI de Wechsler. Ils peuvent aussi résoudre les items du RSPM plus rapidement. Les mécanismes cérébraux sous-tendant cette différence sont toutefois encore peu connus. Cette étude vise à caractériser comment l’activité du réseau fronto-pariétal de raisonnement est modulée par la complexité de la tâche chez les individus autistes (AUT) en comparaison à un groupe contrôle (Non-AUT) lors d’une tâche de raisonnement fluide. Pour ce faire, nous avons ré-analysé les données d’une étude précédente, dans laquelle 15 AUT et 18 Non-AUT ont résolu les 60 problèmes du RSPM alors qu’ils se trouvaient dans un scanner IRM. Lorsque la complexité du raisonnement augmentait, nous avons observé une augmentation de l’activité dans des aires occipitales chez le groupe AUT, et dans les régions frontales et pariétales chez le groupe Non-AUT. De plus, alors que la complexité du raisonnement augmentait, la modulation de la connectivité entre les régions impliquées dans le raisonnement était moins grande chez les AUT et ces derniers montraient une implication plus ciblée des aires occipitales lors de cette modulation que les Non-AUT. La moins grande modulation du réseau impliqué dans le raisonnement pour une performance semblable suggère que les individus autistes sont moins affectés par la complexité des tâches de raisonnement non verbal. Aussi, ils dépendent plus de processus visuospatiaux pour résoudre les matrices plus complexes que les participants non-autistes. Ces résultats nous apportent une meilleure compréhension des processus cognitifs impliqués dans l’intelligence autistique et de l’influence positive du sur-fonctionnement perceptif autistique sur celle-ci.

Tests pour la dépendance entre les sections dans un modèle de Poisson

Les simulations et figures ont été réalisées avec le logiciel R.

Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.

Caractérisation et objectivation de l’acouphène subjectif chronique idiopathique

Objectif: Cette thèse avait pour objectif principal la mise en oeuvre et la validation de la faisabilité, chez l'humain, du paradigme de modulation du réflexe acoustique de sursaut par un court silence (GPIAS) afin de l'utiliser comme mesure objective de l'acouphène. Pour ce faire, trois expériences ont été réalisées. L'expérience 1 avait pour objectif de valider l'inhibition du réflexe de sursaut par un court silence chez des participants humains normo-entendants (sans acouphène) lors de la présentation d'un bruit de fond centré en hautes et en basses fréquences afin de déterminer les paramètres optimaux du paradigme. L'expérience 2 avait pour objectif de valider la précision et la fidélité d'une méthode de caractérisation psychoacoustique de l'acouphène (appariement en intensité et en fréquence). Finalement, l'expérience 3 avait pour objectif d'appliquer le paradigme d'objectivation de l'acouphène par le réflexe de sursaut à des participants atteints d'acouphènes chroniques en utilisant les techniques développées lors des expériences 1 et 2. Méthodologie : L'expérience 1 incluait 157 participants testés dans l'une des conditions de durée du court silence (5, 25, 50, 100, 200 ms) et dans l'un des deux paradigmes (court silence à l'intérieur du bruit de fond ou suivant celui-ci) à l'aide de bruits de fond en hautes et en basses fréquences. L'expérience 2 incluait deux groupes de participants avec acouphène, l'un musicien (n=16) et l'autre sans expérience musicale (n=16) ainsi qu'un groupe de simulateur sans acouphène (n=18). Ils tous ont été évalués sur leur capacité d'appariement en fréquence et en intensité de leur acouphène. Les mesures ont été reprises chez un sous-groupe de participants plusieurs semaines plus tard. L'expérience 3 incluait 15 participants avec acouphène et 17 contrôles évalués à l'aide du paradigme d'inhibition du réflexe de sursaut à l'aide d'un court silence (GPIAS). Les paramètres psychoacoustiques de l'acouphène ont également été mesurés. Toutes les mesures ont été reprises plusieurs mois plus tard chez un sous-groupe de participants. Résultats : Expérience 1 : le paradigme d'inhibition du réflexe acoustique de sursaut par un court silence est applicable chez l'humain normo-entendant. Expérience 2 : les mesures psychoacoustiques informatisées de l'acouphène incluant l'appariement en fréquence et en intensité sont des mesures précises et fidèles du percept de l'acouphène. Expérience 3 : un déficit d'inhibition au paradigme du GPIAS a été retrouvé chez le groupe de participants avec acouphène pour les bruits de fond en hautes et en basses fréquences au test et au retest. Les mesures d'appariement en fréquence ont révélé un acouphène dont la fréquence prédominante était d'environ 16 000 Hz chez la plupart des participants. Discussion : Il est possible d'appliquer le paradigme d'inhibition du réflexe acoustique de sursaut par un court silence à des participants humains atteints d'acouphène, tel qu'il est utilisé en recherche animale pour « objectiver » la présence d'acouphène. Toutefois, le déficit d'inhibition mesuré n'est pas spécifique à la fréquence de l'acouphène lorsque validé à partir des données d'appariement psychoacoustique. Nos résultats soulèvent des questions quant à l'interprétation originale du paradigme pour détecter la présence d'un acouphène chez les animaux.

L’impact des principes éthiques sur le marché d’assurance en présence de tests génétiques

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